Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

Resumo

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Resumo

Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.

Introdução

As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases¹. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho², queijo³, cerveja⁴, leite sem lactose⁵e outros produtos alimentares importantes. Enquanto este artigo centra-se na utilização de enzimas na indústria de alimentos, existem muitos outros usos para enzimas, incluindo na síntese química e droga verde.

O utilitário de enzimas é limitado pela estabilidade da atividade enzimática, que depende de manter a estrutura tridimensional da enzima. A estrutura da enzima pode ser estabilizada por modificações como PEGylation⁶, imobilização em um suporte sólido⁷, as modificações genéticas⁸e formulações. Atualmente, a estabilidade da enzima é normalmente medida por Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e⁹ensaios de atividade enzimática de ponto de extremidade. DSC mede a temperatura na qual uma enzima se desenrola; Quanto maior a temperatura, mais estável a estrutura. No entanto, a perda de atividade ocorre frequentemente em uma temperatura mais baixa do que o necessário para desdobrar a enzima ou domínios dentro do enzima¹⁰. Portanto, DSC não é suficiente para determinar se uma modificação da enzima aumenta a estabilidade da atividade enzimática. Ensaios enzimáticos de ponto de extremidade são geralmente tempo intensivo, requerem amostras múltiplas e muitas vezes envolvem uma reação colorimétrica acoplada que não é aplicável para soluções altamente coloridas ou opacas ou suspensões.

Este trabalho demonstra um método para a medição direta da estabilidade da atividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC mede a taxa de calor liberado ou absorvido durante o curso de uma reação. Desde que quase todas as reações produzem ou absorvem calor, ITC pode ser usado para a maioria das reações catalisada por enzimas, incluindo reações que não têm uma reação de acoplamento ou ocorrem em meios opacos, como leite. ITC tem sido usado por muitas décadas para medir parâmetros de cinéticos químicos para muitos tipos de reações, mas o protocolo apresentado aqui se concentra no uso ITC para medir a taxa de pico de calor de reações catalisadas por enzimas e demonstra que a atividade da enzima é linearmente correlacionada com a taxa de pico de calor. ITC medições de taxas de pico de calor na maior parte são autônomas e exigem muito pouco tempo pessoal para configurar e analisar.

Protocolo

1. preparação de amostras

1. 1.000 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 4,6
   1. Medir a 800 mL de água destilada num copo graduado de 1.000 mL.
   2. Pesa 8,2 g de acetato de sódio anidro e adicioná-lo para o copo.
   3. Coloque o copo sobre um prato de agitar, colocar uma haste de agitação no copo medidor, ligue a placa de agitação e mexa até dissolver completamente.
   4. Quando o acetato de sódio anidro é completamente dissolvido, medir o pH da solução com um medidor de pH calibrado.
   5. Adicione 1 M de HCl ou NaOH em conformidade para obter o pH desejado 4.6.
   6. Adicione água destilada até que o volume total é de 1.000 mL.
   7. Armazenar em temperatura ambiente até o uso.
2. Solução de enzima
   1. Prepare-se 10 mL do cilindro de solução dentro da faixa de 10-30 mg/mL por primeira medição 8 mL do 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 em um 15 mL formou-se a enzima.
   2. Adicionar a solução-tampão em um tubo cônico de 15 mL com enzima e agitar vigorosamente até dissolver a enzima.
   3. Adicione mais solução-tampão, até que o volume total é de 10 mL.
   4. Armazene a solução de enzima a 4 ° C até o uso.
3. Solução de substrato
   1. Para preparar uma solução de substrato dentro da faixa de 300-600 mM, calcule a quantidade de substrato necessário em gramas para fazer a concentração desejada.
   2. Pesar o substrato e colocar em um copo de vidro de 100 mL
   3. Medir 20 mL da solução-tampão usando um cilindro graduado de 25 mL e adicioná-lo para o copo de vidro.
   4. Coloque o copo sobre um prato de agitar e colocar uma haste de agitação magnética para o copo. Ligue o calor e ajustar a velocidade de agita em conformidade.
   5. Permitir que mexendo para continuar até que o substrato se dissolva.
   6. Despeje a solução de substrato em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 0,1 M de sódio Acetato tampão pH 4.6 até o volume total é de 45 mL. Misturar por agitação.
   7. Armazene a solução de substrato à temperatura ambiente até o uso.

