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Artigo de método

Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência

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DOI:

10.3791/59308

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25 de junho de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Neste artigo

Resumo

São apresentados aqui protocolos para caracterização imuno-histoquímica e localização de peptídeo de Hipocretina, receptores de Hipocretina e receptores endocanabinoides no intestino e cérebros de modelos adultos de zebrafish de obesidade normal e induzida por dieta (Dio) usando immunoperixidase e métodos dobro da imunofluorescência.

Resumo

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica altamente sensível e específica envolvida na deteção de antígenos do alvo em seções do tecido com anticorpos etiquetados. É um processo multistep no qual a otimização de cada etapa é crucial para obter o sinal específico ideal. Através do IHC, pode-se detectar a distribuição e a localização de biomarcadores específicos, revelando informações sobre a conservação evolutiva. Além disso, o IHC permite a compreensão das mudanças de expressão e distribuição de biomarcadores em condições patológicas, como a obesidade. IHC, principalmente a técnica da imunofluorescência, pode ser usado no zebrafish adulto para detectar a organização e a distribuição de moléculas filogeneticamente conservadas, mas um protocolo padrão de IHC não é estasblished. Orexin e endocanabinóide são dois sistemas altamente conservados envolvidos no controle da ingestão de alimentos e patologia da obesidade. São relatados aqui os protocolos usados para obter a informação sobre o peptide do Hipocretina (Oxa), o receptor do Hipocretina (Ox-2R), e a localização e a distribuição do receptor do canabinóides (CB1R) no intestino e no cérebro de modelos adultos obesos normais e dieta-induzidos do zebrafish (Dio). Também são descritos os métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência dupla, bem como a preparação de reagentes, fixação, incorporação de parafina, e crio-proteção do tecido zebrafish e preparação para um passo de bloqueio de atividade endógena e fundo contracoloração. O conjunto completo de parâmetros é obtido a partir de experimentos prévios de IHC, através dos quais mostramos como a imunofluorescência pode ajudar na compreensão de OXs, OX-2R e distribuição CB1R, localização e conservação da expressão em zebrafish adulto Tecidos. As imagens resultantes com intensidade de sinal altamente específica levaram à confirmação de que os zebrafish são modelos animais adequados para estudos imuno-histoquímicos de distribuição, localização e conservação evolutiva de biomarcadores específicos em condições fisiológicas e patológicas. Os protocolos aqui apresentados são recomendados para experimentos de IHC em zebrafish adulto.

Introdução

Immunohistochemistry (IHC) é uma técnica clássica bem estabelecida usada para identificar componentes celulares ou do tecido (antígenos) pela interação do antígeno-anticorpo1,2. Ele pode ser usado para identificar a localização e distribuição de biomoléculas alvo dentro de um tecido. O IHC utiliza reações imunológicas e químicas para detectar antígenos em secções teciduais3. Os principais marcadores utilizados para a visualização de interações antígeno-anticorpo incluem corantes fluorescentes (imunofluorescência) e reações de cor de substrato enzimático (imunoperoxidase), ambos conjugados a anticorpos4. Usar a observação microscópica é possível determinar a localização do tecido etiquetado, que corresponde aproximadamente à localização do antígeno do alvo no tecido.

Existem dois métodos para reações fluorescentes ou cromogênicas para detectar proteínas: o método de detecção direta, no qual o anticorpo primário específico é rotulado diretamente; e o método de detecção indireta, no qual o anticorpo primário é não conjugada enquanto o anticorpo secundário carrega o rótulo5,6,7. O método indireto tem algumas vantagens, que é principalmente a sua amplificação de sinal. Além disso, diferentemente de outras técnicas moleculares e celulares, com imunofluorescência, é possível visualizar a distribuição, localização e coexpressão de duas ou mais proteínas diferencialmente expressas dentro de células e tecidos7. A escolha do método de detecção utilizado depende dos detalhes experimentais.

