Summary
Burada, aynı yaşam hayvanında invazif cerrahi müdahalenin (örn. biyopsi) önce ve sonra beyin tümörü hücrelerinin yüksek çözünürlüklü zaman aşımı multifoton görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, bu invaziv cerrahi prosedürlerin tümör hücrelerinin migrasyon, invazif ve proliferatif davranışlarının tek bir hücre seviyesinde etkisini inceleyerek sağlar.
Abstract
Biyopsiler kanser tedavisi için standart bakım ve katı tümör tanısı, prognoz ve kişiselleştirilmiş tedavi belirlenmesi izin olarak klinik olarak yararlıdır. Ancak, tümör mimarisinin biyopsi ve diğer invaziv prosedürlere karşı bozulması, bu prosedürlerin klinik avantajını daha da iyileştirmek için derinlemesine incelenmesi gereken tümör ilerlemesi üzerinde istenmeyen etkilere bağlı olmuştur. Sadece tümörün anlık görüntüsünü sağlayan konvansiyonel statik yaklaşımlar, biyopsi işleminin göç, tümör malignite ile yakından ilgili bir süreç gibi tümör hücresi davranışlarına etkisini ortaya çıkarabilme kabiliyetinde sınırlıdır. Özellikle, tümör hücresi göçü, yerel tümör yayılması toplam tümör rezeksiyonu neredeyse imkansız kılan son derece agresif beyin tümörlerinin anahtarıdır. Multifoton görüntüleme ve kronik görüntüleme pencerelerin gelişimi, bilim adamlarının zaman içinde yaşayan hayvanlarda bu dinamik süreci incelemelerini sağlar. Burada, aynı canlıların biyopsi öncesi ve sonrası beyin tümörü hücrelerinin yüksek çözünürlüklü uzunlamasına görüntülenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, bu prosedürün tümör hücresi davranışıyla (göç, invazyon ve proliferasyon) etkisini incelemek mümkün kılar. Ayrıca, bu tekniğin avantajları ve sınırlamalarının yanı sıra, bu metodolojinin, tümör rezeksiyonu veya kemoterapi implantasyonu da dahil olmak üzere diğer cerrahi girişimler için kanser hücresi davranışındaki değişiklikleri incelemek için yeteneğini tartışıyoruz Gofret.
Introduction
Çoğu katı tümör için bakım standardı tanı için doku biyopsisi, prognoz ve kişiselleştirilmiş tedavi belirlenmesi1,2içerir. Genel olarak, bu prosedürler klinik fayda verir, ancak son kanıtlar, biyopsi ve tümör rezeksiyon gibi diğer daha invaziv prosedürlerin de tümör ilerlemesini olumsuz etkileyebilecek olduğunu gösterir3,4,5 , 6. bu prosedürler hasta bakımında vazgeçilmez kalırken ve yararları olumsuz etkilerinin üstesinden gelirken, hastaların güvenliğini en üst düzeye çıkarmak için bu olumsuz etkilerin arkasındaki mekanizmaları tam anlamıyla anlamak gerekir Bu prosedürlerin olumlu etkileri ve onları daha klinik olarak yararlı hale getirmek.
Tümör progresyonunda biyopsi-aracılı istenmeyen efektler, doku bozulması4,5' e tepki olarak tümör mikroortamındaki sistemik değişiklikler ve değişiklikler ile tetiklenir. Böylece, canlı hayvanlarda bu süreci incelemek gerekir. Ancak bu minimal invaziv prosedürlerin ince sonuçları genellikle bireyler arasındaki büyük farklılıklar ile gizlenmiş olabilir. İmmünohistokimya veya transkripsiyonel ifade analizine dayanan konvansiyonel yöntemler bu etkilere göz ardı edebilir ya da çok sayıda hayvanın onları tanımasını gerektirebilir. Dahası, bu statik yaklaşımlar, geçiş ve invazyon, tümör malignite ile ilişkilendiren dinamik süreçler gibi tümör hücresi davranışındaki değişiklikleri belirleme yeteneğinden yoksun. Bu tümör hücresi özellikleri, tümör hücrelerinin yerel olarak yayılmasının cerrahi rezeksiyonu sınırlayan ve hasta hayatta kalma7' sini azaltan glioblastoma multiforme (GBM) gibi son derece agresif beyin tümörlerinde özellikle önemlidir. Biopsilerin GBM hücrelerinin davranışını nasıl etkilediğini tam olarak anlamak için, bu hücrelerin fizyolojik bağlamda canlı organizmaların görselleştirilmesine olanak sağlayan uzunlamasına bir yaklaşım gereklidir.
Cerrahi olarak implante edilen kronik görüntüleme pencereleri ile birlikte yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemenin son gelişimi, bilim adamlarının birden fazla gün içinde yaşayan farelerde tümör hücrelerinin dinamik davranışını incelemelerine izin verir8,9. Bu güçlü yaklaşımı kullanarak, aynı fare içinde biyopsi yanıt olarak birkaç gün içinde tümör hücrelerinin proliferatif, göç ve infiltratif davranış değişiklikleri nasıl çalışabiliriz. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG)10, Pozitron Emisyon Tomografi/Bilgisayarlı TOMOGRAFI (PET/CT)11veya Bioluminesans görüntüleme12gibi canlı farelerde tümörlerin çok günlük izlenmesine izin veren diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım benzersiz tek hücreli düzeyde tümör hücre davranışını incelemek ve tümör içinde meydana gelen ince değişiklikler çözülme olasılığını sunar.
