Summary
Här beskriver vi en metod för högupplöst tid-lapse multiphoton Imaging av hjärntumör celler före och efter invasiv kirurgisk intervention (t. ex. biopsi) inom samma levande djur. Denna metod gör det möjligt att studera effekterna av dessa invasiva kirurgiska ingrepp på tumörcellernas flyttande, invasiva, och proliferativa beteende på en enda cellnivå.
Abstract
Biopsier är standard för vård av cancerbehandling och är kliniskt fördelaktigt eftersom de tillåter fast tumör diagnos, prognos, och personlig behandling bestämning. Emellertid, störning av tumör arkitektur av biopsi och andra invasiva ingrepp har förknippats med oönskade effekter på tumörprogression, som måste studeras på djupet för att ytterligare förbättra den kliniska nyttan av dessa förfaranden. Konventionella statiska metoder, som endast ger en ögonblicksbild av tumören, är begränsade i sin förmåga att avslöja effekten av biopsi på tumör cell beteende såsom migration, en process nära besläktad med tumör malignitet. I synnerhet, tumör cell migration är nyckeln i mycket aggressiva hjärntumörer, där lokala tumör spridning gör total tumörresektion praktiskt taget omöjligt. Utvecklingen av multiphoton Imaging och kroniska Imaging Windows gör det möjligt för forskare att studera denna dynamiska process i levande djur över tid. Här beskriver vi en metod för högupplöst longitudinell avbildning av hjärntumör celler före och efter en biopsi i samma levande djur. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera effekten av detta förfarande på tumör cells beteende (migration, invasion, och proliferation). Dessutom diskuterar vi fördelarna och begränsningarna med denna teknik, liksom förmågan hos denna metod att studera förändringar i cancercellens beteende för andra kirurgiska ingrepp, inklusive tumörresektion eller implantation av kemoterapi Rån.
Introduction
Standard av omsorg för de flesta solida tumörer inkluderar vävnadbiopsi för diagnos, prognos, och personlig behandling beslutsamhet1,2. Sammantaget ger dessa förfaranden klinisk nytta, men de senaste bevisen tyder på att biopsi och andra mer invasiva ingrepp, såsom tumörresektion, kan också negativt påverka tumörprogression3,4,5 , 6. även om dessa förfaranden förblir oumbärliga i vården och deras fördelar övervinner deras negativa effekter, är det nödvändigt att fullt ut förstå mekanismerna bakom dessa negativa effekter för att maximera patienternas säkerhet och positiva influenser av dessa förfaranden och göra dem ännu mer kliniskt fördelaktigt.
Biopsi-medierade oönskade effekter på tumörprogression utlöses av systemiska förändringar och förändringar i tumören mikromiljö som svar på vävnads störningar4,5. Därför är det nödvändigt att studera denna process i levande djur. De subtila konsekvenserna av dessa minimalt invasiva ingrepp kan dock ofta döljas av stora variationer mellan individer. Konventionella metoder baserade på immunohistokemi eller transkriptionella uttrycks analys kan förbise dessa effekter eller kräva ett stort antal djur för att identifiera dem. Dessutom, dessa statiska metoder saknar förmågan att identifiera förändringar i tumör cell beteende såsom migration och invasion, dynamiska processer som korrelerar med tumör malignitet. Dessa tumör cells funktioner är av särskild betydelse för mycket aggressiva hjärntumörer, såsom glioblastoma multiforme (GBM), där den lokala spridningen av tumörceller begränsar kirurgisk resektion och minskar patientens överlevnad7. För att till fullo förstå hur biopsier påverkar beteendet hos GBM-celler, behövs en longitudinell metod som möjliggör visualisering av dessa celler i fysiologiska sammanhang av levande organismer.
Den senaste utvecklingen av högupplöst intravital avbildning i kombination med kirurgiskt implanterade kroniska bildfönster tillåter forskare att studera det dynamiska beteendet hos tumörceller i levande möss över flera dagar8,9. Med hjälp av denna kraftfulla metod kan vi studera hur tumörcellernas proliferativa, flyttande och infiltrativa beteende förändras under flera dagar som svar på en biopsi i samma mus. Jämfört med andra tekniker som möjliggör flerdagsövervakning av tumörer i levande möss, såsom magnetisk resonanstomografi (MRI)10, positron emissions datortomografi/datortomografi (PET/CT)11, eller bioluminescerande Imaging12, detta tillvägagångssätt unikt erbjuder möjligheten att studera tumör cell beteende på enda cellnivå och reda ut subtila förändringar som sker inom tumören.
