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Artigo de método

Isolamento, propagação e expressão de proteína príon durante a diferenciação Neuronal de células-tronco humanas polpa Dental

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DOI:

10.3791/59282

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18 de março de 2019

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1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Neste artigo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolamento de células-tronco polpa Dental humana e propagação a fim de avaliar a expressão da proteína príon durante o processo de diferenciação neuronal.

Resumo

Problemas bioéticos relacionados à manipulação de células-tronco embrionárias tem dificultado avanços no campo da pesquisa médica. Por esta razão, é muito importante obter células-tronco adultas de diferentes tecidos como adiposo, cordão umbilical, medula óssea e sangue. Entre as fontes possíveis, a polpa dental é particularmente interessante, porque é fácil de obter em relação às considerações bioéticas. Com efeito, Dental Pulp células estaminais humanas (hDPSCs) são um tipo de células-tronco adultas possam diferenciar em células neuronais e pode ser obtido o terceiro molar de pacientes saudáveis (idade 13-19). Em particular, a polpa dental foi removida com uma escavadeira, corte em fatias pequenas, tratada com colagenase IV e cultivada em um balão. Para induzir a diferenciação neuronal, hDPSCs foram estimulados com EGF/bFGF por 2 semanas. Anteriormente, temos demonstrado que durante o processo de diferenciação do conteúdo de celular prion proteínas (PrPC) no hDPSCs aumentaram. A análise cytofluorimetric mostrou uma expressão inicial de PrPC que aumentou após o processo de diferenciação neuronal. Ablação do PrPC por siRNA PrP impediu a diferenciação neuronal induzida pelo bFGF/EGF. Neste trabalho, ilustramos que como temos realçado o isolamento, separação e em vitro métodos de cultivo de hDPSCs com vários procedimentos fácil, mais eficientes clones de células foram obtido e em grande escala de expansão das células tronco mesenquimais (MSCs) observou-se. Também mostramos como os hDPSCs, obtidos com métodos detalhados no protocolo, são um excelente modelo experimental para estudar o processo de diferenciação neuronal de MSCs e subsequentes processos celulares e moleculares.

Introdução

Células-tronco mesenquimais foram isoladas de vários tecidos, incluindo a medula óssea, sangue de cordão umbilical, polpa dentária humana, tecido adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. como relatado por vários autores, hDPSCs mostrar aderência de plástico, uma morfologia típica de fibroblasto tipo. Estes representam uma população altamente heterogênea com clones distintos e diferenças na capacidade proliferativa e diferenciação7,8. hDPSCs express marcadores específicos para células-tronco mesenquimais (ou seja, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), são negativos para alguns marcadores hematopoiéticas (tais como o CD14 e CD19) e são capazes de diferenciação in vitro de multilineage9, 10,11.

Vários autores têm mostrado que essas células são capazes de se diferenciar em células neurônio usando protocolos diferentes, que incluem a adição de NGF, bFGF, EGF em combinação com o específico mídia e suplementos7,12. Além disso, muitas proteínas estão envolvidas durante o processo de diferenciação neuronal e, entre estes, vários trabalhos mostram um papel relevante e significativa expressão da proteína príon celular PrP (C), ambos em células-tronco adultas e embrionárias13, 14. PrPC representa uma molécula pleiotrópicos capaz de executar diferentes funções no interior das células como metabolismo de cobre, apoptose, e resistência à oxidativo estresse15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

Nosso papel anterior23, investigamos o papel do PrPC no processo de diferenciação neuronal hDPSCs. Na verdade, hDPSCs express precocemente PrPC e, após a diferenciação neuronal, foi possível observar um aumento adicional. Outros autores a hipótese de um possível papel de PrPC em processos de diferenciação neuronal de células-tronco. Com efeito, PrPC dirige a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos24. O objetivo deste estudo foi enfatizar a metodologia para a obtenção de células-tronco da polpa dentária, seu processo de diferenciação e o papel do PrPC durante a diferenciação neuronal.