Burada, tümör taşıyan farelerin beyinde biyopsi benzeri yaralanma ve ön ve postbiopsi uzunlamasına intravital görüntüleme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, kısmi Tümör rezeksiyonu veya kemoterapi waferinin implantasyonu gibi diğer cerrahi girişimler için uygulanabilir.
Protocol
Tüm deneyler Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilimler Akademisi hayvan refah Komitesi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Bu yazıda kullanılan deneysel protokoller Centrale Commissie Dierproeven (CCD) ve örnek voor Dierenwelzijn (IVD) tarafından onaylanmıştır.
1. tümör hücre implantasyonu ve kranial görüntüleme pencere hazırlama
- Cerrahi preparat
- Herhangi bir gerginlik veya cinsiyet yetişkin fareler (> 6 hafta) kullanın. Enjekte ederek bir fareyi sedate (fluanison [neuroleptic] + fentanil [opioid]) (0,4 ml/kg) + benzodiazepin sedatif (2 mg/kg) bir dozda 1:1:2 steril suda. Hayvan sedasyon durumunu ayak tutam ile değerlendir.
Not: Bu protokolde, bu deneylerde kullanılan tümör hücresi hattının aynı genetik arka planı nedeniyle hem kadın hem de erkek C57BL/6 fareler kullanılmıştır (GL261). Fare tam 1,5 için sakinleştirici kalacak h. alternatif olarak, Isoflurane (% 1,5 – 2% Isoflurane/O2 karışımı) gibi İnhalasyon anestezisi kullanın. - Fareyi stereotaktik çerçevede bağlayın ve burun kelepçesi ve iki kulak çubuğu kullanarak kafasını sabitleyin.
- Vücut sıcaklığını korumak için bir Isıtma lambası kullanın. Isıtma lambası dikkatli kullanılmalıdır, alternatif olarak su sirkülasyon Isıtma pedleri de kullanılabilir.
- Farenizin korneasını kurutmadan korumak için göz merhem uygulayın.
- Kafatası üzerinde kürk tıraş için keskin makas kullanın (kafatasının tabanına fare gözleri dorsal alan) ve% 70 etanol ile maruz deri dezenfekte.
- Keskin makas ile dairesel bir şekilde cilt kesim ve bir pamuk çubukla altında periost uzağa kazımak. 5 dakika boyunca lidokain 1% + epinefrin 1:100000 bir damla uygulayın ve bir pamuk çubuk ile aşırı çıkarın.
- Siyoakrilat tutkal ile kafatasına cildin kenarları tutkal.
- Stereotaktik çerçeveyi, 4X büyütme ile bir diseksiyon stereo mikroskop altında yerleştirin.
- Kafatası Diseksiyon mikroskobu ile görselleştirin ve sağ parietal kemik üzerinde 5 mm çapında dairesel bir oluk matkap. Bu adımı dikkatle ve sadece yüzeysel olarak gerçekleştirin, kafatasındaki herhangi bir baskıyı önleme.
- Bir damla korteks tampon uygulayın (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glikoz, 10 mM HEPES tampon, 2 mM MgSO4, ve 2 mm CAcl2 [pH 7,4]) ve ince Forceps kullanarak kemik flep kaldırın.
- Aşağıdaki adımlar için, aksi belirtilmediği sürece beyin yüzeyini korteks tampon ile kaplı tutun.
- Diseksiyon mikroskop altında, beyin yüzeyini görselleştirin ve eğri, konik, çok ince nokta Cımbız kullanarak Dura mater çıkarın. Bu aşamada kanama oluşursa, onu durdurmak için absorblenebilir Jelatin sünger kullanın.
- Herhangi bir gerginlik veya cinsiyet yetişkin fareler (> 6 hafta) kullanın. Enjekte ederek bir fareyi sedate (fluanison [neuroleptic] + fentanil [opioid]) (0,4 ml/kg) + benzodiazepin sedatif (2 mg/kg) bir dozda 1:1:2 steril suda. Hayvan sedasyon durumunu ayak tutam ile değerlendir.
- Tümör hücre enjeksiyonu
- İstenen miktarda floresan tümör hücrelerinin resuspend ~ 3 μL PBS (örn., bu protokolde gösterilen deneyler için, 1 x 105 GL261 hücreler enjekte edildi).
Not: herhangi bir floresan Marker kullanılabilir Iken, bir nükleer Marker şiddetle tavsiye edilir, analiz sırasında bireysel tümör hücrelerini izlemek için. Ayrıca, H2B gibi histon bağlantılı bir floresan Marker, kromozom yoğunlaşma görselleştirmek ve böylece, hücre bölünmesi izlemek için kullanılabilir. Dendra2 gibi bir fotoğraf değiştirilebilir Marker kullanımı, fotoğraf işaretleme ve birkaç gün içinde tümör hücrelerinin izlenmesi sağlar4,13. - Tümör hücrelerini 10 μL gaz geçirmez bir şırıngaya bir nokta tarzı 2 iğne ile yükleyin ve stereotaktik manipülatör kolunda düzeltin.