Här, vi beskriver en detaljerad metod för att utföra biopsi-liknande skada och pre-och postbiopsi längsgående intravital avbildning i hjärnan av tumör-bärande möss. Denna metod kan potentiellt tillämpas för att studera andra kirurgiska ingrepp, såsom partiell tumörresektion eller implantation av kemoterapi wafers.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna från djurskydds kommittén vid Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, Nederländerna. De experimentella protokollen som användes i detta manuskript godkändes av Centrale Commissie Dierproeven (CCD) och Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. tumör cell implantation och kraniala Imaging fönster beredning
- Kirurgisk beredning
- Använd vuxna möss (> 6 veckor gamla) av någon stam eller kön. Sedate en mus genom att injicera (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [opioid]) (0,4 mL/kg) + bensodiazepin lugnande medel (2 mg/kg) vid en dos av 1:1:2 i sterilt vatten. Bedöm djurets sedering tillstånd av tå nypa.
Anmärkning: i detta protokoll, både kvinnliga och manliga C57BL/6 möss användes på grund av samma genetiska bakgrund av tumör cell linjen används i dessa experiment (GL261). Musen kommer att stanna helt Sedated för 1,5 h. Alternativt, Använd inhalationsanestesi såsom isofluran (1.5% – 2% isofluran/O2 blandning). - Montera musen på en stereotaktisk ram och säkra huvudet med hjälp av en näsa klämma och två öron stänger.
- Använd en värmelampa för att bevara kroppstemperaturen. Värmelampa bör användas med försiktighet, alternativt vatten recirkulerande Värmekuddar kan användas.
- Applicera ögonsalva för att skydda musens hornhinnor från torkning.
- Använd vassa saxar för att raka pälsen på skallen (dorsala området från musens ögon till basen av dess skalle) och desinficera den exponerade huden med 70% etanol.
- Skär huden på ett cirkulärt sätt med vassa saxar och skrapa bort periostet under med en bomullspinne. Applicera en droppe lidokain 1% + epinefrin 1:100000 för 5 min, och ta bort överskottet med en bomullspinne.
- Limma kanterna på huden mot skallen med cyanoakrylatlim.
- Placera stereotaktisk ramen under en dissektion stereomikroskop med 4x förstoring.
- Visualisera skallen genom dissekera Mikroskop och borra ett cirkulärt spår av 5 mm i diameter över rätt parietalbenet. Utför detta steg noggrant och endast ytligt, undvika något tryck på skallen.
- Applicera en droppe cortex buffert (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES buffert, 2 mM MgSO4, och 2 mm CaCl2 [pH 7,4]) och lyft benet luckan med hjälp av tunna pincett.
- För följande steg, hålla hjärnans yta täckt med cortex buffert om inte annat anges.
- Under dissektion Mikroskop, visualisera hjärnans yta och ta bort dura mater med böjda, avsmalnande, mycket fin punkt pincett. Om blödning uppstår i detta skede, Använd en absorberbar gelatinsvamp för att stoppa den.
- Använd vuxna möss (> 6 veckor gamla) av någon stam eller kön. Sedate en mus genom att injicera (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [opioid]) (0,4 mL/kg) + bensodiazepin lugnande medel (2 mg/kg) vid en dos av 1:1:2 i sterilt vatten. Bedöm djurets sedering tillstånd av tå nypa.
- Tumör cells injektion
- Omsuspendera önskad mängd fluorescerande tumörceller i ~ 3 μL PBS (t. ex. för de experiment som visas i detta protokoll, 1 x 105 GL261 celler injicerades).
Obs: även om någon fluorescerande markör kan användas, en nukleär markör rekommenderas starkt, att spåra enskilda tumörceller under analys. Dessutom kan en histonlänkad fluorescerande markör, såsom H2B, användas för att visualisera kromosomkondensation och därmed övervaka celldelningen. Användningen av en foto-switchable markör, såsom Dendra2, tillåter foto-märkning och spårning av tumörceller över flera dagar4,13. - Ladda tumörcellerna i en 10 μL gastät spruta med en punktstil 2 nål och fixa det på stereotaxic manipulator armen.