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Protocolo

Terceiros molares utilizados no estudo foram extirpados de pacientes (13-19 anos de idade) com nenhuma história prévia de consumo de álcool ou de drogas, todos os não-fumantes e com adequada higiene oral. No dia da explicação, no departamento de ciência Odontologia e -maxilo-facial da Universidade de "Sapienza" de Roma, consentimento informado foi obtido os pacientes ou os pais. Consentimento informado foi obtido com base em considerações éticas e aprovação do Comitê de ética.

1. dente e extração de polpa dentária

  1. Preparação de meio adequado para a conservação ou transporte.
    1. Prepare-se média baixa concentração modificado águia de Dulbecco de glicose (DMEM-L) com L-glutamina (494,5 mL).
    2. Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) e 0,5 mL de anfotericina (0,1%).
  2. Extrair o terceiro molar do paciente, rapidamente enxágue com PBS, colocar em um tubo de ensaio de 15 mL com o meio e transferi-lo para o laboratório em menos de 2 h.
  3. Sob uma capa de risco biológico, abra o dente com um cortador de passagem de corte coronal paralela e tangente através do telhado da câmara de celulose.
  4. Delicadamente, retire a polpa com uma escavadeira pequena e coloque-o em um tubo de ensaio.
  5. Lavagem com PBS três vezes e centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a RT

2. processamento da polpa Dental e liberação de células-tronco

  1. Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet em solução de Hank e colocá-lo em uma placa de Petri. Incube durante 2 h a 37 ° C em 5% de CO2.
  2. Tipo de preparação de solução IV colagenase.
    1. Preparar 0,8 mL de DMEM-L.
    2. Derreta 1 mg de colagenase de tipo IV em 0,8 mL de DMEM-L e vortex durante vários minutos.
    3. Adicionar DMEM-L a 1 mL para ter uma concentração final de 1 mg/mL.
    4. Filtre a solução com um filtro de 0,22 µM.
  3. Remover a solução de Hank por centrifugação a 2.500 x g durante 10 minutos a RT e divida a polpa em fatias pequenas de aproximadamente 1 mm cada uma com um bisturi descartável.
  4. Coloque as fatias de polpa em um prato de petri e incubar com 1 mL de colagenase tipo IV por 15 min a 37 ° C em 5% CO2.
  5. Preparação de meio de cultura (500 mL).
    1. A 445 mL de DMEM-L, com L-glutamina.
    2. Adicione 50 mL de soro Fetal bovino (FBS) (10%).
    3. Adicione 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).
  6. Centrifugar a amostra a 2.500 x g durante 10 minutos a RT, remover o sobrenadante, resuspenda o pellet a médio (etapa 2.5) e cultura T25 balão específico para células-tronco a 37 ° C em 5% CO2.

3. propagação e cultura de células-tronco

  1. Todos os dias Verifique a cultura e, após 3 dias de crescimento, observar diferentes clones de células aderentes dentro do frasco.
  2. Cada 3 dias mudar o meio de cultura.
  3. Entre 7 e 12 dias, uma vez que as células aderentes têm alcance confluência, desanexá-los por tratar as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula de célula.
  4. Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.
  5. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g, remover o sobrenadante e colocar as células em um frasco T25 para propagar.
    Nota: Cada 3 dias, as células alcançar confluência.
  6. Propaga as células até 21 ou 28 dias (aproximadamente 6-8 passagens) para evitar a presença do non-tronco, como as células em cultura.
  7. Separe as células com 1 mL de tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C ou raspando suavemente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g.
  8. Remover o sobrenadante e testar as células para análise cytofluorimetric (etapa 6).