- Korteks tamponunu çıkarın. Şırınga ucunu kraniyotominin ortasına yerleştirin ve kafatası yüzeyinden 0,5 mm derinliğine takın. İsteğe bağlı olarak, tümör hücresi süspansiyon karşılamak için beyin küçük bir boşluk oluşturun. Bunun için şırıngayı 1 mm derinliğine yerleştirin ve enjeksiyon işleminden önce 0,5 mm 'ye kadar alın.
- Bir damla korteks tampon uygulayın.
- Hücre süspansiyonunu mikro şırınga pompası enjektörü (250 – 400 nL/dak) kullanarak yavaşça enjekte eder. Şırıngayı çıkarın ve gerekirse herhangi bir kanama durdurmak için absorblenebilir Jelatin sünger kullanın.
- İstenen miktarda floresan tümör hücrelerinin resuspend ~ 3 μL PBS (örn., bu protokolde gösterilen deneyler için, 1 x 105 GL261 hücreler enjekte edildi).
- Kranial görüntüleme penceresi hazırlama
- Korteks tamponu çıkarın ve pencerenin altındaki hava kabarcıklarını önlemek için kraniyotomi sitesine bir damla silikon yağ yerleştirin.
- 6 mm 'lik coverslip ile maruz kalan beyni mühürleyin. Lamel magazini ve kafatası arasında siyanoakrilat tutkal uygulayın. Beyin ve lamel magazini arasında minimal mesafe sağlamak için ince cımbız yardımıyla kafatasına karşı kapak hafifçe bastırın.
- Diş akrilik çimento kafatası yüzeyinde, coverslip kenarı kapsayan uygulayın. Kraniyotominin etrafında ince bir paslanmaz çelik halka (1,5 mm dış çapta, 1 mm iç çapta) yerleştirin ve diş çimentosunun kurumasına izin verin. İsteğe bağlı olarak, başının üstünde yüzük güvenliğini sağlamak için kenarlık bazı tutkal ekleyin.
Not: Bu kafa sabitleme sistemi ters bir mikroskop üzerinde görüntüleme için idealdir: görüntüleme kutusuna gömülü küçük mıknatıslar kranial görüntüleme penceresi (CIW) fikterasyonu kolaylaştırır. Bu protokolde gösterilen deneylerde ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldı. Dik mikroskoplar için, sabitleme, vida yardımıyla veya halka uyan bir plaka ile mikroskop bağlı olabilir bir çubuk veya bir yüzük yoluyla elde edilebilir. - Ağrı yönetimi için, tek bir doz 100 μg/kg buprenorfik subkutan enjekte ve hayvanın bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarmak için izin.
- Zenginleştirme için kırpılmış kağıt ile tek bir kafes içinde fareyi yerleştirin. Yakından ilk birkaç gün için günlük ve 2x haftada, sonra, normal davranış, reaktivite ve görünüm için fareyi izleyin.
2. intravital görüntüleme
Not: tümör hücre enjeksiyonu ile ilk intravital görüntüleme oturumu arasındaki zaman aralığı, kullanılan tümör hücrelerinin tipine bağlıdır. Bu protokolde gösterilen deneyler için 1x 105 GL261 hücreler enjekte edilmiş ve 10 gün sonra görüntülenmiş.
- Görüntüleme hazırlığı
- Bir yüz maskesi (% 1,5-2% Isoflurane/O2 karışımı) ile Isoflurane inhalasyon anestezi kullanarak fareyi sedate.
- Su kaybı önlemek için 100 μL tuz tamponu ile subkutan fare enjekte.
Not: uzun süreli görüntüleme Için, fare bir subkutan infüzyon pompası ile nemlendirici olabilir. - Fare yüzünü bir görüntüleme kutusuna yerleştirin. CIW görüntüleme kutusuna sabitleme sağlamak için diyafram etrafında gömülü 1 mm çapında delik ve Küçük mıknatıslar ile bir metal plaka kullanın. Bir yüz maskesi ile Isoflurane tanıtmak ve kutunun diğer tarafında bir çıkış ile havalandırmak (0.8%-1,5% Isoflurane/O2 karışımı). İsteğe bağlı olarak, fare gövdesini düzeltmek için teyp kullanın.
Not: kan damar görselleştirme veya diğer boyalar için floresan etiketli dekstran bu noktada intravenöz enjekte edilebilir. - İsteğe bağlı olarak, Mouse 'un hayati değerlerini izlemek için bir Pulse oksimetre ve bir Isıtma sondası kullanın.
Not: Bu deneyde, fare görüntüleme süresi boyunca kararlı olduğundan bir nabız oksimetresi ve bir Isıtma sondası kullanmak gerekli değildi (2 – 3 h). Ancak, daha uzun görüntüleme süreleri için daha kapsamlı izleme gerekebilir. - 25x (örn., HCX ıRAPO NA 0.95 WD 2,5 mm) su hedefini en düşük zkonumuna ayarlayın ve büyük bir damla su ekleyin.