- Ta bort cortex buffert. Placera spetsen på sprutan i mitten av kraniotomi och sätt in den på ett djup av 0,5 mm från ytan av skallen. Alternativt, skapa ett litet utrymme i hjärnan för att rymma tumör cellsuspensionen. För detta, sätt i sprutan upp till ett djup av 1 mm och sedan hämta den upp till 0,5 mm före injektionen.
- Applicera en droppe cortex buffert.
- Injicera långsamt cellsuspensionen med en mikrosprutpumpinjektor (250 – 400 nL/min). Ta bort sprutan och Använd en absorberbar gelatinsvamp för att stoppa eventuell blödning, om det behövs.
- Omsuspendera önskad mängd fluorescerande tumörceller i ~ 3 μL PBS (t. ex. för de experiment som visas i detta protokoll, 1 x 105 GL261 celler injicerades).
- Cranial Imaging fönster beredning
- Ta bort cortex buffert och placera en droppe silikon olja på kraniotomi plats för att undvika luftbubblor under fönstret.
- Försegla den exponerade hjärnan med en 6 mm täckslip. Applicera cyanoakrylatlim mellan täckslip och skallen. Tryck försiktigt på täckslip mot skallen med hjälp av fin pincett för att säkerställa minimalt avstånd mellan hjärnan och täckslip.
- Applicera Dental akryl cement på skallens yta, som täcker kanten av täckglas. Placera en tunn ring av rostfrittstål (1,5 mm i ytterdiameter, 1 mm i innerdiameter) runt kraniotomi och låt tand cementen torka. Du kan också lägga till lite lim på gränsen för att säkra ringen på toppen av huvudet.
Obs: Detta huvud fixeringssystem är optimalt för avbildning på ett inverterat Mikroskop: små magneter inbäddade i bildrutan underlättar fixering av kraniellt bildfönster (CIW). I de experiment som visas i detta protokoll användes ett inverterat Mikroskop. För upprätt Mikroskop, fixering kan uppnås med hjälp av en bar eller en ring med spår som kan fästas på mikroskopet med hjälp av skruvar eller en tallrik som passar ringen. - För smärt Lind rad, injicera en engångsdos av 100 μg/kg buprenorfin subkutant och låt djuret återhämta sig på en värmedyna.
- Placera musen i en enskild bur med strimlad papper för berikning. Noga övervaka musen dagligen under de första dagarna och 2x per vecka, därefter, för normalt beteende, reaktivitet, och utseende.
2. intravital avbildning
Obs: tidsintervallet mellan tumör cell injektion och den första intravitala avbildning sessionen är beroende av vilken typ av tumör cell linje som används. För de experiment som visas i detta protokoll injicerades 1x 105 GL261 celler och avbildades 10 dagar senare.
- Förberedelse av avbildning
- Sedate musen med isofluran inandning anestesi genom en ansiktsmask (1.5%-2% isofluran/O2 blandning).
- Injicera musen subkutant med 100 μL saltlösning buffert för att förhindra uttorkning.
Obs: för långsiktig avbildning kan musen hydreras genom en subkutan infusionspump. - Placera musens framsida i en bildruta. Använd en metallplåt med en 1 mm diameter hål och små magneter inbäddade runt bländaren för att ge fixering av CIW till Imaging box. Introducera isofluran genom en ansiktsmask och ventilera med ett utlopp på andra sidan av lådan (0.8%-1.5% isofluran/O2 blandning). Du kan också använda tejp för att fixa musens kropp.
Obs: Fluorescently märkt dextran för blodkärl visualisering eller andra färgämnen kan injiceras intravenöst vid denna punkt. - Alternativt kan du använda en pulsoximeter och en värmesond för att övervaka musens vitals.
Anmärkning: i detta experiment var det inte nödvändigt att använda en pulsoximeter och en värme sond eftersom musen var stabil under hela bildperioden (2 – 3 h). För längre avbildnings tider kan dock mer noggrann övervakning behövas. - Ställ in 25x (t. ex., HCX IRAPO NA 0.95 WD 2,5 mm) vatten mål till den lägsta z-position och tillsätt en stor droppe vatten.