4. transiente PrPC silenciar por siRNA

  1. Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5) por 24 h.
  2. No dia seguinte, prepare o suporte de PrP de siRNA (400 µ l).
    1. Para um tubo de ensaio estéril, adicionar µ l 384 DMEM-L.
    2. Adicionar 1 µ l para cada tipo de siRNA PrP para DMEM-L para ter uma concentração final de 5 nM (4 siRNA PrP foram usados e verificadas pelo fornecedor para garantir um "knockdown" eficiência ≥70%).
    3. Adicionar 12 µ l de transfectionreagent para DMEM-L.
    4. A mistura de vórtice e incubar durante 10 minutos a RT para permitir a formação de complexos do transfection.
  3. Adicionar 400 μL de siRNA PrP médio para cada amostra e incubar durante 6 h a 37 ° C.
  4. Sem descartar siRNA PrP médio, adicione 1,6 mL (proporção de 1 a 5) do meio de cultura (etapa 2.5).
  5. Deixar as células por 72 h a 37 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT
  7. Adicione 2 mL de meio de cultura neuronal por 7 ou 14 dias (etapa 5.1).
  8. Altere o meio de cultura neuronal em 3 dias.
    Nota: Substitua o siRNA PrP solução substituir cada tempo o meio de cultura neuronal.
  9. No final do tempo, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e testar para antígenos de superfície neuronais por análise de Western Blot.

5. neuronal processo de indução de hDPSCs

  1. Preparação de meio de cultura neuronal (500 mL).
    1. Prepare 444,7 mL de mídia basal formulada para células neuronais.
    2. No meio de adicionar 50 mL de suplemento isento de soro usado para apoiar a viabilidade a longo prazo de adultas e embrionárias estaminais células neuronais (10%).
    3. Adicione 200 µ l de básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF) (concentração final 40 ng/mL) e 100 µ l de fator de crescimento epidérmico (EGF) para o meio (concentração final 20 ng/mL).
    4. Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) para o meio.
  2. HDPSCs de cultura em placas boas 6 (2 x 105 células/mL) até 28 dias de separação da polpa e estimulá-los com 2 mL de meio de cultura neuronal.
  3. Cada 3 dias, desprezar o sobrenadante, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e substituir 2 mL do meio de cultura neuronal.
  4. Depois de 7 ou 14 dias, retire as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula.
  5. Adicione 4 mL (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.
  6. Testar para a presença de antígenos de superfície neuronais (etapa 6) ou a expressão de proteína príon (passo 7), análise de citometria de fluxo.

6. caracterização de hDPSCs por citometria de fluxo

  1. Selecione estroma mesenquimal (MSC)-antígenos de superfície específicas ou neuronais.
  2. Cultura do hDPSCs em placas de 6-poços (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).
  3. Desanexe hDPSCs aos 28 dias de separação da polpa dental ou após 14 dias do meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina para 3 min a 37 ° C ou suavemente raspador.
  4. Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina e centrifugate em 259 x g durante 6 min à RT lavar outra 2 vezes com 2 mL de PBS no RT
  5. Corrigir o hDPSCs não tratada ou tratada com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS com surfactante não-iônico 0,1% (v/v) em PBS para adicional 10 min a RT
  7. Executar o bloqueio com leite em pó desnatado 5% em 1 mL de PBS por 1h no RT
  8. Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS e incube as celulas com anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1h no RT
  9. Lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS e incubar com PE anti-rato (01:50 / 5 x 105 células) ou anticoelho CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 células) por 1h adicional no RT
  10. Usar os anticorpos secundários para retenção de células immunopositive (anti-rato PE ou anticoelho CY5 mAb) e analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.

7. avaliação da expressão de PrPC em hDPSCs pela análise de citometria de fluxo

  1. Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).
  2. Desanexar hDPSCs nos dias 21 e 28 de separação da polpa dental e depois de 7 ou 14 dias com meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina e parar a ação da tripsina, conforme descrito na etapa 6.4. Corrigir os espécimes com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.
  3. Permeabilize com surfactantin 0,1% (v/v) não-iónicos PBS por 10 min em RT. Remove o sobrenadante e as células com mAb anti-PrP de coelho EP1802Y (01:50 / 5 x 105 células) de mancha mAb por 1h no RT. Incubar com anticoelho CY5 (01:50 / 5 x 105 células) mAb para h 1 adicional no RT
  4. Analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.