Not: bir su daldırma mikro dispenseri kullanımı son derece uzun vadeli deneyler için tavsiye edilir beri bilim adamları deneme sırasında su eklemek için izin verir. Alternatif olarak, Kuru bir amaç da kullanılabilir. - Görüntüleme kutusunu, 37 °C ' de tutulan karanlık bir iklim odası ile donatılmış mikroskop üzerine aktarın. Su damlası dokunana kadar hedefi CIW lamel magazini 'a getirin.
- Epifluorescence modunu kullanarak, tümör göz merceği ile gözlemlemek ve hücreleri odaklanmaya getirin.
- Zaman aşımı görüntü edinme
- Görüntünün ilgi alanı çeşitli konumlarını seçin ve yazılım koordinatlarını kaydedin. Seçilen pozisyonların tümörün farklı sitelerinden temsili pozisyonlar olduğundan emin olun (her tümör farklı olabilir, ancak tutarlılığı sağlamak için, tümörün çekirdeğine ve tüm farelerde kenarlara merkezi olan pozisyonların aynı miktarını seçin).
Not: tümör veya tüm görünür tümör bir parçası bir kiremit tarama yapılabilir; Ancak, tümör büyükse, bu yöntem görüntüler arasında zaman aşımı artışı olacaktır. Buna ek olarak, tümör hücreleri hızlı hareket ederse, zaman içinde aynı hücreleri izlemek zor olabilir. - Multifoton moduna geçin ve lazeri doğru dalga boyunda ayarlayın. Photodam önlemek için, daha yüksek dalga boyu istendiği dikkat edin.
Not: Dendra2 görüntüleme Için 960 nm dalga boyu kullanılmıştır. Bu deneylerde kullanılan amaç ile, 1,3 bir yakınlaştırma tümör çekirdeğinin iyi bir çözünürlüğü almak ve tümör temsili bir alanı taramak için yeterli oldu. - Canlı moduna gidin ve tümör hücresi çözünürlüğü ödün vermeden tümör hücrelerinin maksimal hacmi elde etmek için her pozisyon için bir z-yığını tanımlayın. Görüntü arasındaki adım boyutunu 3 μm olarak tanımlayın.
- Tarama hızını artırmak için çift yönlü modu kullanın. Görüntü çözünürlüğü en az 512 x 512 piksel olmalıdır.
- Farklı konumlarda her 20 dakikada bir tümör hacminin görüntülerini elde 2 h. her görüntü satın almadan önce hedefe su ekleyin.
Not: zaman atlamalı görüntüler otomatik olarak yazılım doğru zaman atlamalı ayarlayarak elde edilebilir. Ancak, fare taşıyabilirsiniz ve konum veya z-yığını zaman içinde geçiş yapabilir, veri kaybına neden. Bu nedenle, zaman aşımı el ile gerçekleştirmek için ve kontrol etmek için tavsiye edilir ve xyz vardiyaları arasında satın alma için ayarlayın. - Bu adımda, isteğe bağlı olarak, fotoğraf geçiş Dendra2 floresan Marker.
Not: zaman atlamalı görüntüleme aksine (hangi bireysel tümör hücreleri özellikleri eğitim verir ve nasıl zaman içinde değiştirmek), bu birkaç gün içinde beyinde tümör hücre infiltrasyon alanında eğitim sağlayacak4. Bu adımın ayrıntılı bir açıklaması Gligorijevic ve ark.13tarafından açıklanmıştır. - Son görüntü elde edildikten sonra, fare aşamasından çıkarın ve bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarmak için izin. Dehidratasyon önlemek için, 100 μL tuz subkutan verilebilir. Biyopsi benzeri yaralanma gerçekleştirilinceye kadar fareyi kafesine yerleştirin.
- Görüntünün ilgi alanı çeşitli konumlarını seçin ve yazılım koordinatlarını kaydedin. Seçilen pozisyonların tümörün farklı sitelerinden temsili pozisyonlar olduğundan emin olun (her tümör farklı olabilir, ancak tutarlılığı sağlamak için, tümörün çekirdeğine ve tüm farelerde kenarlara merkezi olan pozisyonların aynı miktarını seçin).
3. biyopsi benzeri yaralanma ve CIW değişimi
- İlk görüntüleme seansından 1 gün sonra tümör bölgesinde biyopsi benzeri bir yaralanma oluşturun.
Not: Alternatif olarak, kısmi tümör kaldırılması gibi başka bir prosedür gerçekleştirilebilir.- Daha önce adım 2.1.1 ' de açıklanan Isoflurane inhalasyon anestezi kullanarak fareyi sedate.
Not: enjekte edilebilir anestezi kullanılabilir Iken, bu prosedür CIW implantasyon daha kısaydır, ve inhalasyon anestezi tam kontrol etmek ve fare Sedated kalır zaman azaltmak için mümkün kılar. - Fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin ve kafasını iki kulak çubuğu ve bir burun kelepçesi ile sabitleyin. Pedallı refleksleri eksikliği ile anestezi derinliği kontrol edin. Prosedür sırasında fare yatıştırıcı tutmak için stereotaktik cerrahi için bir anestezi maskesi kullanın.
