Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

Resumo

Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos

Resumo

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) é uma enzima comum expressada em células procariotas e eucariotas. Ele catalisa a hidrólise de monoésteres de fosfato de muitas moléculas em pH básico e desempenha um papel indispensável no metabolismo de fosfato. Nos seres humanos, eucariótica ALP é um dos sinais de enzimática mais frequentemente utilizados no diagnóstico de várias doenças, tais como colestase e raquitismo. Em S. aureus, ALP é detectado exclusivamente na membrana celular; também é expressa como uma forma secretória também. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na formação de biofilme.

O objetivo deste manuscrito é desenvolver um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP em S. aureus biofilme que não necessita de isolamento da proteína. Usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato, medimos a atividade da ALP em S. aureus biofilme formado em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Atividade baseou-se na formação do produto solúvel reação medido por 405 absorvância nm. A natureza de alta taxa de transferência do método 96 cultura pocos placa fornece um método sensível e reprodutível para ensaios de atividade ALP. O mesmo experimental setup também pode ser estendido para medir outros marcadores moleculares extracelulares relacionados à formação de biofilme.

Introdução

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ubiquitously é expresso em ambas as células procariotas e eucariotas¹. Isso pode catalisar a hidrólise de monofosfato de moléculas diferentes, tais como nucleotídeos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato e anidridos de ácido fosfórico. Em humanos, ALP eucariótica está presente em muitos tecidos, incluindo fígado, ossos, intestino e placenta². Ela desempenha papel importante na fosforilação de proteínas, bem como do crescimento celular, apoptose, processos de células-tronco e mineralização óssea normal. Eucariótica ALP é um indicador chave do soro para a presença de doenças nos ossos, ....

Protocolo

1. preparação média

1. Preparar 1 L de Tryptic Soy caldo (TSB): em 1 L de água destilada, adicione 15 g de digerir pancreático de caseína, 5g de papaic digest de farelo de soja, 3 g de cloreto de sódio, 2,5 g de dextrose e 2,5 g de fosfato dipotássico. Esterilize antes do uso.
2. Para Tryptic Soy Agar (TSA), adicione 15 g de ágar-ágar para 1 L de TSB, autoclave. Então deixe esfriar até a temperatura de quarto. Em seguida, despeje em uma proporção de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).
3. Meio de cultura de biofilme: adicionar 10 g de glicose para 1 L de TSB autoclavado. Esterilize por filtração através de um filtro de 0,2 µm.

Resultados

A Figura 1 mostra um resultado representativo da atividade da ALP de biofilme culturas de S. aureus em placas de cultura de pocos 96. 75 μL de solução de pNPP disponível comercialmente foi adicionado para cada bem e incubados à temperatura ambiente. Após incubação de diferentes épocas (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min, respectivamente) 75 μL de 5 M de NaOH foi adicionado para parar a reação. O produto então foi medido em um leitor de pl.......

Discussão

No nosso ensaio, usamos pNPP como o substrato ALP. Esta é uma solução de trabalho projetada para ELISA e a diluição não é necessária. Após a hidrólise por ALP, um produto amarelo desenvolve e pode ser medido em 405 nm. No final da reação enzimática, brevemente centrifugadas a placa bem 96 e transferido o sobrenadante para um prato bem 96 fresco para medir a absorvância usando o leitor de placa. Achamos que essa etapa de centrifugação extra é crítica, pois aumenta a consistência de absorbância em 405 nm, provavelmente, el.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	VWR	9002-18-0
Centrífuga Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
Pellets de NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	As concentrações típicas de substratos líquidos pNPP, frequentemente usados em ensaios imunoenzimáticos (ELISA), variam entre 10 a 50 mM. Semelhante à maioria dos substratos líquidos pNPP prontos para uso, como o usado aqui, a concentração exata de pNPP não é divulgada devido à sua natureza proprietária.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Leitor de placas	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Ágar Soja Tríptica           15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Caldo de Soja Tríptico:          g/L Digestão Pancreática de Caseína............ 15.0 Resumo Papaico do Farelo de Soja......... 5.00 Cloreto de sódio.............................. 3.00 Dextrose........................................   2,50 Fosfato dipotássico.................. 2,50	VWR	90006-098
96 placas boas		6902D09	deram forma à parte inferior