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Resultados

Os procedimentos de isolamento e separação de hDPSCs da polpa dental, obtida a partir do terceiro molar, são processos complexos, em que pequenas mudanças podem levar a um resultado desastroso. Neste trabalho, utilizamos o protocolo de Arthur et al.. 12 com várias melhorias. Um esquema representativo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.

hDPSCs representa uma pop...

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Discussão

Neste trabalho, concentrámo-na metodologia para isolamento e diferenciação neuronal de hDPSCs; Além disso, avaliamos o papel do PrPC neste processo. Existem vários métodos para isolar e diferenciar hDPSCs em células neurônio e passos críticos durante o processo. hDPSCs são capazes de se diferenciar em várias linhagens como condroblastos, osteoblastos, adipócitos e neurônios. Nosso papel, investigamos os mecanismos de diferenciação neuronal e a presença de PrPC. Como discutido acima, estas células ex...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela "Fondazione Varrone" e Universidade de Rieti Hub "Sabina Universitas" de Vincenzo Mattei.

Figura 5 (A, B) reimpresso com permissão da editora Taylor & Francis Ltd de: complexo multimolecular de papel de príon proteína EGFR durante a diferenciação neuronal de dentais derivado de celulose células estaminais humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prião. 4 de março de 2018. Taylor & Francis Ltd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Anfotericina BSigma-AldrichA2942É usado para suplementar o meio de cultura celular, é um antibiótico antifúngico polieno da Tecnologia de
Celular Anti-B3tubulinaStreptomyce #4466Uma das seis isoformas de tubulina B, é altamente expressa durante o desenvolvimento fetal e pós-natal, permanecendo alta no sistema nervoso periférico
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), uma glicoproteína principal do endotélio vascular humano, é uma proteína de membrana integral tipo I com uma grande região extracelular, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmática curta
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulAnticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais
Anti-CD73 Tecnologia de Sinalização Celular13160CD73 é uma glicoproteína de 70 kDa glicosil fosfatidilinositol, ancorada em membrana, que catalisa a hidrólise de monofosfatos de nucleosídeos extracelulares em nucleosídeos bioativos
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulAnticorpos marcadores celulares positivos direcionados contra células-tronco mesenquimais
Anti-GAP43 Tecnologia de Sinalização Celular#8945É uma proteína associada ao crescimento específica do sistema nervoso em cones de crescimento e áreas de alta plasticidade
PE anti-camundongo Abcamab7003É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS
Anti-NFH Tecnologia de Sinalização Celular#2836É um anticorpo que detecta níveis endógenos de proteína total do Neurofilamento-H
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Coelho monoclonal [EP 1802Y] para proteína PrP Prion
Anti-coelho CY5 Abcamab6564É um anticorpo usado em citometria de fluxo ou análise FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulMarcadores celulares positivos anticorpos direcionados contra células-tronco mesenquimais
B27 Supp XF CTSGibco por life technologiesA14867-01B-27  pode ser usado para apoiar a indução de células-tronco neurais humanas (hNSCs) a partir de células-tronco pluripotentes (PSCs), expansão de hNSCs, diferenciação de hNSCs e manutenção de neurônios diferenciados maduros em cultura
Citômetro de fluxo BD Accuri C6BD BiosciencesAC6531180187Citômetro de fluxo equipado com um laser azul (488 nm) e um laser vermelho (640 nm)
Software BD Accuri C6A BD Biosciencescontrola o sistema de citômetro de fluxo BD Accuri C6 para adquirir dados, gerar estatísticas e analisar resultados
bFGFPeproThec, DBA100-18Bbasic Fibroblast Growth Factor 
Centrífuga CL30RTermo fisher Scientific11210908é um dispositivo utilizado para a separação de fluidos, gases ou líquidos, com base na densidade