Obs: användningen av en vatten nedsänkning Micro dispenser är mycket klokt för långsiktiga experiment eftersom det tillåter forskare att lägga till vatten under experimentet. Alternativt kan ett torrt mål användas. - Överför bildrutan till Mikroskop utrustad med en mörk klimatkammare som hålls vid 37 ° c. Ta målet till CIW täckslip tills vatten droppe vidrör den.
- Med hjälp av epifluorescensläge, Observera tumören genom okularet och föra cellerna i fokus.
- Bildhämtning vid tidsfördröjning
- Välj flera positioner av intresse för bild, och spela in deras koordinater i programvaran. Se till att de valda positionerna är representativa positioner från olika platser i tumören (varje tumör kan vara olika, men för att säkerställa konsekvens, Välj samma mängd positioner som är centrala för tumör kärnan och till kanterna över alla möss).
Anmärkning: en kakel skanning av en del av tumören eller hela synlig tumör kan utföras; men om tumören är stor, kommer denna metod att öka tidsfördröjning mellan bilder. Dessutom, om tumörcellerna rör sig snabbt, det kan vara svårt att spåra samma celler över tiden. - Växla till multiphoton-läge och finjustera lasern till rätt våglängd. Observera att, för att undvika foto skador, högre våglängder önskas.
Anmärkning: för Dendra2 Imaging, en 960 nm våglängd användes. Med målet som används i dessa experiment, en zoom på 1,3 var tillräckligt för att få en bra upplösning av tumör kärnor och skanna ett representativt område av tumören. - Gå till Live-läge och definiera en z-stack för varje position för att förvärva maximal volym av tumörceller utan att kompromissa med tumörens cell upplösning. Definiera stegstorleken mellan bilderna som 3 μm.
- Använd det dubbelriktade läget för att öka skanningshastigheten. Bildupplösningen bör vara minst 512 x 512 pixlar.
- Förvärva bilder av tumör volym vid olika positioner var 20 min för 2 h. Tillsätt vatten till målet före varje bild förvärv.
Tids fördröjnings bilder kan förvärvas automatiskt genom att ställa in rätt tidsfördröjning i programvaran. Men kan musen flytta, och positionen eller z-stacken kan skifta med tiden, vilket leder till dataförlust. Därför rekommenderas att utföra tidsförlopp manuellt och att kontrollera och justera för XYZ -skiften mellan förvärv. - Vid detta steg, alternativt, Foto-switch Dendra2 fluorescerande markör.
Obs: i motsats till Time-lapse Imaging (som gör det möjligt att studera enskilda tumörceller egenskaper och hur de förändras över tid), detta kommer att möjliggöra studier av området tumör cell infiltration i hjärnan under flera dagar4. En detaljerad förklaring av detta steg beskrivs av Gligorijevic et al.13. - När den sista bilden har förvärvats, ta bort musen från scenen och låt den återhämta sig på en värmedyna. För att förhindra uttorkning kan 100 μL saltlösning ges subkutant. Placera musen i sin bur tills biopsi-liknande skada utförs.
- Välj flera positioner av intresse för bild, och spela in deras koordinater i programvaran. Se till att de valda positionerna är representativa positioner från olika platser i tumören (varje tumör kan vara olika, men för att säkerställa konsekvens, Välj samma mängd positioner som är centrala för tumör kärnan och till kanterna över alla möss).
3. biopsi-liknande skada och CIW ersättare
- Skapa en biopsi-liknande skada på tumören platsen 1 dag efter den första bildsessionen.
ANMÄRKNINGAR: Alternativt kan en annan procedur, som partiell tumör avlägsnande, utföras.- Sedate musen med isofluran inhalationsanestesi som tidigare beskrivits i steg 2.1.1.
Obs: även injicerbara anestesi kan användas, detta förfarande är kortare än CIW implantation, och inandning anestesi gör det möjligt att exakt kontrollera och att minska tiden musen förblir Sedated. - Placera musen på en stereotaxic ram och säkra huvudet med två öron stänger och en näsa klämma. Kontrollera djupet av anestesi av avsaknaden av pedal reflexer. Använd en anestesi mask för stereotaxic kirurgi för att hålla musen Sedated under förfarandet.