Até o momento, o IHC é amplamente utilizado na pesquisa básica como uma ferramenta poderosa e essencial para a compreensão da distribuição e localização de biomarcadores e o perfilamento geral de diferentes proteínas no tecido biológico de humanos a invertebrados8, 9 anos de , 10 de , a técnica 11. The ajuda a indicar um mapa da expressão da proteína em um grande número de órgãos animais normais e alterados e de tipos diferentes do tecido, mostrando possível para baixo ou acima-regulação da expressão induzida por mudanças fisiológicas e patológicas. A IHC é uma técnica altamente sensível que requer precisão e a escolha correta dos métodos para obter os melhores resultados12. Em primeiro lugar, muitos fatores diferentes, como fixação, reatividade cruzada, recuperação de antígenos e sensibilidade de anticorpos, podem levar a sinais falsos positivos e falsos negativos13. A seleção dos anticorpos é uma das etapas mais importantes do IHC e depende da especificidade do antígeno e sua afinidade com a proteína e as espécies investigação7.

Recentemente, nós otimizamos a técnica de IHC para detectar membros de sistemas do hipocretin e do endocanabinóide do orexin/no tecido adulto do zebrafish. Temos focado principalmente na fixação, incorporação de tecidos usando duas abordagens diferentes, corte e montagem (o que pode afetar a resolução e detalhes durante a análise microscópica), e bloqueio (para evitar falsos positivos e reduzir o fundo)14. Outras características importantes são a especificidade do anticorpo e a seletividade e reprodutibilidade de protocolos individuais de IHC. A chave para fornecer a especificidade do anticorpo é o uso de controles negativos (incluindo sem anticorpos primários ou tecido que é conhecido por não expressar as proteínas-alvo), bem como controles positivos (incluindo o tecido que é conhecido por expressar as proteínas-alvo)15 . A seleção de anticorpos para IHC é feita com base em sua espécie-especificidade (a probabilidade com que reagem com o antígeno de interesse) e os sistemas de detecção de ligação antígeno-anticorpo que é usado4,5,6 ,7. No caso da imunoperoxidase, a cor da reação é determinada pela seleção do cromogénio precipitante, geralmente diaminobenzidina (marrom)16. Por outro lado, immunofluorescência utiliza anticorpos conjugados com um fluorophor para visualizar a expressão protéica em secções de tecido congelado e permite uma análise fácil de múltiplas proteínas em relação ao sistema de detecção cromogênica 5. º , o 7.

Na técnica da imunoperoxidase, o anticorpo secundário é conjugado à biotina, uma molécula de vinculador capaz de recrutar uma molécula de repórter cromogênica [complexo avidina-biotina (ABC)], levando à amplificação do sinal de coloração. Com o método do repórter do ABC, a enzima peroxidase reage com 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB), produzindo uma mancha intensamente marrom-colorida onde a enzima se liga ao anticorpo secundário, que pode então ser analisado com um microscópio claro ordinário. A coloração do ABC, devido à alta afinidade da avidina para a biotina, produz uma reação rápida e ótima, com poucos anticorpos secundários anexados ao local da reatividade do anticorpo primário. Este método de detecção cromogênica permite a análise densitométrica do sinal, fornecendo dados semiquantitativos baseados na correlação de níveis de sinal marrom com níveis de expressão protéica18.

Com técnicas da imunofluorescência, a deteção simultânea de proteínas múltiplas é possível devido à habilidade de fluorochromes diferentes emitir a luz em comprimentos de onda originais, mas é importante escolher fluorochromes com cuidado para minimizar a sobreposição espectral 5. Além disso, a utilização de anticorpos primários em diferentes espécies hospedeiras minimiza as dificuldades em relação à reatividade cruzada. Neste caso, cada anticorpo secundário espécie-específico reconhece somente um tipo de anticorpo preliminar. Os repórteres fluorescentes são moléculas orgânicas pequenas, incluindo derivados comerciais, tais como tinturas de Alexa fluor.