- Aseton bir pamuk çubukla emmek ve beyin karşı lamel magazini tutan tutkal yumuşatmak için lamel magazini kenarına yaymak.
- Onu kaldırmak için lamel magazini altında ince nokta forseps kaydırın. Eğer lamel magazini bu noktada kırarsa, cam parçalarını çıkarmak için forseps kullanın.
- Beyin nemli tutmak için korteks tampon uygulayın.
- Tümör içinde 25 G iğne 1 mm derinliğe daldırma. iğne çıkarın ve gerekirse, bir jelatin steril sünger uygulayarak kanamayı durdurun.
Not: Bu adım, bir floresan mikroskoptan altında daha doğru tümör alanı (Eğer tümör çok küçük) tanımlamak için gerçekleştirilebilir. Ayrıca, biyopsi alanı tanımlamak için delinme sırasında 1 μL floresan polistiren 1 μm boncuk çözeltisi enjekte edilebilir. - Beyin yüzeyini silikon yağla mühürleyin ve üstte 6 mm 'lik lamel magazini yapıştırın.
- Daha önce adım 2.1.1 ' de açıklanan Isoflurane inhalasyon anestezi kullanarak fareyi sedate.
4. tekrarlanan görüntüleme
- Biyopsi gibi yaralanmayı (ve gerekirse ardışık günlerde) verdikten bir gün sonra, tümör hücresi davranışlarını zamanla nasıl değiştiğini değerlendirmek için yukarıdaki adım 2 ' de açıklandığı gibi intravital görüntüleme tekrarlayın. Tüm tümör alanının temsilcisi olacak tümör çeşitli konumlarını seçin.
Not: biyopsi alanı tanımlamak için floresan boncuklar kullanılırsa, biyopsileşmeyen bölgelere kıyasla biyopsi bölgelerde görüntü tümör hücresi davranışlarına lokalize.
5. görüntü analizi
- Zaman atlamalı görüntüler el ile edinilmiş, bir klasöre birleştirin.
- Zaman aşımı LIF dosyasını mikroskop ile ilişkili ticari yazılımla açın (örn., LasX veya LAS AF). Sekme işlemi ≫ Işlem araçları > Birleştir'i seçin. Zaman dizisinin ilk görüntüsünü seçin ve ilköğesini tıklatın. Zaman dizisinin ikinci görüntüsünü seçin ve ikincidüğmesini tıklatın. İçinde birleştirme ölçümlendirmeleri, seçin t zaman. Uygula'yı tıklayın. İki timepoints ile yeni bir dosya oluşturulur. Dizinin ilk görüntüsü olarak yeni oluşturulan dosyayı kullanarak tüm timepoints için bu işlemi yineleyin.
- Herhangi bir xyz kayması için elde edilen z-yığınları düzeltin.
Not: Bu protokolde açıklanan denemeler Için, düzeltme için özel olarak tasarlanmış bir Visual Basic yazılım programı kullanıldı. Alternatif olarak, ımagej veya Imaris gibi mevcut diğer yazılımlar da kullanılabilir.- TIFF dosyalarını, birleştirilmiş zaman aşımı dosyasını sağ tıklatarak yazılımdan dışa aktarın. Ham verileri kaydet'i seçin. Dışa aktarılan dosyalar, kanala, zamana ve zkonumuna göre adlandırılan bir klasöre dışa aktarılır.
- TIFF dosyalarını özel olarak tasarlanmış Visual Basic yazılım programında açın.
- Timepoints, z-yığınları ve kanal sayısını tanımlayın.
- Her kanala görünüm sırasına göre bir renk atayın.
- Her zaman noktası için göster paneli formunda , yukarı (U) veya aşağı (D) düğmelerini tıklatarak z 'de vardiya düzeltin.
- Intravital görüntü oluşturma panelinde, XY vardiya için düzeltmek için kullanılacak kanalı seçin. Tümör hücrelerinden gelen sinyale göre, düzeltmek için yeşil kanalı seçin. XY düzeltmesi için Otomatik 'i tıklatın.
- Düzeltilmiş görüntüleri, ardışık üç zyığınlarının maksimum projeksiyon olarak dışa aktarın. Panel seçiminde , verilecek Ilk (Başlangıç) ve son (son) zdilimlerinin numaralarını tanıtın. Max'i seçin. Z Için ayrı klasörlerseçin. Do' yı tıklatın. Her biri için, üç z-yığınlar, zaman atlamalı görüntüler ayrı bir klasöre ihraç edilecektir.
- İsteğe bağlı olarak, doku elastik deformasyon için doğru.
Not: doku elastik deformasyon deneyleri Için, sert ve elastik doku deformasyonu14için düzeltmek için bir maç hareket telafisi yazılım programı kullanıldı. - Zaman atlamalı filmde tam z-yığını tek hücreleri izleyin.