- Blötlägg en bomullstuss i aceton och fördela den runt kanten av täckslip för att mjukgöra limmet som håller täckslip mot hjärnan.
- Skjut tunna spetstång under täckglaset för att lyfta den. Om täckglasets raster vid denna punkt, Använd tång för att ta bort bitar av glas.
- Applicera cortex buffert för att hålla hjärnan fuktig.
- Doppa en 25 G nål i tumören till ett djup av 1 mm. ta bort nålen och stoppa blödningen, om nödvändigt, genom att tillämpa en gelatinsteril svamp.
Obs: detta steg kan utföras under en lysrör stereomikroskop för att mer exakt identifiera tumör området (om tumören är för liten). Dessutom kan en 1 μL lösning av fluorescerande polystyren 1 μm pärlor injiceras under punkteringen för att identifiera det biopsierade området. - Försegla hjärn ytan med silikon olja och limma en 6 mm täckslip på toppen.
- Sedate musen med isofluran inhalationsanestesi som tidigare beskrivits i steg 2.1.1.
4. upprepad avbildning
- En dag efter tillfogar biopsi-liknande skada (och på varandra följande dagar om det behövs), upprepa intravital avbildning som beskrivs i steg 2 ovan för att bedöma hur tumörcellens beteende förändras över tiden. Välj flera positioner av tumören som skulle vara representativa för hela tumör området.
Anmärkning: om fluorescerande pärlor användes för att identifiera det biopsier området, lokalisera dem till bild tumör cell beteende i de biopsier regionerna jämfört med icke-biopsier regioner.
5. bildanalys
- Om tids fördröjnings bilderna förvärvades manuellt, ska du kombinera dem till en mapp.
- Öppna Time-lapse LIF-filen i den kommersiella programvaran i samband med mikroskopet (t. ex. LasX eller LAS AF). Välj fliken process ≫ process verktyg > sammanfoga. Välj den första bilden av tidssekvensen och klicka först. Välj den andra bilden av tidssekvensen och klicka på andra. I sammanfoga dimensionerväljer du t för tid. Klicka på Verkställ. En ny fil med två tidspunkter kommer att genereras. Upprepa den här processen för alla tidspunkter med den nyligen genererade filen som den första avbildningen av sekvensen.
- Korrigera de förvärvade z-stackarna för alla XYZ -SKIFT.
Anmärkning: för de experiment som beskrivs i detta protokoll, ett specialdesignat Visual Basic-program användes för korrigering. Alternativt, annan tillgänglig mjukvaran kanna bli brukat, sådan som ImageJ eller Imaris.- Exportera TIFF-filerna från programvaran genom att högerklicka på den sammanslagna tids fördröjnings filen. Välj Spara rå data. De exporterade filerna kommer att exporteras till en mapp som heter enligt kanal, tid och z-position.
- Öppna TIFF-filerna i det specialdesignade Visual Basic-programmet.
- Definiera antalet tidspunkter, z-stackar och kanaler.
- Tilldela varje kanal en färg efter utseende.
- I formuläret Visa panelen, för varje timepoint, korrigera skiftet i z genom att klicka på upp (U) eller ner (D) knappar.
- I den Intravital bild byggnads panelen väljer du den kanal som ska användas för att korrigera för XY -skiftet. Välj den gröna kanalen för att korrigera, baserat på signalen från tumörcellerna. Klicka på Automatisk för XY -korrigering.
- Exportera de korrigerade bilderna som en maximal projektion av tre på varandra följande z-stackar. I panel urvaletintroducerar du numren på de första (BEGIN) och de sista () z-skivorna som ska exporteras. Välj Max. Välj separata mappar för Z. Klicka på gör. För var och en av dem kommer tre z-stackar, tids fördröjnings bilder att exporteras till en separat mapp.
- Alternativt, korrekt för vävnaden elastisk deformation.
Anmärkning: för vävnad elastisk deformation experiment, en match rörelse ersättning programvara användes för att korrigera för stel och elastisk vävnad deformation14. - Spåra enstaka celler i den kompletta z-stacken i tids fördröjnings filmen.
