Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolamento de células-tronco polpa Dental humana e propagação a fim de avaliar a expressão da proteína príon durante o processo de diferenciação neuronal.

Resumo

Problemas bioéticos relacionados à manipulação de células-tronco embrionárias tem dificultado avanços no campo da pesquisa médica. Por esta razão, é muito importante obter células-tronco adultas de diferentes tecidos como adiposo, cordão umbilical, medula óssea e sangue. Entre as fontes possíveis, a polpa dental é particularmente interessante, porque é fácil de obter em relação às considerações bioéticas. Com efeito, Dental Pulp células estaminais humanas (hDPSCs) são um tipo de células-tronco adultas possam diferenciar em células neuronais e pode ser obtido o terceiro molar de pacientes saudáveis (idade 13-19). Em particular, a polpa dental foi removida com uma escavadeira, corte em fatias pequenas, tratada com colagenase IV e cultivada em um balão. Para induzir a diferenciação neuronal, hDPSCs foram estimulados com EGF/bFGF por 2 semanas. Anteriormente, temos demonstrado que durante o processo de diferenciação do conteúdo de celular prion proteínas (PrP^C) no hDPSCs aumentaram. A análise cytofluorimetric mostrou uma expressão inicial de PrP^C que aumentou após o processo de diferenciação neuronal. Ablação do PrP^C por siRNA PrP impediu a diferenciação neuronal induzida pelo bFGF/EGF. Neste trabalho, ilustramos que como temos realçado o isolamento, separação e em vitro métodos de cultivo de hDPSCs com vários procedimentos fácil, mais eficientes clones de células foram obtido e em grande escala de expansão das células tronco mesenquimais (MSCs) observou-se. Também mostramos como os hDPSCs, obtidos com métodos detalhados no protocolo, são um excelente modelo experimental para estudar o processo de diferenciação neuronal de MSCs e subsequentes processos celulares e moleculares.

Introdução

Células-tronco mesenquimais foram isoladas de vários tecidos, incluindo a medula óssea, sangue de cordão umbilical, polpa dentária humana, tecido adiposo e sangue^{1,2,3,4,5 , 6}. como relatado por vários autores, hDPSCs mostrar aderência de plástico, uma morfologia típica de fibroblasto tipo. Estes representam uma população altamente heterogênea com clones distintos e diferenças na capacidade proliferativa e diferenciação^7,

Protocolo

Terceiros molares utilizados no estudo foram extirpados de pacientes (13-19 anos de idade) com nenhuma história prévia de consumo de álcool ou de drogas, todos os não-fumantes e com adequada higiene oral. No dia da explicação, no departamento de ciência Odontologia e -maxilo-facial da Universidade de "Sapienza" de Roma, consentimento informado foi obtido os pacientes ou os pais. Consentimento informado foi obtido com base em considerações éticas e aprovação do Comitê de ética.

1. dente e extração de polpa dentária

1. Preparação de meio adequado para a conservação ou transporte.
   1. Prepare-se média baixa conce....

Resultados

Os procedimentos de isolamento e separação de hDPSCs da polpa dental, obtida a partir do terceiro molar, são processos complexos, em que pequenas mudanças podem levar a um resultado desastroso. Neste trabalho, utilizamos o protocolo de Arthur et al.. ¹² com várias melhorias. Um esquema representativo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.

hDPSCs representa uma pop.......

