Este protocolo permite a conversão rápida e eficiente de pilhas de haste pluripotentes induzidas em neurônios de motor com uma identidade espinal ou craniana, pela expressão ectópica de fatores da transcrição dos vetores induzível de piggybac.
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Artigo de método
Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós descrevemos aqui um método para obter os neurônios de motor espinal e craniano funcionais das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs). A conversão direta no neurônio motor é obtida por expressão ectópica de módulos alternativos de fatores de transcrição, ou seja, Ngn2, Isl1 e Lhx3 (Nil) ou Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). Nil e Nip especificam, respectivamente, a identidade da coluna vertebral e do neurônio motor craniano. Nosso protocolo começa com a geração de linhas iPSC modificadas nas quais NIL ou NIP estão estavelmente integrados no genoma através de um vetor de Transposon piggyBac. A expressão dos transgenes é então induzida por doxiciclina e leva, em 5 dias, à conversão de iPSCs em progenitores MN. A maturação subsequente, por 7 dias, leva a populações homogêneas de MNs espinhais ou cranianos. Nosso método tem várias vantagens em relação aos protocolos anteriores: é extremamente rápido e simplificado; Não requer infecção viral ou mais isolamento MN; permite gerar diferentes subpopulações de MN (espinal e craniana) com um grau notável de maturação, como demonstrado pela capacidade de disparar trens de potenciais de ação. Além disso, um grande número de neurônios motores pode ser obtido sem purificação de populações mistas. os neurônios de motor espinal e craniano derivado de IPSC podem ser usados para in vitro a modelagem da esclerose lateral amyotrophic e de outras doenças neurodegenerativas do neurônio de motor. Populações de neurônios motores homogêneos podem representar um recurso importante para a triagem de drogas específicas do tipo celular.
Introdução
A degeneração do neurônio motor (MN) desempenha um papel causador nas doenças humanas, como a esclerose lateral amiotrófica (ALS) e a atrofia muscular espinhal (SMA). O estabelecimento de sistemas de modelos celulares in vitro adequados, que recapitulam a complexidade do MN humano, é um passo importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que são dotadas de notáveis Propriedades de diferenciação plurilinhagem, já foram derivadas de um número de pacientes acometidos por doenças do neurónios motores1,2. Linhas adicionais de iPSC portadores de mutações patogênicas associadas a doenças de MN foram geradas pela edição gênica, a partir do controle de células-tronco pluripotentes "saudáveis"3. Estas linhas representam ferramentas úteis para a modelagem in vitro da doença e a triagem de fármacos, desde que estejam disponíveis métodos adequados para a diferenciação de iPSC em MNs. A justificativa por trás do desenvolvimento deste método é fornecer à comunidade científica interessada em doenças MN com um protocolo de diferenciação rápido e eficiente, dando origem a MNs funcionais maduros. A primeira vantagem desse método é seu cronograma de execução. Outro ponto de força relevante vem da eliminação de qualquer etapa de purificação. Finalmente, o protocolo pode ser usado para gerar duas populações distintas de neurônios motores.
A possibilidade de gerar diferentes subtipos de MNs é particularmente relevante para a modelagem de doenças de MN. Nem todos os subtipos de MN são igualmente vulneráveis em ALS e SMA e o aparecimento de sintomas em diferentes unidades motoras influencia consideravelmente o prognóstico. No ALS, o início espinal com sintomas que começam em membros superiores e mais baixos conduz à morte em aproximadamente 3-5 anos4. Inversamente, o início bulbar, começando com a degeneração de MNs cranianos, tem um prognóstico mais mau. Além disso, a porcentagem do início bulbar é significativamente mais elevada nos pacientes com mutações nas proteínas do RNA-ligação FUS e TDP-43 do que nos indivíduos com mutações SOD15. Quase a totalidade dos protocolos alternativos de diferenciação de MN se baseia na atividade do ácido retinóico (ar), que confere um caráter espinhal para diferenciar iPSCs6,7,8. Isso limita a possibilidade de estudo de fatores intrínsecos, que podem ser protetores em subtipos específicos de Mn9,10.
Consistente com um trabalho precedente em pilhas de haste embrionárias do rato11, nós mostramos recentemente que na expressão ectópica dos iPSCs humanos de Ngn2, de Isl1 e de Lhx3 (Nil) induz uma identidade espinal do MN, quando Ngn2 e Isl1 mais Phox2a (NIP) especific MNScranianos 12. Desenvolvemos, portanto, um protocolo eficiente, levando à produção de MNs humanos dotados de propriedades funcionais em uma reviravolta de 12 dias. O objetivo deste método é obter, em um curto espaço de tempo e sem a necessidade de purificação (por exemplo, por FACS), populações de células altamente enriquecidas para MNs com identidade espinhal ou craniana.