Obs: tumörceller kan spåras manuellt med, till exempel, en ImageJ plugin (MTrackJ). Medan korrekt, är detta begränsat till XY planet och är mycket tidskrävande. Alternativt kan tumörceller spåras automatiskt genom hela z-volym, med hjälp av tumör cell segmentering (t. ex., imaris programvara). Men i mycket täta tumörer, automatiserad spårning är mindre exakt och kan ge upphov till fler spårnings fel.- Öppna och spåra varje tids fördröjnings serie (för tre på varandra följande z-stackar) separat. Dra mappen med tids fördröjnings bilderna till ImageJ.
- Välj fliken Plugins > spårning > mtrackj. Spåra varje enskild cell genom att välja Lägg till och klicka på varje cell vid varje tidpunkt.
- Extrahera måttet på spåren genom att klicka på mäta och spara filen.
Representative Results
För att bedöma effekterna av biopsi på hjärntumör cell beteende, vi utfört det förfarande som beskrivs i detta protokoll. Glioma — GL261 celler — att uttrycka ett nukleärt fluorescerande protein (H2B-Dendra2) injicerades i hjärnan hos C57BL/6 möss, och en kronisk CIW implanterades. Time-lapse intravital avbildning utfördes på samma djur före och efter biopsi-liknande skada på tumören (figur 1a, B). Migrationen av enskilda tumörceller bestämdes genom att spåra migrations vägen över tid i olika XY -plan i z-stacken (figur 1c) och plottas som en procentandel av flytt celler före och postbiopsi (figur 1f). Tumörcellernas spridnings frekvens kvantifierades baserat på H2B-märkta Dendra2 kondensation på Mitos (figur 1d) och plottas som en procentandel av dividera celler före och postbiopsi (figur 1e). Vi jämförde fördelningen av migrations hastigheten före och efter biopsi i samma tumör och fann att antalet flytt celler (hastighet > 4 μm/h) ökade efter ingreppet, med en associerad minskning av antalet långsamma/icke-flyttande celler ( hastighet < 4 μm/h) (figur 2A). I genomsnitt per tumör, observerade vi en 1,75 (SD = 0,16)-faldig ökning av andelen flytt celler när en biopsi-liknande skada utfördes, jämfört med kontroll möss som inte var biopsier (figur 2b). Vi övervakade tumör cells beteende för en vecka och fann att även om andelen flyttande tumörceller så småningom minskade i både kontroll och biopsier möss, den biopsier möss uppvisade fortfarande en högre migrations kapacitet än kontroll möss ( Figur 2C). Analysen av tumör cell proliferativt beteende över tiden visade en 1,52 (SD = 0,26)-faldig ökning av antalet mitotiska händelser vid biopsi, i förhållande till icke-biopsied kontroll möss (figur 2D).
För att testa om de observerade effekterna av biopsi på tumör cell proliferativ och migrations beteende var en artefakt på grund av CIW ersättare kirurgi (krävs för att utföra en biopsi-liknande skada), vi övervakade tumör cells beteende i en grupp möss som genomgick CIW ersättning utan en biopsi. I denna grupp, vi har inte observerat någon induktion av migration eller spridning av tumörceller, vilket tyder på att uppsving i tumör cell spridning och migration priser specifikt utlöstes av biopsi-liknande skada (figur 3a, B).
Stabil foto-konvertibilitet av fluorescerande protein Dendra2 gör det möjligt att studera tumör cell infiltration under flera dagar. Vid exponering för ultraviolett/blått ljus, Dendra2 är oåterkalleligt bytte från grönt till rött. Använda denna fastighet, en kvadrat region av tumören var upplyst och ~ 200 Dendra2-uttrycker tumörceller var foto-märkta före biopsi (figur 4). En dag efter biopsi, omlokaliserade vi foto-bytte region och mätt volymen av tumörceller som hade infiltrerat i den omgivande tumör vävnad. Vi fann att infiltrations området var 1,72 (SD = 0,41) gånger större i tumörer efter en biopsi-liknande skada jämfört med nonbiopsied kontroll tumörer (figur 4). Även om detta tillvägagångssätt endast ger information om tumör cell bulk infiltrativt beteende och inte på en enda cellnivå, är det mindre tidskrävande än tidsförlopp Imaging tillvägagångssätt och kan vara den metod för val av forskningsfrågor som uteslutande inriktas på att studera infiltrativt beteende.