Muitos modelos animais são usados para compreender circunstâncias fisiológicas e patológicas particulares. Até o momento, estabelece-se que muitas vias metabólicas são conservadas ao longo da evolução. Conseqüentemente, os estudos de IHC em organismos modelo tais como o zebrafish podem fornecer a introspecção na génese e na manutenção de circunstâncias patológicas e não-patológicas17. É um objetivo deste relatório ilustrar protocolos de IHC que podem ser executados no tecido adulto do zebrafish e ser usados para obter imagens detalhadas da distribuição e da localização de OXA, de OX-2R, e de CB1R em níveis periféricos e centrais. Também são relatados protocolos para a aplicação de dois principais métodos indiretos de IHC em tecidos periféricos e centrais de zebrafish adulto. Descrito é o método indireto, que permite a amplificação do sinal nos casos onde um anticorpo secundário é conjugado a um corante fluorescente (método da imunofluorescência) ou ao repórter da enzima (método do immunoperoxidase). Os métodos de detecção cromogênico e fluorescente possuem vantagens e desvantagens. Relatado neste protocolo é o uso de IHC, principalmente a imunofluorescência, em zebrafish adulto, um modelo animal amplamente utilizado para estudar sistemas que são evolutivos conservadas em diferentes condições fisiológicas e patológicas.

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Protocolo

1. protocolo de imunoperoxidase

Nota: o zebrafish foi obtido pelo Prof. Omid Safari (departamento de pescas, faculdade de recursos naturais e meio ambiente, Universidade Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Irã)10.