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Protocolo
1. manutenção de iPSCs humanos
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Preparação de placas revestidas com matriz
- Descongelar um frasco de 5 mL de matriz (ver tabela de materiais) a 4 ° c durante a noite. Os estoques originais da matriz vêm em concentrações de estoque diferentes e as alíquotas são feitas de acordo com o fator de diluição indicado na folha de dados, específico para o lote individual. É importante manter o tubo de ensaio e os tubos frios para evitar o gelamento prematuro da matriz. Distribua a matriz em alíquotas em crimpetes pré-refrigerados no gelo. Congelar alíquotas não utilizadas a-20 ° c.
- Coloque uma alíquota no gelo por cerca de 2 h para descongelar.
- Diluir a alíquota da matriz com 20 mL de DMEM/F12 frio em um tubo cônico de 50 mL.
- Misture bem e dispense 1 mL de matriz diluída em pratos de 35 mm (quantidades equivalentes por área de superfície de outros pratos).
- Mantenha os pratos contendo a matriz diluída por 1 h à temperatura ambiente para permitir o revestimento.
Nota: Os pratos, selados com parafilm, podem ser armazenados em 4 ° c por até 2 semanas.
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Preparação da solução de estoque (20 ml) e alíquotas de trabalho 1x do reagente de dissociação de células suaves (ver tabela de materiais).
- Dissolva o pó em 10 mg/mL em PBS (CA2 +/mg2 + Free).
- Filtrar esterilizar através de uma membrana de filtro de 0,22 μm.
- Prepare 20 alíquotas (1 mL cada) e armazene a-20 ° c.
- Antes de utilizar, diluir uma alíquota em PBS (CA2 +/mg2 + Free) para 1 mg/ml (1x alíquotas de trabalho).
Nota: as alíquotas de trabalho 1x podem ser armazenadas em 4 ° c por até 2 semanas.
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Passaging iPSCs humanos.
- Antes de iniciar: se armazenado a 4 ° c, pré-aqueça as placas revestidas com matriz na incubadora a 37 ° c durante 20-30 min. pré-aqueça à temperatura ambiente a quantidade de meio iPSC humano (ver tabela de materiais) necessário. Pré-aqueça o DMEM/F12.
- Aspirar meio de cultura.
- Enxaguar iPSCs com PBS (CA2 +/mg2 + livre).
- Adicionar 1x solução de dissociação suave (0,5 mL para um prato de 35 mm). Incubar em 37 ° c até que as bordas das colônias comecem a se separar da placa, geralmente 3-5 min.
- Aspirar a solução de dissociação suave, tendo o cuidado de não separar colônias de iPSC.
- Lave as células com DMEM/F12 (2 mL para um prato de 35 mm) e aspirar a ter cuidado para não separar as células. Repita este passo mais uma vez.
- Adicionar meio iPSC humano (1 mL para um prato de 35 mm).
- Retire suavemente as colônias com um levantador de células e transfira para um tubo de 15 mL.
- Quebre suavemente os grupos de células introduzindo pipetagem para cima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
- Aspirar o sobrenadante da placa (s) revestida com matriz.
- Semente as pilhas no volume apropriado da cultura do meio iPSC humano. A relação dividida pode variar de linha para linha e é de cerca de 1:4-1:8. Mude o meio diariamente.
2. geração de NIL e NIP inducible iPSC linhas
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Transfecção celular.
- Enxague as células com PBS (CA2 +/mg2 + Free).
- Adicionar reagente de dissociação de células (ver tabela de materiais) (0,35 ml para um prato de 35 mm) e incubar a 37 ° c até que as células individuais sejam separadas (5-10 min).
- Termine delicadamente a separação da pilha introduzindo com pipting acima e para baixo com um pipetador P1000 3-4 vezes.
- Colete em um tubo de 15 mL e adicione PBS (CA2 +/mg2 + Free) a 10 ml. Conte as células.
- Pellet 106 células e ressuspender em 100 μl de tampão R (incluído no kit de electroporação celular, ver tabela de materiais).
- Adicione o ADN do plasmídeo para o transfection: 4,5 μg do vetor transponíveis (EPB-BSD-TT-nil ou EPB-BSD-TT-Nip12) e 0,5 μg do plasmídeo13do transposase do piggybac.
- Transfect com o sistema da electroporação da pilha (veja a tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante e como descrito previamente3 com os seguintes parâmetros: tensão de 1.200 V, largura de 30 ms, 1 pulso. Propagar as células em meio iPSC humano suplementado com 10 μM Y-27632 (inibidor de rocha, ver tabela de materiais) em um prato revestido por matriz de 6 mm.
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Seleção com antibióticos.