Not: tümör hücreleri el ile takip edilebilir, örneğin, bir ımagej eklentisi (MTrackJ). Doğru iken, bu XY düzlem ile sınırlıdır ve çok zaman alıcı. Alternatif olarak, tümör hücrelerinin tam z-hacmi boyunca otomatik olarak izlenebilir, tümör hücre segmentasyon kullanarak (örneğin, Imaris yazılım). Ancak, son derece yoğun tümörlerde, otomatik izleme daha az doğrudur ve daha fazla izleme hatalarına yol verebilir.- Her zaman atlamalı serisi (üç ardışık z-yığını için) ayrı olarak açın ve izleyin. Zaman aşımı görüntülerini içeren klasörü ımagej 'ye sürükleyin.
- Sekme eklentileri > Izleme > mtrackjseçin. Her bir hücreyi, her zaman noktasında her hücreye Ekle ve tıklatma seçeneğini belirleyerek izleyin.
- Ölçmek ve dosyayı kaydetmek tıklayarak parçaların ölçmek ayıklamak.
Representative Results
Biyopsinin beyin tümörü hücre davranışıyla ilgili etkisini değerlendirmek için bu protokolde açıklanan prosedürü gerçekleştirdik. Glioma — GL261 hücreler — bir nükleer floresan protein ifade (H2B-Dendra2) C57BL/6 fareler beyinde enjekte edildi, ve kronik CIW implante edildi. Zaman aşımı intravital görüntüleme, tümördeki aynı hayvan öncesi ve biyopsi sonrası gibi yaralanma üzerine yapılmıştır (Şekil 1a, B). Bireysel tümör hücrelerinin göç z-yığını (Şekil 1C) farklı XY düzlemlerinde zaman içinde göç yolunu takip ederek ve göç hücrelerinin ön ve Postbiopsi yüzdesi olarak çizilen belirlendi (Şekil 1F). Tümör hücresi proliferasyon oranı, mitozis üzerine H2B etiketli Dendra2 yoğuşmaya göre ölçülebilir (Şekil 1D) ve bölünmüş hücrelerin ön ve postbiyopsi yüzdesi olarak çizilen (Şekil 1e). Aynı tümörde biyopsi öncesi ve sonrası göç hızının dağılımını karşılaştırdık ve müdahale sonrasında göç eden hücrelerin (hız > 4 μm/h) sayısının arttığını ve yavaş/migratuar olmayan hücrelerin sayısında bir azalma olduğunu tespit ettik ( hız < 4 μm/h) (Şekil 2a). Tümör başına ortalama olarak, biopsi olmayan kontrol fareler ile karşılaştırıldığında, bir biyopsi benzeri yaralanma yapıldığında migrasyon hücrelerinin yüzdesi bir 1,75 (SD = 0.16) kat artış gözlenen (Şekil 2B). Başka bir hafta için tümör hücresi davranışını takip ettik ve bu, migratuar tümör hücrelerinin yüzdesi sonunda hem kontrol ve biyopsi fareler azalmış olsa da, biyopsi fareler hala kontrol fareler daha yüksek bir göç kapasitesi sergiledi ( Şekil 2C). Zaman içinde tümör hücrelerinin proliferatif davranışının analizi, biopsi olmayan kontrol farelerine (Şekil 2D) göre biyopsi üzerine mitotik olayların sayısında bir 1,52 (SD = 0.26) kat artışı gösterdi.
Biyopsinin tümör hücresi proliferatif ve göç davranışları üzerinde gözlenen etkilerinin, CIW replasman cerrahisi nedeniyle bir artifakı olduğunu (biyopsi benzeri bir yaralanma yapmak için gerekli) olup olmadığını test etmek için, CIW uygulanan bir fare grubunda tümör hücresi davranışını takip ettik biyopsi olmadan değiştirilmesi. Bu grupta, herhangi bir göç veya tümör hücrelerinin proliferasyonu ile ilgili herhangi bir indüksiyon gözlemlemiyorduk, tümör hücresi proliferasyonu ve göç oranlarında artan bir şekilde biyopsi gibi yaralanma (Şekil 3A, B) tarafından tetiklendiğini gösteriyor.
Floresan protein Dendra2 istikrarlı fotoğraf-Convertible birkaç gün içinde tümör hücre infiltrasyonu okumaya izin verir. Ultraviyole/mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, Dendra2 geri dönülemez şekilde yeşile kırmızıya geçiş yapmaktadır. Bu özelliği kullanarak, tümör bir kare bölge aydınlatılmış ve ~ 200 Dendra2-ifade tümör hücreleri biyopsi öncesinde fotoğraf işaretli idi (Şekil 4). Biyopsi işleminden bir gün sonra, fotoğraf anahtarlı bölgeyi konumlandırdık ve çevreleyen tümör dokusuna sızmış tümör hücrelerinin hacmini ölçtük. Biyopsi gibi yaralanmalardan sonra biyopsinin olmadığı kontrol tümörlerine göre infiltrasyon alanının 1,72 (SD = 0,41) kez tümörlerde daha büyük olduğunu bulduk (Şekil 4). Bu yaklaşım tek bir hücre seviyesinde değil, sadece tümör hücresi toplu infiltratif davranışlar hakkında bilgi sağlamakla birlikte, zaman atlamalı görüntüleme yaklaşımından daha az zaman alan bir işlemdir ve özel olarak odaklanmış araştırma soruları için seçim yöntemi olabilir. infiltratif davranış okuyor.