  1. Dissecção tecidual
    1. Sacrifique o zebrafish por submersão em água gelada (5 partes de gelo/1 parte de água, 4 ° c); deixá-los até a cessação de todo o movimento para garantir a morte por hipóxia.
    2. Remova rapidamente o intestino e o cérebro com o seguinte método de dissecção:
      1. Seque o peixe em uma toalha de papel e colocá-lo sagital em uma esteira de dissecação, bloqueando a parte ventral do soquete do olho e parte carnuda da cauda.
      2. Para o intestino: corte a pele e Retire cuidadosamente a pele e músculo subjacente do lado do peixe até que os órgãos internos são visíveis. Retire o intestino da cavidade do corpo esticando-o para fora.
      3. Para o cérebro: Retire a cabeça com uma lâmina de barbear. Retire o tecido mole do lado ventral do crânio com fórceps. Abra o crânio e retire o osso do lado ventral do cérebro. Retire a pele e os ossos do crânio do lado dorsal do cérebro. Retire o cérebro.
  2. Fixação do tecido
    1. Fixar os tecidos de dissecação por imersão em fresco 4% paraformaldeyde (PFA) em tampão fosfato (PB, pH 7,4, 4 ° c) para 3 h à temperatura ambiente (RT).
      1. Prepare 0,1 M PB dissolvendo 1,755 g de NaH2po4H2O e 4,575 g de na2HPO4 em 450 ml de água destilada (DH2o), e ajuste a um pH de 7,4 com a quantidade necessária de NaOH 1N.
      2. Prepare 4% de PFA dissolvendo 4 g de PFA em 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4) por agitação em uma placa de calor. Quando uma temperatura de 60 ° c é alcançada, adicione 2-4 gotas de NaOH 1N para obter uma solução clara. Esquerda PFA 4% em RT e controlar o pH. Ajuste o pH para 7,4.
        Nota: a fixação do tecido por mais de 4 – 6 h pode levar à sobrefixação, que mascara antígenos, limitando o anticorpo-epítopo obrigatório. O tempo de fixação depende do tamanho do tecido.
  3. Incorporação de tecidos
    1. Enxágüe os tecidos 5x por 5 min cada, por imersão em 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Desidrata os tecidos por imersão subsequente em álcool 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min) e 100% (1 min).
    3. Esclarecer os tecidos por imersão em álcool 100%: xileno (1:1) por 10 min, depois 2x em xileno por 5 min cada.
    4. Infiltrar os tecidos com cera de parafina (56 ° c) duas vezes por 1 h cada por imersão direta em parafina.
    5. Incorporar os tecidos em blocos de parafina à temperatura ambiente (RT) e armazenar em RT até o corte.
  4. Corte do tecido
    1. Corte os tecidos em secções coronal ou sagital com 8 μm de espessura com um micrótomo, e recolher as secções em série alternativa em lâminas de vidro adesivo sobre a água e aquecido a 38 ° c.
    2. Seque as lâminas com secções a 37 ° c durante a noite.
  5. Desparaffinization e reidratação de seções do tecido
    1. Depilar as secções por imersão em xileno durante 5 min seguida de imersão em xileno durante 3 min.
    2. Rehidrate as secções por imersão subsequente em álcool 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), em seguida, coloque as lâminas em dH2o (5 min).
      Nota: depilar completamente as secções antes de iniciar a reacção. Se as secções ainda tiverem vestígios de parafina, realize uma imersão adicional em xileno durante 5 minutos ou mais.
  6. Recuperação do antígeno
    1. Trate as secções com tampão citrato (0, 1 M, pH 6,0), imersando as lâminas na solução e aquecimento num forno de microondas durante 5 min a potência máxima.
    2. Deixe as seções esfriar.
    3. Repita o ciclo de 5 min no microondas na potência máxima para completar a recuperação do antígeno.
      1. Prepare o tampão do citrato (0, 1 M, pH 6,0) dissolvendo 2,10 g de ácido cítrico em 100 mL de dH2o e 5,882 g de citrato de sódio em 200 ml de DH2o. Misture o citrato de sódio (0, 1 m) com ácido cítrico (0, 1 m) a uma proporção de 1:4 por volume e ajuste o pH para 6 usando HCl 0.1 N.
  7. Bloqueio da peroxidase endógena
    1. Delimate a área do tecido nas corrediças com uma pena solvente-resistente.
    2. Enxágüe as secções 3 vezes, 5 min cada, com solução salina tampão Tris (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Prepare 0,1 M TBS dissolvendo 12,1 g de base de trizma e 9 g de NaCl em 950 mL de dH2O e ajuste para pH 7,3 com HCl 0,1 n.
    3. Bloquear a atividade endógena de peroxidase por lâminas de imersão em uma solução de 0,75% H2O2 por 5 min em RT.
      1. Prepare a solução 0,75% H2o2 dissolvendo 5 ml de 30% h2o2 em 195 ml de DH2o.
        Nota: as enzimas ndogenous podem reagir com reagentes de IHC e produzir resultados falsos positivos. Além disso, os tecidos altamente vascularizados expressam muitas peroxidase endógena, o que pode levar a intensa coloração inespecífica e níveis de fundo. O tratamento com 0,75% H2O2 extinches a peroxidase endógena e reduz significativamente o fundo inespecífico.
  8. Bloqueio de inespecíficos Bindi locais de NG e permeabilização de tecidos
    1. Incubar as secções teciduais com o tampão de bloqueio TBS/0.4% Triton (TBS-T), contendo o antisoro primário (NRS), durante 30 min em RT para bloquear sítios de ligação não específicos.
      1. Prepare 0,4% Triton dissolvendo 0,4 mL de Triton X-100 em 100 mL de TBS.
      2. Prepare a solução TBS-T tampão de bloqueio dissolvendo 1% de soro normal em TBS contendo 0,4% de Triton X-100 (1 mL de soro normal + 8,2 mL de TBS + 0,8 mL de 0,48 Triton X-100).
        Nota: selecione as espécies do soro animal dependendo do hospedeiro do anticorpo secundário (por exemplo, ao usar um anticorpo secundário de cabra Anticoelho, use soro de cabra normal).
  9. Incubação tecidual com anticorpo primário