Discussão

Neste trabalho, concentrámo-na metodologia para isolamento e diferenciação neuronal de hDPSCs; Além disso, avaliamos o papel do PrP^C neste processo. Existem vários métodos para isolar e diferenciar hDPSCs em células neurônio e passos críticos durante o processo. hDPSCs são capazes de se diferenciar em várias linhagens como condroblastos, osteoblastos, adipócitos e neurônios. Nosso papel, investigamos os mecanismos de diferenciação neuronal e a presença de PrP^C. Como discutido acima, estas células ex.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A2942	É usado para suplementar o meio de cultura celular, é um antibiótico antifúngico polieno da Tecnologia de
Celular Anti-B3tubulina	Streptomyce	#4466	Uma das seis isoformas de tubulina B, é altamente expressa durante o desenvolvimento fetal e pós-natal, permanecendo alta no sistema nervoso periférico
Anti-CD105	BD Biosciences	611314	Endoglin (CD105), uma glicoproteína principal do endotélio vascular humano, é uma proteína de membrana integral tipo I com uma grande região extracelular, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmática curta
Anti-CD44	Millipore	CBL154-20ul	Anticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais
Anti-CD73	Tecnologia de Sinalização Celular	13160	CD73 é uma glicoproteína de 70 kDa glicosil fosfatidilinositol, ancorada em membrana, que catalisa a hidrólise de monofosfatos de nucleosídeos extracelulares em nucleosídeos bioativos
Anti-CD90	Millipore	CBL415-20ul	Anticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais
Anti-GAP43	Tecnologia de Sinalização Celular	#8945	É uma proteína associada ao crescimento específica do sistema nervoso em cones de crescimento e áreas de alta plasticidade
PE anti-camundongo	Abcam	ab7003	É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS
Anti-NFH	Tecnologia de Sinalização Celular	#2836	É um anticorpo que detecta níveis endógenos de proteína total do Neurofilamento-H
Anti-PrP mAb EP1802Y	Abcam	ab52604	Coelho monoclonal [EP 1802Y] para proteína PrP Prion
Anti-coelho CY5	Abcam	ab6564	É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS
Anti-STRO 1	Millipore	MAB4315-20ul	Marcadores celulares positivos anticorpos direcionados contra células-tronco mesenquimais
B27 Supp XF CTS	Gibco por life technologies	A14867-01	B-27  pode ser usado para apoiar a indução de células-tronco neurais humanas (hNSCs) a partir de células-tronco pluripotentes (PSCs), expansão de hNSCs, diferenciação de hNSCs e manutenção de neurônios diferenciados maduros em cultura
Citômetro de fluxo BD Accuri C6	BD Biosciences	AC6531180187	Citômetro de fluxo equipado com um laser azul (488 nm) e um laser vermelho (640 nm)
Software BD Accuri C6	A BD Biosciences		controla o sistema de citômetro de fluxo BD Accuri C6 para adquirir dados, gerar estatísticas e analisar resultados
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	basic Fibroblast Growth Factor
Centrífuga CL30R	Termo fisher Scientific	11210908	é um dispositivo utilizado para a separação de fluidos, gases ou líquidos, com base na densidade
CO2 Incubadora 3541	Termo fisher Scientific	317527-185	garante condições de crescimento ótimas e reprodutíveis para culturas celulares
Colagenase, tipo IV	Life Technologies	17104019	Collagenase é uma protease que cliva a ligação entre um aminoácido neutro (X) e a glicina na sequência Pro-X-Glyc-Pro, que é encontrada com alta frequência no colágeno
Bisturi descartável	Swann-Morton	501	É usado para cortar tecidos
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose com L-Glutamina com Sodium Pyruvate
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15 Fator de	Crescimento Epidérmico
Soro Fetal Bovino	Gibco da life technologies	10270-106	FBS é um suplemento de mídia popular porque fornece uma ampla gama de funções na cultura de células. FBS fornece nutrientes, fatores de crescimento e fixação e protege as células de danos oxidativos e apoptose por mecanismos que são difíceis de reproduzir em sistemas de meios sem soro (SFM)
Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro superior de frasco	Sarstedt	831.823.101	é um dispositivo usado para filtração de soluções
Flexitube GeneSolution para PRNP	Qiagen	GS5621	4 siRNAs para o gene Entrez 5621. Sequência alvo N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Solução de Hank 1x	Gibco da life technologies	240200083	A função essencial de Hanks′ A solução salina balanceada é para manter o pH e o equilíbrio osmótico. Também fornece água e íons inorgânicos essenciais para as células
Reagente de Transfecção HiPerFect	Reagente de	Qiagen	HiPerFect é uma mistura única de lipídios catiônicos e neutros que permite a absorção eficaz de siRNA e a liberação eficiente de siRNA dentro das células, resultando em alta redução de genes mesmo quando se usa baixas concentrações de siRNA
Neurobasal A	Gibco da life technologies	10888022	Neurobasal-A Medium é um meio basal projetado para manutenção e maturação a longo prazo de neurônios cerebrais pós-natais e adultos puros
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	30525-89-4	O paraformaldeído tem sido usado para fixação de células e seções de tecido durante procedimentos de coloração
penicilina/estreptomicina	Euroclone	ECB3001D	É usado para suplementar meios de cultura de células para controlar a contaminação bacteriana
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Euroclone	ECB4004LX10	PBS é uma solução salina balanceada usada para o manuseio e cultura de células de mamíferos. O PBS é usado para irrigar, lavar e diluir células de mamíferos. O tamponamento de fosfato mantém o pH na faixa fisiológica
TC-Platte 6 bem, Cell+,F	Sarstedt	833,920,300	É uma superfície de crescimento para células aderentes
Balão de cultura de tecidos T-25,Cell+,Tampa ventilada	Sarstedt	833,910,302	Frasco de cultura de tecidos T-25, poliestireno, Cell+ superfície de crescimento para células aderentes sensíveis, por exemplo, células primárias, pescoço inclinado, tampa de ventilação, amarelo, estéril, livre de pirogênio, não citotóxico, 10 pcs./saco
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Surfactante não iônico amplamente utilizado para recuperação de componentes de membrana sob condições leves e não desnaturantes
Tripsina-EDTA	Euroclone	ECB3052D	A tripsina cliva os peptídeos no lado C-terminal dos resíduos de aminoácidos lisina e arginina. A tripsina é usada para remover células aderentes de uma superfície de cultura
Tubo	Sarstedt	62,554,502	Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	Oferece proteção total para o meio ambiente e o trabalhador
ZEISS Axio Vert.A1 - Invertido  O microscópio	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1 oferece um preço de nível de entrada exclusivo e pode fornecer todas as técnicas contrastantes, incluindo campo claro, contraste de fase, PlasDIC, VAREL, contraste de modulação Hoffman aprimorado (iHMC), DIC e fluorescência. Incorpore iluminação LED para imagens suaves para células marcadas com fluorescência. O Axio Vert.A1 foi ergonomicamente projetado para trabalhos de rotina e compacto o suficiente para ficar dentro de capuzes de cultura de tecidos.