Şekil 1: tümör hücresi davranışında biyopsi etkisinin uzunlamasına intravital görüntüleme Için deneysel kurulum. (A) halka ve manyetik tutucunun tasarımını gösteren diyagram. (B) deneysel iş akışının şematik temsili. Tümör hücreleri fareler beyni enjekte edilir ve bir CIW kurulmuştur. Tümör gelişimi üzerine, ilk (prebiopsi) zaman atlamalı görüntüleme oturumu gerçekleştirilir. Ertesi gün biyopsi ve CIW değişimi uygulanmaktadır. Görüntüleme sonrası gün (postbiopsi), ikinci bir zaman atlamalı görüntüleme oturumu gerçekleştirilir. Uzun süreli efektler için, sonraki görüntüleme oturumları yapılabilir. (C) görüntüler GL261 H2B-Dendra2 tümör hücrelerinin izlendiği bir zaman atlamalı filmin temsilci görüntülerini gösterir. Kırmızı çizgiler bireysel tümör hücresi izlerini tasvir ediyor. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) GL261 H2B-Dendra2 tümörlerinde bölme hücrelerini gösteren, in vivo zaman atlamalı görüntülerde temsilci. Mitozis farklı aşamalarında belirtilir: profaz (P), prometafaz (PM), metafaz (M), anafaz (A), ve telofaz (T). Ölçek çubuğu = 50 μm. grafikler, (E) migrasyon yüzdesini ve (F) bölünmüş hücrelerin ön ve postbiopsini gösterir. Her nokta, tek bir hayvan içinde ölçülen tüm konumlarda göç hücrelerin yüzdesini gösterir. Veriler altı fareler (* *P < 0,01, eşleştirilmiş t-test) ortalama ± S.E.M. olarak gösterilir. Bu rakam alieva ve al.4' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: biyopsinin tümör hücresi göç ve proliferasyon oranlarında etkisini gösteren temsili sonuçlar. (A) tek farelerde bazal göç göreli hücre hızı dağılımı değişikliği gösteren şelale araziler. Veriler beş fareler ortalama ± S.E.M. olarak gösterilir. (B) kontrol (mavi) ve biyopsi (kırmızı) hayvanlarda göç hücrelerinin sayısı (n = 6 fare, * * *P < 0,0001, öğrencinin t-testi) göç hücrelerinin ön müdahale sayısına normalleştirilmiş. (C) tümör hücresi davranışı birkaç gün boyunca izleniyordu. Gösterilen normalleştirilmiş (önmüdahaleye göre) zaman içinde bireysel farelerde göç hücreleri sayısı (n > 4 fare koşul başına, * * *P < 0,0001, iki yönlü ANOVA). (D) kontrol (mavi) ve biyopsi (kırmızı) hayvanlar bölünmüş hücrelerin normalleştirilmiş sayısı. Bireysel hayvan başına, değerler ön müdahale değerleri (n = 5 fare, * *P < 0,01, öğrencinin t-testi) normalleştirilir. Bu rakam alieva ve al.4' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: CIW 'nin değiştirilmesi tümör hücresi davranışı üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Uzunlamasına intravital görüntüleme, CIW 'nin Biyopsi yapmadan değiştirilmesi, göç ve proliferasyon oranları üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir. (A) belirtilen koşullar için göç hücre sayısında artış. Her sembol, tek bir fare ve n≥ 4 fareler ortalama temsil eder. (B) belirtilen koşullar için proliferasyon hücrelerinin sayısında artış. Her sembolü tek bir fare ortalama temsil eder (n≥ 4 fareler, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, NS = önemsiz, tek yönlü ANOVA ile Newman-keuls post hoc test). Bu rakam alieva ve al.4' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Dendra2 fotoğraf değiştirme ile elde edilen deneysel kurulum ve temsili sonuçları gösteren diyagram. Biyopsi üzerine tümör hücresi infiltrasyonu izlemek için, Dendra2-ifade tümör hücreleri fotoğraf-UV/mavi ışık aydınlatma ve görüntülenmiş bir kare bölgede, biyopsi 1 gün önce değiştirildi. Biyopsi işleminden bir gün sonra, fotoğraf anahtarlı bölge yeniden konumlandırılır ve reimaged edilir. Gösterilen, kanal çıkarma kullanılarak düzeltilmiş tümör hücre infiltrasyonu temsili Dendra2 görüntüleridir. Beyaz noktalı çizgi infiltrasyon alanını temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Grafik, biyopsi (kırmızı) ve kontrol (mavi) fareler için çizilen artan fotoğraf anahtarlamalı alanı gösterir. Her nokta, tek bir fareyi (n≥ 5 fare, *P < 0,05, öğrencinin t-test) ortalama değerini temsil eder. Bu rakam alieva ve al.4' ten değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
Burada, bir biyopsi gibi invazif cerrahi prosedürlere yanıt olarak tek hücreli düzeyde tümör hücresi davranışındaki değişiklikleri, yaşayan bir hayvanın beyinde incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Kronik CIW cerrahi implantasyonu ile uzunlamasına multifoton görüntüleme kombinasyonu, aynı hayvan4' te biyopsi öncesinde ve sonrası tümör hücre göçü, invazyonu ve proliferasyonunun ölçülmesini sağlar. Bioluminesans görüntüleme12, MRG10veya PET/CT11gibi tümör çoklu gün izleme için kullanılan diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu yöntem, tümörleri tek bir hücre seviyesinde benzersiz bir şekilde görselleştirir ve böylece hücresel davranışlarda bilgi sağlar temel tümör ilerlemesi.