    1. Incubar as secções durante a noite numa caixa húmida em RT com anticorpos primários diluídos em TBS-T. Manchar as secções com o seguinte anticorpo primário:
      1. O anticorpo da cabra de encontro ao OX-2R diluiu 1:200, que reconhece o C-terminal da proteína.
      2. O anticorpo da cabra de encontro a OX-A diluiu 1:200 [orexin-A (C-19)], que reconhece o C-terminal da proteína.
        Nota: Assegure-se de que o anticorpo primário reage com a biomolécula de interesse. Definir com qual epítopo da biomolécula o anticorpo primário reage usando o alinhamento do gene. Por exemplo, o epítopo OX-A foi mapeado entre o AA 50 – 100 do boi-A humano (O43612) enquanto o epítopo de OX-2R foi mapeado perto da última 50 AA no C-terminal do ser humano.
  10. Incubação tecidual com anticorpo secundário
    1. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubar as secções para 1,5 h em RT com anticorpo secundário biotinilado e imunoglobulina anticabra de coelho (H + L) conjugada com biotina e, em seguida, diluir 1:100 em TBS-T.
      Nota: teste e encontre as diferentes diluições de ambos os anticorpos primários e secundários para encontrar a diluição ideal que permite a redução do fundo.
  11. Reação de peroxidase
    1. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubar as secções com complexo de avidina-biotina (ABC) durante 1 h.
      1. Prepare a solução ABC acrescentando duas gotas de componente A seguidas por duas gotas do componente B em 5 mL de TBS.
    3. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Trate as secções com o substrato de cromogénio 3, 3 '-diaminobenzidina-4 (DAB).
      1. Prepare a solução DAB adicionando uma gota (aproximadamente 30 μL) de concentrado de cromogénio DAB a 1 mL de diluente DAB e misture bem antes da utilização.
        Nota: Prepare a solução ABC pelo menos 30 min antes de utilizar e mantenha o complexo a 4 ° c até ser utilizado para permitir a ligação estável de avidina/biotina. Prepare a solução de trabalho fresca do DAB, aplique às seções do tecido, e torne-se até que a cor seja apropriada. Quando a reação cromogênica converte os sítios de epítopo em uma cor marrom e a intensidade do sinal é apropriada para a imagem, prossiga para o próximo passo. O tempo de desenvolvimento DAB pode variar de alguns segundos a 10 min. Para OX-A e OX-2R 1,2 min é suficiente. Manuseie DAB com cuidado, pois é carcinogénico.
  12. Desidratação e montagem do tecido
    1. Enxague todas as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M TBS (pH 7,3) para interromper a reacção DAB.
    2. Desidratar as secções por slides subsequentes imersão em álcool 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Esclarecer as fatias por imersão 2x em xileno 10 min cada.
    4. Monte as seções com o lamínula de DPX (xileno do Phthalate do Dibutyl) para a histologia, adicionando duas gotas da mídia de montagem às corrediças e da cobertura lentamente com os COVERSLIP.
      Nota: uma vez que a imersão do tecido em concentrações crescentes de álcool durante a desidratação resulta em penetração de álcool de tecido e substituição de água com álcool, determinar um tempo preciso de desidratação e não mais desidratar os tecidos. Realize a imersão em xileno após a desidratação para esclarecer o tecido e remover qualquer excesso ou restante de álcool.
  13. Controles
    1. Repita as secções 1.1 – 1.12, omitindo o anticorpo primário e/ou substituindo o anticorpo primário ou o anticorpo secundário IgG por TBS (controlos negativos).
    2. Repita as secções 1.1 – 1.12 pré-absorvendo cada anticorpo primário com um excesso do peptídeo relativo (100 mg de peptídeo/1 mL de antisoro diluído).
    3. Repita as secções 1.1 – 1.12 utilizando tecido diferente como controlo positivo (por exemplo, tecido do rato).
      Nota: Prepare todos os buffers frescos, pouco antes de iniciar. Retire cuidadosamente o excesso de fluido em cada passo com uma pipeta ou papel de filtro em torno das secções, mantendo sempre as secções molhadas.
  14. Aquisição e análise de imagens
    1. Adquira imagens digitais iluminação de luz constante e com a mesma ampliação usando um microscópio equipado com uma câmera digital.
    2. Realize uma análise semiquantitativa da intensidade de coloração usando o software de imagem (vide tabela de materiais).
      1. Abra as imagens capturadas, no formato de arquivo. LIF ou. TIFF, para avaliar índices de positividade OX-A ou OX2-R.
      2. Selecione o botão medida e clique no manual counting. Conte o número de perfis de células manchadas diretamente da tela, colocando uma marca em células positivas clicando no mouse.
      3. Selecione uma área de região de interesse (ROI) (3 x 103 μm2) para quantificar a densidade do imunosinal (densidade óptica, OD).
      4. Determine o pixel com a intensidade mais alta (positivo alto) e a menor intensidade (negativa) dentro da imagem analisada para atribuir o zero como o valor do fundo (ou seja, uma porção de tecido desprovido de células manchadas).
      5. Avalie a OD trabalhando em uma escala logarítmica de absorvância. Na análise de imagem digital, a intensidade do pixel DAB varia do tom mais escuro (0 valor) ao mais leve (valor de 255).
      6. Determine o OD traçando um histograma do seguinte: log10(255/i), onde "i" é o valor de intensidade de pixel dado pelo programa e determinado subtraindo o plano de fundo.
        Nota: a reação permanente e estável da imunoperoxidase pode ser analisada um microscópio do brilhante-campo a qualquer hora. Execute a contagem de células rotuladas na seção alternativa para evitar a contagem dupla da mesma célula de seções adjacentes.