CO2 Incubadora 3541Termo fisher Scientific317527-185garante condições de crescimento ótimas e reprodutíveis para culturas celulares
Colagenase, tipo IV Life Technologies17104019Collagenase é uma protease que cliva a ligação entre um aminoácido neutro (X) e a glicina na sequência Pro-X-Glyc-Pro, que é encontrada com alta frequência no colágeno
Bisturi descartável Swann-Morton501É usado para cortar tecidos
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose com L-Glutamina com Sodium Pyruvate
EGFPeproThec, DBAAF-100-15 Fator deCrescimento Epidérmico 
Soro Fetal BovinoGibco da life technologies10270-106FBS é um suplemento de mídia popular porque fornece uma ampla gama de funções na cultura de células. FBS fornece nutrientes, fatores de crescimento e fixação e protege as células de danos oxidativos e apoptose por mecanismos que são difíceis de reproduzir em sistemas de meios sem soro (SFM)
Filtropur BT50 0,2.500 mL Filtro superior de frascoSarstedt831.823.101é um dispositivo usado para filtração de soluções
Flexitube GeneSolution para PRNPQiagenGS56214 siRNAs para o gene Entrez 5621. Sequência alvo N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Solução de Hank 1xGibco da life technologies240200083A função essencial de Hanks′ A solução salina balanceada é para manter o pH e o equilíbrio osmótico. Também fornece água e íons inorgânicos essenciais para as células
Reagente de Transfecção HiPerFect Reagente deQiagenHiPerFect é uma mistura única de lipídios catiônicos e neutros que permite a absorção eficaz de siRNA e a liberação eficiente de siRNA dentro das células, resultando em alta redução de genes mesmo quando se usa baixas concentrações de siRNA
Neurobasal A Gibco da life technologies10888022Neurobasal-A Medium é um meio basal projetado para manutenção e maturação a longo prazo de neurônios cerebrais pós-natais e adultos puros 
ParaformaldeídoSigma-Aldrich30525-89-4O paraformaldeído tem sido usado para fixação de células e seções de tecido durante procedimentos de coloração
penicilina/estreptomicina EurocloneECB3001D É usado para suplementar meios de cultura de células para controlar a contaminação bacteriana
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)EurocloneECB4004LX10 PBS é uma solução salina balanceada usada para o manuseio e cultura de células de mamíferos. O PBS é usado para irrigar, lavar e diluir células de mamíferos. O tamponamento de fosfato mantém o pH na faixa fisiológica
TC-Platte 6 bem, Cell+,FSarstedt833,920,300É uma superfície de crescimento para células aderentes
Balão de cultura de tecidos T-25,Cell+,Tampa ventiladaSarstedt833,910,302Frasco de cultura de tecidos T-25, poliestireno, Cell+ superfície de crescimento para células aderentes sensíveis, por exemplo, células primárias, pescoço inclinado, tampa de ventilação, amarelo, estéril, livre de pirogênio, não citotóxico, 10 pcs./saco
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Surfactante não iônico amplamente utilizado para recuperação de componentes de membrana sob condições leves e não desnaturantes
Tripsina-EDTA EurocloneECB3052D A tripsina cliva os peptídeos no lado C-terminal dos resíduos de aminoácidos lisina e arginina. A tripsina é usada para remover células aderentes de uma superfície de cultura
TuboSarstedt62,554,502Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Oferece proteção total para o meio ambiente e o trabalhador
ZEISS Axio Vert.A1 - Invertido  O microscópioZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 oferece um preço de nível de entrada exclusivo e pode fornecer todas as técnicas contrastantes, incluindo campo claro, contraste de fase, PlasDIC, VAREL, contraste de modulação Hoffman aprimorado (iHMC), DIC e fluorescência. Incorpore iluminação LED para imagens suaves para células marcadas com fluorescência. O Axio Vert.A1 foi ergonomicamente projetado para trabalhos de rotina e compacto o suficiente para ficar dentro de capuzes de cultura de tecidos.
SinalizaçãoO Transfecção 301705

Referências

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