- Dois dias após o transfection, adicionam 5 μg/mL de blasticidina ao meio de cultura.
- A maioria das pilhas non-transfected morrerão dentro de 48 h da seleção do blasticidina. Mantenha as células em blasticidina por pelo menos 7-10 dias para Counter-Select as células que não integraram os transgenes no genoma.
- Mantenha pilhas estàvel transfected como uma população misturada, compor das pilhas com número diferente de transgenes e de locais diferentes da integração, ou isole únicos clones.
- Prepare um prato adicional para verificar a expressão efetiva dos transgenes, após 1 μg/mL de indução de doxiciclina, por RT-PCR com primers transgênicos específicos para Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Reverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), como descrito previamente12.
- Nesta fase, congelar estoques da novela NIL-e NIP-iPSC linhas em meio congelante para iPSCs humanos (ver tabela de materiais).
3. diferenciação do Neuron motor
- Dissociar as células com reagente de dissociação celular conforme descrito (passos 2.1.1.-2.1.3.). Colete células dissociadas em um tubo de 15 mL e diluir com 5 volumes de DMEM/F12. Pellet as células e ressuscitação em meio iPSC humano suplementado com 10 μM de inibidor de rocha. Conte as células e sementes em pratos revestidos por matriz em uma densidade de 62.500 células/cm2.
- No dia seguinte, substitua o meio com DMEM/F12, suplementado com 1x analógico de L-glutamina estável, 1x não-essencial aminoácido (NEAA) suplemento de cultura celular e 0,5 x penicilina/estreptomicina, e contendo 1 μg/mL de doxiciclina. Isto é considerado como o dia 0 da diferenciação. No dia 1, atualize o meio e a doxiciclina.
- No dia 2, alterar o meio para Neurobasal/B27 médio (Neurobasal médio suplementado com 1x B27, 1x estável L-glutamina analógico, 1x NEAA e 0.5 x penicilina/estreptomicina), contendo 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 e 1 μg/mL doxiciclina (ver tabela de materiais ). Atualize o meio e doxiciclina todos os dias até o dia 5.
-
Dia 5: dissociação de células com reagente de dissociação celular (ver tabela de materiais).
- Enxague as células com PBS (CA2 +/mg2 + Free).
- Adicione o reagente da dissociação da pilha (0,35 ml para um prato de 35 milímetros) e incubar em 37 ° c até que o monocamada inteiro da pilha separa do prato. Observe que as células únicas não serão separadas durante a incubação.
- Adicionar 1 mL de DMEM/F12 e recolher as células num tubo de 15 mL.
- Termine delicadamente a separação da pilha introduzindo com pipting acima e para baixo com um pipetador P1000 10-15 vezes.
- Adicione 4 mL de DMEM/F12 e conte as células.
- Nesta fase, congelar os progenitores do neurônio motor no meio de congelação celular (ver tabela de materiais), de acordo com as instruções do fabricante.
- Pellet as células e ressuspender em meio neuronal (Neurobasal/B27 médio suplementado com 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF e 200 ng/mL de ácido L-ascórbico, ver tabela de materials) suplementado com 10 μm de inibidor de rocha.
- Semente as células em poli-ornitina/laminina-ou, alternativamente, em suportes revestidos por matriz na densidade de células 100.000/cm2. Use μ-slide suportes de plástico com polímero lamela (ver tabela de materiais) para a análise de imunocoloração.
- No dia 6, mude o meio com o meio neuronal fresco desprovido do inibidor da rocha. Nos próximos dias, refresque a metade do meio a cada 3 dias. O meio de cultura deve ser mudado muito com cuidado a fim impedir o destacamento da superfície.
4. análise de imunocoloração
- Fixação celular. Enxágüe as células com PBS (com CA2 +/mg2 +) e incubar por 15 min em 4% paraformaldeído em PBS (com CA2 +/mg2 +) à temperatura ambiente.
Cuidado: Paraformaldeído é tóxico e suspeito de causar câncer. Evite o contato com a pele e os olhos e manuseie uma capa de fumaça química. - Permeabilize com PBS (com CA2 +/mg2 +) contendo 0,1% Triton X-100 por 5 min em temperatura ambiente.
- Incubar durante 30 min em temperatura ambiente em solução de bloqueio de anticorpos (ABS: 3% BSA em PBS com CA2 +/mg2 +).
- Incubar durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos primários em ABS: TUJ1 (1:1000; coelho) e anti-Oct4 (1:200; rato) ou anti-CHAT (anti-colina acetiltransferase; 1:150; cabra). Ver tabela de materiais.
- Incubar por 45 min em temperatura ambiente com par de anticorpos secundários de burro apropriado em ABS: anti-mouse Alexa fluor 647 (1:250), anti-Rabbit Alexa fluor 594 (1:250) e anti-cabra Alexa fluor 488 (1:250). Ver tabela de materiais.