2. protocolo de imunofluorescência

  1. Dissecção tecidual
    1. Sacrifique e dissecar os animais conforme descrito na secção 1,1.
  2. Fixação do tecido
    1. Fixar o intestino e cérebro por imersão por 3 h em 4% PFA a 4 ° c.
      1. Preparar PB e 4% PFA como na secção 1.2.1.
        Nota: o tempo de fixação depende do tamanho do tecido. A fixação do tecido por mais de 4 – 6 h pode levar à superfixação, que mascara antígenos e limita o anticorpo-epítopo obrigatório.
  3. Incorporação de tecidos
    1. Enxágüe os tecidos 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Para a crio-proteção, transfira os tecidos para 20% de sacarose em PB (0,1 M, pH 7,4) e mantenha durante a noite a 4 ° c. Em seguida, transfira os tecidos para 30% de sacarose em 0,1 M PB (pH 7,4) e mantenha-se por uma noite adicional a 4 ° c.
    3. Incorpore os tecidos em um bloco de composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para fazer isso, prepare um pequeno Dewar de nitrogênio líquido, pegue a folha de alumínio, e cortá-lo ao meio para criar uma panela. A panela contendo os tecidos preenchidos com o composto de OCT deve ser mergulhada no nitrogênio líquido até que o composto de OCT seja resfriado. Os tecidos congelados podem ser armazenados a-80 ° c até o seccionamento.
  4. Corte do tecido
    1. Transfira os blocos de tecido congelado para um criostat a-20 ° c e corte em secções coronal ou sagital de 10 μm.
    2. Colete os tecidos em seções seriais alternadas em corrediças de vidro adesivas apropriadas para immunohistochemistry e armazene-as em-20 ° c até o uso.
      Nota: armazene slides entre-20 ° c e 4 ° c em uma caixa de slide escura ou em um slide book.
  5. Bloqueio de sítios de ligação não específicos e permeabilizzação tecidual
    1. Demarcar a área do tecido no slide com uma caneta resistente a solventes.
    2. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Incubar as seções com soro de burro normal de 1% dissolvido no tampão de permeabilização PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) por 30 min em RT para permeabilizar a membrana celular e bloquear os sítios de ligação não específicos.
      1. Prepare Triton X-100 0,3% dissolvendo 0,3 mL de Triton X-100 em 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Prepare a solução de bloqueio dissolvendo 1% de soro de burro normal em PB contendo 0,3% de TritonX-100.
        Nota: as espécies animais do soro utilizado nos amortecedores de permeabilização e bloqueio dependem do hospedeiro do anticorpo secundário.
  6. Incubação com mistura de anticorpos primários
    1. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Incubar as secções durante a noite numa caixa húmida em RT com uma mistura de anticorpos primários diluídos em PB-T. As seguintes misturas de anticorpos preliminares podem ser usadas: o anticorpo da cabra de encontro ao boi-2R diluiu o anticorpo 1:100/Rabbit de encontro a CB1R diluído 1:100, ou o anticorpo da cabra de encontro ao OX-A diluiu o anticorpo 1:100/Rabbit de encontro A CB1R diluído 1:100.
  7. Incubação com mistura de anticorpos secundários
    1. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Incubar as seções para 2 h em RT com 1) uma mistura de burro anti-coelho Alexa fluor 488-conjugado anticorpo secundário e burro anti-cabra Alexa fluor 594-conjugado anticorpo secundário diluído 1:100 em PB-T; ou 2) uma mistura de burro anti-cabra Alexa fluor 488-conjugated anticorpo secundário e burro anti-coelho Alexa fluor 594-conjugado anticorpo secundário diluído 1:100 em PB-T.
      Nota: Use anticorpos secundários desenvolvidos no mesmo hospedeiro animal. O soro normal deve pertencer à mesma espécie do anticorpo secundário (por exemplo, usar anticorpos secundários desenvolvidos no burro e um soro normal do burro). Diluir os anticorpos primários e secundários com tampão de bloqueio contendo o detergente para aumentar a permeabilização celular e reduzir o fundo.
  8. Montagem do tecido
    1. Enxague as secções 3x durante 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Neutralizar as secções com corante nuclear DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) preparados dissolvendo 1,5 μL de DAPI (1 mg/mL) em 3 mL de PB.
    3. Escorregas corrediças com meio de montagem (ver tabela de materiais). Este meio aquoso da montagem estabiliza a amostra e as manchas do tecido para o uso a longo prazo. As amostras fluorescentes podem ser armazenadas no escuro a 4 ° c. Para prolongar a vida dos fluorofores, use um meio de montagem antialimentado.