2. realizando o experimento

1. Preparando o instrumento ITC
   1. Certifique-se de que a referência de célula é carregada com 350 µ l de água destilada. Antes de carregar a enzima na célula de amostra, verifique se que a célula de amostra ter sido limpo.
   2. Limpeza de protocolo-encha a seringa de carregamento com 500 µ l de solução de limpeza de 2% (Tabela de materiais), insira cuidadosamente a agulha para a célula de amostra, preencher a célula e retire lentamente o líquido usando a mesma seringa. Descarte o líquido para um copo. Repetir esta etapa duas vezes com 2% de solução de limpeza (Tabela de materiais), três vezes com etanol 70% e em seguida lavar dez vezes com água destilada.
   3. Encha a seringa de carregamento com 450 µ l de solução enzimática, cuidadosamente, introduza a agulha até a parte inferior da célula de amostra e pressione o êmbolo até a linha de 100 µ l lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.
   4. Lave a seringa de titulação de 50 µ l com água destilada três vezes, colocando a ponta da agulha em água e depois lentamente levando a água para a seringa, em seguida, dispensando a água em um recipiente de resíduos.
   5. Remova a água residual por uma lavagem com solução de substrato três vezes.
   6. Encha a seringa de titulação com solução de substrato, desenhando-se a solução até que a seringa está cheia sem quaisquer bolhas de ar.
   7. Com a seringa ainda na solução de substrato, retire o êmbolo e deixe aproximadamente 2 µ l de ar a entrar no top da seringa e insira novamente o êmbolo.
   8. Retire a alça buret do ITC, coloque a seringa dentro da alça buret rosca e até apertar.
   9. Limpe a ponta do agitador com um pano livre de fiapos, depois cuidadosamente coloque a alça buret dentro do instrumento ITC e bloqueá-la.

3. criação de ITCrun

1. No computador, abra o ITCrun e clique em Configurar.
2. Clique em taxa de agitação e conjunto para 350 RPM. Verifique o tamanho da seringa (µ l) e se é em 50 µ l.
3. Definir a temperatura e clique em Update. Recomenda-se que esta etapa seja realizada pelo menos 1 h antes de preparar o ITC. Isso permite tempo suficiente para o instrumento aquecer ou refrigerar para baixo, conforme necessário.
4. Para a instalação do experimento, selecione titulação incremental.
5. Clique em Inserir para configurar as injeções. Ajustar o intervalo de injeção para 5.400 s, volume de injeção (µ l) 4 e o número de injeções para 4. Pressione Okey para confirmar as configurações.
6. Na caixa de equilibração, selecione Autoequilibrar e grande esperado aquece. (Se o esperado aquece-se pequeno, um pode selecionar pequenos sob aquece esperado; no entanto, isto irá aumentar o tempo da equilibração).
7. Definir a linha de base inicial para 300 s.
8. Para iniciar a execução, clique a começar símbolo ao lado de taxa de agitação e, em seguida, clique Iniciar que está localizado ao lado do símbolo de chave.
9. Salve o arquivo e permitir que o instrumento executar.

4. análise de dados

1. Abra o arquivo em NanoAnalyze. Clique em dados e selecionar as colunas de dados.
2. Selecionar todos os dados, copiar e colar os dados para o Microsoft Excel.
3. Ajustar o zero da linha de base, adicionando o valor exigido em 300 s para torná-lo zero. Aplica esta correção de toda a coluna de valores de taxa de calor.
4. Encontrar o valor mínimo ou máximo da taxa de calor para cada injeção usando a equação: =MIN(cell:cell) ou MAX(cell:cell). Cada ponto de dados representa a atividade enzimática de pico da enzima em cada injeção.
5. Plotar gráficos dos valores MIN ou MAX contra o tempo em que o valor ocorreu durante a titulação.

Resultados

Os resultados representativos na Figura 1 e Figura 5 mostram dados de duas enzimas, lactase e a invertase. Lactase e a invertase catalisam a hidrólise de um dissacarídeo em dois monossacarídeos, endothermically e exotermicamente, respectivamente. Ambas as reações enzimáticas foram executadas em concentrações que impediam a saturação da enzima.

Os dados de lactase demonstram como ITC dados podem ser usados para estimar a estabilidade d...

Discussão

Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, demonstrámos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
a-Lactose	Fisher Scientific	desconhecido (muito velho)	500g
de Acetato de Sódio, Anidro 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	Solução de	Bio 100780	5g
, 1N	Fisher Scientific	Medidor de Bancada SA48-500	500mL
- pH	VWR	89231-622
Etanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL
Micro-90 Micro-90	de 1 galão Fisher Scientific	NC024628	1L (solução de limpeza)

Ácido Hidrocolrico MP