Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

Resumo

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Resumo

Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.

Introdução

As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases¹. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho², ....

Protocolo

1. preparação de amostras

1. 1.000 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 4,6
   1. Medir a 800 mL de água destilada num copo graduado de 1.000 mL.
   2. Pesa 8,2 g de acetato de sódio anidro e adicioná-lo para o copo.
   3. Coloque o copo sobre um prato de agitar, colocar uma haste de agitação no copo medidor, ligue a placa de agitação e mexa até dissolver completamente.
   4. Quando o acetato de sódio anidro é completamente dissolvido, medir o pH da solução com um medidor de pH calibrado.
   5. Adicione 1 M de HCl ou NaOH em conformidade para obter o pH desejado 4.6.
   6. Adicione água destilada até que o ....

Resultados

Os resultados representativos na Figura 1 e Figura 5 mostram dados de duas enzimas, lactase e a invertase. Lactase e a invertase catalisam a hidrólise de um dissacarídeo em dois monossacarídeos, endothermically e exotermicamente, respectivamente. Ambas as reações enzimáticas foram executadas em concentrações que impediam a saturação da enzima.

Os dados de lactase demonstram como ITC dados podem ser usados para estimar a estabilidade d.......

Discussão

Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, demonstrámos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
a-Lactose	Fisher Scientific	desconhecido (muito velho)	500g
de Acetato de Sódio, Anidro 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	Solução de	Bio 100780	5g
, 1N	Fisher Scientific	Medidor de Bancada SA48-500	500mL
- pH	VWR	89231-622
Etanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL
Micro-90 Micro-90	de 1 galão Fisher Scientific	NC024628	1L (solução de limpeza)

Ácido Hidrocolrico MP