      Nota: escolha um bom meio de montagem. Um dos parâmetros mais importantes dos agentes de montagem é o índice de refração (nD), que deve ser em torno de 1,5, o índice de refração de vidro. O meio de montagem utilizado aqui pode ser usado especialmente com amostra preparada para determinações enzimáticas e lipídicas (i.e., espécime que não deve ser desidratado com uma série ascendente de álcool).
  9. Controles
    1. Repita as secções 2.1 – 2.8, omitindo o anticorpo primário ou secundário, ou substituindo na etapa específica os antisoros primários ou secundários com PB (controlo negativo).
    2. Repita as secções 2.1 – 2.8, pré-absorvendo cada anticorpo primário com um excesso do peptídeo relativo (100 mg de peptídeo/1 mL de antisoro diluído).
    3. Repita as secções 2.1 – 2.8 em fatias de cérebro do rato (controlo positivo).
      Nota: Prepare todos os buffers frescos, pouco antes de iniciar. Retire o excesso de fluido cuidadosamente em cada passo com uma pipeta ou papel de filtro em torno das secções, mantendo sempre a secção húmida.
  10. Aquisição de imagem
    1. Use um microscópio confocal equipado com um estágio motorizado x-y-z, uma câmera digital, e um software da análise da aquisição e da imagem tal como NIS-elementos C para observar e analisar as seções imuno-manchadas. Adquira imagens digitais usando os objetivos 5-20-40x.
    2. Pegue as imagens de cada seção em baixa ampliação (10x ou 20x objetivo) em cada um dos canais disponíveis para compor uma montagem de baixa ampliação, proporcionando uma visão geral de toda a região para facilitar a localização e documentação do OX-2R/CB1R coexpressão anatômica. Normalize as imagens de fluorescência para o contraste máximo e sobreposição antes da análise.
    3. Colete serial Z-pilhas de imagens em toda a área de interesse. Adquira as imagens através de seis planos focais (Z-Step) com passos focais de 1 – 1,8 μm para cobrir o volume tecidual em que a coexpressão OX-2R/CB1R é visualizada como puncta amarela. Para fazer esta coleção para cada canal (vermelho, verde, azul) separadamente, usando um microscópio Z-motorizado.
    4. Use um software deconvolução de imagem para destransformar imagens por aplicação de dez iterações e recolher as imagens de planos Z serial em uma única imagem de projeção máxima.
    5. Ajuste as micrografias para luz e contraste usando o Adobe Photoshop 6, 1 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      Nota: Realize a etapa de deconvolução durante a observação para diminuir ainda mais o fundo. Limite a exposição da corrediça à luz para impedir o photobranqueamento.
  11. Análise de imagem
    1. Realizar análise quantitativa da coexpressão OX-2R/CB1R em seções alternadas de 10 μm de espessura (n = 5 animais por grupo) cobrindo toda a região de interesse de cada animal.
    2. Quantificar a coexpressão OX-2R/CB1R como número de puncta positivo amarelo com um sistema semiautomatizado de análise de imagem. O software imagins pode fornecer um nível mais alto de detalhamento, com dados quantitativos sobre as regiões de sobreposição entre diferentes sondas fluorescentes.
    3. Quantifique o puncta usando ferramentas de limiarização para a intensidade do sinal nos dois canais. Abra o arquivo de imagens. Liff,. TIFF ou. jpg e selecione imagem – limiar. Selecione configuração automática ou método manual e regule o limiar até que todos os puncta manchados são selecionados. Analise a distribuição das intensidades de pixel em uma área da imagem que não contenha objetos imunolabelados para obter o limite de fundo. Determine esse plano de fundo individualmente para cada imagem. O programa, em seguida, remove o limite de fundo definindo a linha de base de intensidades de pixel para o valor de plano de fundo.
    4. Selecione analisar – medir e escolha os parâmetros a serem medidos (intensidade do puncta-mínimo, máximo e valores médios; número/densidade do puncta com).
    5. Conte a puncta amarela ao longo do volume do tecido em 4 pilhas Z para cada seção, usando as pilhas imediatamente acima ou abaixo para o melhor plano de foco. Exclua as regiões fora de foco da análise.
      Observação: executar a contagem de células rotuladas na seção alternativa para evitar a contagem dupla das mesmas células de seções adjacents.