Figur 1: experimentell inställning för longitudinell intravital avbildning av biopsieffekten på tumör cells beteende. (A) diagram som visar ringen och magnet hållarens design. Bschematisk representation av försöks arbetsflödet. Tumörceller injiceras i hjärnan hos möss och en CIW är etablerad. Vid tumörutveckling, en första (prebiopsi) time-lapse Imaging session utförs. Nästa dag, biopsi och CIW ersättare genomförs. Dagen efter avbildning (postbiopsi) utförs en andra fotografering med tidsförlopp. För långtidseffekter kan efterföljande bildsessioner göras. (C) bilder visar representativa ögonblicksbilder av en time-lapse film där GL261 H2B-Dendra2 tumörceller spårades. Röda linjer skildrar enskilda tumör cell spår. Skalstapeln = 50 μm. (D) representativa in vivo tidsförlopp bilder som visar dividera celler i GL261 H2B-Dendra2 tumörer. Olika stadier av Mitosen indikeras: profas (P), av (PM), metafase (M), Anaphasen (a), och Telophasen (T). Skalstapeln = 50 μm. grafer anger procentandelen av (E) flyttfåglar och (F) dividera celler före och postbiopsi. Varje punkt anger andelen flytt celler i alla positioner som mäts i ett enskilt djur. Uppgifterna visas som medelvärdet ± S.E.M. av sex möss (* *P < 0,01, Parade t-test). Denna siffra har modifierats från alieva et al.4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat som visar effekterna av biopsi på tumör cell migration och spridning priser. A) vattenfallsdiagram som visar förändringen av cell hastighets fördelningen i förhållande till basal migration hos enskilda möss. Uppgifterna visas som medelvärdet ± S.E.M. av fem möss. (B) antalet flyttande celler i kontroll (blå) och biopsier (röda) djur normaliserade till antalet flytt celler preintervention (n = 6 möss, * * *P < 0,0001, Students t-test). (C) tumör cells beteende spårades under flera dagar. Visat är det normaliserade (i förhållande till preintervention) antalet flytt celler i enskilda möss över tiden (n > 4 möss per tillstånd, * * *P < 0,0001, tvåvägsanova). Ddet normaliserade antalet skiljande celler i kontroll (blått) och biopsierade (röda) djur. Per enskilt djur normaliserades värdena efter intervention till värdena preintervention (n = 5 möss, * *P < 0,01, Students t-test). Denna siffra har modifierats från alieva et al.4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CIW-ersättning har ingen effekt på tumör cells beteende. Longitudinell intravital avbildning visar att utbytet av CIW utan biopsi har ingen effekt på migration och spridnings frekvenser. Aökning av antalet flytt celler för de angivna förhållandena. Varje symbol representerar medelvärdet av en enskild mus och n≥ 4 möss. B) ökningen av antalet prolifererande celler för de angivna förhållandena. Varje symbol representerar medelvärdet av en enskild mus (n≥ 4 möss, * *P < 0,01, * * *P < 0,001, ns = icke-signifikanta, enkelriktad ANOVA med Newman-Keuls post hoc-test). Denna siffra har modifierats från alieva et al.4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: diagram som visar experimentella inställningar och representativa resultat som erhållits med Dendra2 foto växling. För att övervaka tumör cell infiltration vid biopsi, Dendra2-uttrycker tumörceller är fotoväxlad i en kvadrat region med UV/blått ljus belysning och avbildas, 1 dag före biopsi. En dag efter biopsi, är den foto-växlade regionen omlokaliserade och reimaged. Visas är representativa Dendra2 bilder av tumör cell infiltration, korrigeras med hjälp av kanal subtraktion. Den vita prickade linjen representerar infiltrations området. Skalstapeln = 50 μm. Grafen visar den ökade foto-switchade området plottas för biopsier (röd) och kontroll (blå) möss. Varje punkt representerar medelvärdet av en individuell mus (n≥ 5 möss, *P < 0,05, Students t-test). Denna siffra har modifierats från alieva et al.4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här beskriver vi en metod för att studera förändringar i tumör cells beteende på enstaka cellnivå som svar på invasiva kirurgiska ingrepp, såsom en biopsi, i hjärnan hos ett levande djur. Kombinationen av längsgående multiphoton Imaging med kirurgisk implantation av en kronisk CIW möjliggör kvantifiering av tumör cell migration, invasion, och proliferation före och efter biopsi i samma djur4. Jämfört med andra metoder som används för tumör Flerdagsaktivitet övervakning, såsom bioluminescerande Imaging12, MRI10, eller PET/CT11, denna metod visualiserar unikt tumörer på en enda cellnivå och därmed ger insikt i cellulära beteende underliggande tumörprogression.