Bu yöntemi başarıyla gerçekleştirmek için çeşitli yordamlar hakim olmalıdır. Bu protokolün en önemli adımları CIW implantasyonu ve değiştirilmesi. Bu adımların teknik karmaşıklığı, istikrarlı bir eğitim ile elde edilebilir hassasiyet ve cerrahi becerileri gerektirir. CIW ameliyatı sırasında, beyin yüzeyini kaplayacak olan kanama gibi komplikasyonlar, sonraki görüntüleme için zor olabilir. Steril araç veya çevre eksikliği, aynı zamanda tamamen beyin yüzeyini mühürlemek için başarısızlık, beyin yüzeyinde bir enfeksiyon neden olabilir (coverslip altında beyaz sıvı), hangi görüntüleme sorunlu hale getirmek ve şiddetle sonuç ödün Yorumu. Bu protokolün başka bir ortak sorunu zaman atlamalı görüntüleme sırasında hayvan hareketi olduğunu. Herhangi bir xyz vardiya deneyden sonra düzeltilebilir iken, her zaman noktası önce herhangi bir bilgi kaybını önlemek için her pozisyonun koordinatını düzeltmek için tavsiye edilir. Doku deformasyonu, tersine çevrilmiş bir mikroskop üzerinde görüntüleme sırasında bulunan ek bir sorundur. Fare sırtüstü pozisyonda yerleştirildiğinde beyin dokusu sıkıştırma muzdarip. Doku deformasyonunun derecesine bağlı olarak, tümör hücresi izleme, hücre deplasmanında hatalı bir ölçüme neden olabilir. Bunu önlemek için, sert ve elastik deformasyon için bir yazılım14kullanılabilir.
Bu prosedür tümör davranışındaki değişikliklerin incelenmesi için geniş bir uygulama sunarken, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Bu yöntem, bilim adamlarının 1,6 mm Derinlik (optik parametrik osilör kullanımı ile) kadar görüntü sağlar; Ancak, bu görüntüleme yüzeysel beyin korteks alanları15sınırlıdır anlamına gelir. Bu nedenle, beyem bölgesinde bulunan diffize içsel Pontine gliomlar da dahil olmak üzere derin beyin yapılarında bulunan bazı beyin tümörleri, bu protokol ile orijinal beyin ortamında incelenemez. Bu protokolün başka bir sınırlama görüntü olabilir tümör hacimdir. Total tümör hacmi tarama maksimum bilgi elde etmek için arzu rağmen, genellikle, tümör boyutu ve göç hücrelerin hızı faktörleri sınırlandırabilir. Her tümör tipi için, görüntüleme için optimum zaman aşımı dikkate alınmalıdır. Resimler arasındaki zaman dilimi çok uzunsa, tümör hücrelerini izlemek zor olabilir. Rezonant tarayıcı kullanımı, daha büyük bir tümör16görüntüleme izin, tarama süresini son derece azaltabilir. Son olarak, bu protokolün manuel görüntü analizi çok zaman alıcı olabilir, bunun yerine, otomatik 3D izleme programları kullanılabilir. Ancak, otomatik hücre izleme için algoritmalar nadiren ilgi hücrelerinin tam göç özetlemek için tasarlanmış olduğundan izleme sonucu her zaman görsel olarak denetlenmelidir.
Burada açıklanan protokolün hafif uyarlamaları daha geniş bir uygulama yelpazesi sağlayabilir. Biyopsiler yapmak yerine, kısmi Tümör rezeksiyonu veya kemoterapi gofresiyonunun teslim edilmesi gibi diğer (cerrahi) girişimler uygulanabilir. Cerrahi olarak implante edilmiş bir mikrotüp aracılığıyla bileşiklerin eklenmesi, farmakolojik olarak ilgi belirli molekülleri hedef bu protokol ile kombine edilebilir. Bu modelin, tümör hücresi davranışında belirli bir müdahalenin etkisini analiz etmeyi amaçlayan çalışmalarda yararlı olacağını bekliyoruz. Aynı hayvan içinde tekrarlanan önlemler gerçekleştirme olasılığı sadece tümör içinde meydana gelen değişiklikler hakkında daha doğru veri sağlar değil, aynı zamanda büyük ölçüde deneysel hayvanların çalışma başına gerekli sayısını azaltır.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar ANKO de Graaff ve hubrecht Imaging Center için görüntüleme desteği ve Ellen wehrens ve Hannah Johnson redaksiyon ve düzenleme için el yazması için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