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Resultados

Os dados representativos para a coloração da imunoperoxidase são mostrados na Figura 1 e na Figura 2. A análise de immunohistochemical da distribuição de OX-A e de OX-2R no intestino do zebrafish adulto mostrou locais diferentes da localização de OX-A e de OX-2R e seus aumentos na expressão nas pilhas intestinais do zebrafish do DIO. Observou-se coloração marrom intensa para OX-a nas células do intestino medial e anterior (Figura 1a...

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Discussão

Preparação da amostra

A preparação da amostra é o primeiro passo crítico no IHC. Um protocolo confiável permite A manutenção da morfologia celular, da arquitetura tecidual e da antigenicidade. Esta etapa exige a coleção, a fixação, e o seccionamento corretos do tecido22,23. A finalidade da fixação é preservar o tecido e reduzir a ação de enzimas ou de micro-organismos do tecido. Em particular, a etapa de fixação...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universidade de Sannio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti CB1Abcamab23703
Anti OX-2RSanta Cruzsc-8074
Anti-OXASanta Cruzsc8070
AquatexMerck1.085.620.050
Coelho biotinilado anti-cabraVector LabBA-5000
ácido cítricoSigma Aldrich251275
Microscópio confocalNikonNikon Eclipse Ti2
CriostatoLeica BiosystemCM3050S
DAPISigma Aldrich32670
Câmera DigitalLeica BiosystemDFC320
Câmera Digital para microscópio confocalNikonDS-Qi2
Burro anti cabra Alexa fluor 488-conjugado secundário anticorposThermo FisherA11055
Anticorpos secundários conjugados com fluor 594 anti-cabra AlexaThermo FisherA11058
Anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor 488 anti-coelhoThermo FisherA21206
Anticorpos secundários conjugados com fluor 594 anti-coelhoAlexa Thermo FisherA21207
Etanol absolutoVWR20.821.330
Composto de seção congeladaLeica BiosystemFSC 22 Mídia
H2O2Sigma Aldrich31642
HClVWR20.252.290
ImmPACT DABLaboratório vetorialSK4105
MicroscópioLeica BiosystemDMI6000
MicrótomoLeica BiosystemRM2125RT
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS7653
NaH2PO4H2OSigma AldrichS9638
NaOHSigma AldrichS8045
Soro de burro normalSigma AldrichD9663
Soro de coelho normalLaboratório vetorialS-5000
cera de parafinaCarlo Erba46793801
ParaphormaldeydeSigma AldrichP6148
citrato de sódio di-hidratadoSigma AldrichW302600
Triton X-100Fluka Analytical93420
TrizmaSigma AldrichT1503
VectaStain Elite ABC KitVector labPK6100
Xileno PuroCarlo Erba392603
de seção congelada

Referências

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Identificação de receptores de Orexin e endocanabinoides em zebrafish adulto usando métodos de imunoperoxidase e imunofluorescência
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