För att kunna utföra den här metoden bör flera procedurer bemästras. De mest kritiska stegen i detta protokoll är CIW implantation och utbyte. Den tekniska komplexiteten i dessa steg kräver precision och kirurgiska färdigheter som kan förvärvas med stadig träning. Komplikationer under CIW kirurgi, såsom blödning som kan täcka hjärnans yta, kan vara utmanande för efterföljande avbildning. En brist på sterila verktyg eller miljö, samt underlåtenhet att helt täta hjärnans yta, kan orsaka en infektion på hjärnans yta (vit vätska under täckslip), vilket kommer att göra Imaging problematiska och starkt äventyra den resulterande Tolkning. En annan vanlig fråga i detta protokoll är djurens rörelse under tidsfördröjning Imaging. Alla XYZ -SKIFT kan korrigeras efter experimentet, men vi rekommenderar att du korrigerar koordinaten för varje position före varje tidspunkt för att förhindra förlust av information. Vävnads deformation är ett ytterligare problem som finns vid avbildning på ett inverterat Mikroskop. Hjärnvävnad lider av kompression när musen är placerad i liggande läge. Beroende på graden av vävnad deformation, tumör cell spårning kan leda till en felaktig kvantifiering av cell förskjutning. För att förhindra detta kan en programvara för stel och elastisk deformation användas14.
Även om detta förfarande erbjuder en bred ansökan för att studera förändringar i tumör beteende, vissa begränsningar bör övervägas. Denna metod gör det möjligt för forskare att bilden upp till ett djup av 1,6 mm (med användning av en optisk parametrisk oscillator); Detta innebär dock att Imaging är begränsad till ytliga hjärnbarken områden15. Sålunda, vissa hjärntumörer ligger i djupa hjärnstrukturer, inklusive diffus inneboende Pontine gliom ligger i hjärnstammen regionen, kan inte studeras i sin ursprungliga hjärn miljö med detta protokoll. En annan begränsning av detta protokoll är den volym av tumören som kan avbildas. Även om total tumör volym skanning önskas för att få maximal information, ofta, tumörstorlek och hastigheten på flytt celler kan vara begränsande faktorer. För varje tumörtyp måste en optimal tidsfördröjning för avbildning beaktas. Om tidsramen mellan bilderna är för lång kan det vara svårt att spåra tumörcellerna. Användningen av en resonant scanner kan kraftigt minska skanningstiden, vilket gör att Imaging av en större tumör16. Slutligen kan den manuella bildanalysen av detta protokoll vara mycket tidskrävande, så i stället kan program för automatiserad 3D-spårning användas. Dock bör resultatet av spårning alltid vara visuellt övervakas eftersom algoritmer för automatiserad cell spårning sällan är utformade för att recapitulate exakt migrering av cellerna av intresse.
Smärre anpassningar av det protokoll som beskrivs här kan möjliggöra ett ännu bredare spektrum av tillämpningar. Istället för att utföra biopsier, andra (kirurgiska) interventioner kan genomföras, såsom partiell tumörresektion eller leverans av kemoterapi wafers. Tillsats av föreningar genom ett kirurgiskt implanterat mikrorör kan kombineras med detta protokoll för att farmakologiskt rikta specifika molekyler av intresse. Vi förväntar oss att denna modell kommer att vara användbar i studier som syftar till att analysera effekterna av en viss intervention på tumör cells beteende. Möjligheten att utföra upprepade åtgärder i samma djur ger inte bara mer exakta uppgifter om förändringar som sker i tumören, men också kraftigt minskar antalet försöksdjur som behövs per studie.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar ANKO de Graaff och Hubrecht Imaging Center för deras avbildning stöd och Ellen Wehrens och Hannah Johnson för korrekturläsning och redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