- Incubar em 0,4 μg/mL DAPI por 5 min à temperatura ambiente para rotular núcleos.
- Monte as pilhas com o meio de montagem (veja a tabela de materiais) para a imagem latente em um microscópio de fluorescência.
5. caracterização funcional via patch-Clamp Recordings
- Prepare a solução externa HEPES-equilibrada (NES) como seguindo: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 10 mm HEPES e 10 mm de glicose. Defina a osmolaridade entre 290-300 mΩ. Ajuste o pH para 7,3 usando NaOH 1N e armazene a solução a 4 ° c.
- Prepare a solução interna: 140 mM K-gluconato, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Ajuste o pH para 7,3 com KOH de 1M e verifique se a osmolaridade está definida em torno de 290 mΩ. Congelar a solução a-20 ° c em pequenas alíquotas.
- Antes de executar as experiências, aqueça previamente a solução de NES em um banho de água a aproximadamente 28-30 ° c.
- Puxe algumas Micropipetas de borosilicato (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) com uma resistência à ponta: 5-6 MΩ e encha com a solução intracelular antes de montar no suporte da pipeta.
Nota: Recorde aos fios de prata do cloreto do elétrodo da gravação e do elétrodo da referência no alvejante por pelo menos 30 minutos a fim formar uma camada uniforme de AgCl na superfície do fio. - Transfira o prato de Petri na câmara de gravação e deixe a câmara com a solução NES em 1-2 mL/min. Deixe o fluxo que passa através de um calefator inline ajustado na temperatura de 30 ° c a fim manter a solução morna.
- Coloque a câmara de gravação electrofisiológica um microscópio vertical. Registre correntes de membrana com o amplificador de braçadeira de remendo e adquira dados com um software apropriado.
- Abra o software de controle do amplificador, e ajuste o ganho do sinal no valor 1 e o filtro de Bessel em 10 quilohertz. Certifique-se de que o filtro Bessel é 2,5 vezes inferior à frequência de amostragem.
- Defina os protocolos experimentais para os experimentos de braçadeira de tensão e braçadeira de corrente no software de gravação.
- Na configuração do protocolo, marque o modo de estimulação episódica e defina a frequência de amostragem em 25 kHz. Em seguida, mova para a guia forma de onda e digite a tensão ou a amplitude e o comprimento da etapa atual como segue.
- Para as correntes de sódio tensão-gated, use 15 etapas da tensão (50 a duração da senhora cada) de-100 mV a + 40 mV (incremento de 10 mV). Execute o protocolo depois de impor à célula corrigida um potencial de retenção de-60 mV através do amplificador. Similarmente, as correntes de potássio tensão-gated são evocadas por etapas da tensão (250 a duração da senhora cada) de-30 mV a + 50 mV (incremento de 10 mV) que prende a pilha gravada a-40 mV.
- Para investigar as propriedades de queima de MNs derivadas de iPSC, células de pinça, em modo de braçadeira atual, em um potencial de membrana de-70 mV e usar 4 pulsos de corrente (1 s duração cada) de aumento de amplitude (de + 20 pA para + 80 pA; 20 PA incremento).
- Adquira para cada correntes tensão-ativadas da pilha, atividade de disparo evocada e três propriedades passivas como a capacitância da inteiro-pilha (cm), a resistência da membrana de pilha (RM) e o potencial de membrana de descanso (PGR).
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Resultados
Uma descrição esquemática do método de diferenciação é mostrada na Figura 1. Os iPSCs humanos (linha3do peso I) foram transfected com EPB-BSD-TT-nil ou EPB-BSD-TT-NIP, gerando, em cima da seleção do blasticidina, linhas de pilha estáveis e induzível12, doravante referidas como IPSC-nil e IPSC-NIP, respectivamente. As células diferenciadoras foram caracterizadas para a expressão do marcador de pluripotência OCT4 e do marcador Pan-neuronal TUJ1. ...
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Discussão
Este protocolo permite converter eficientemente iPSCs humanos em neurônios de motor espinal e craniano agradecimentos à expressão ectópica de factores linhagem-específicos da transcrição. Estes transgenes são induzível pelo doxiciclina e integrados estàvel no genoma agradecimentos a um vetor Transposon-baseado de piggybac. Em uma população mista, uma ou várias cópias do vetor piggyBac serão aleatoriamente integradas ao genoma de células individuais, aumentando o risco de alterações na integridade do genoma. Além disso, u...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer ao Imaging Facility do Center for Life nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, por suporte e assessoria técnica. Nós somos gratos aos membros do centro para a ciência Nano da vida para a discussão útil. Este trabalho foi apoiado parcialmente por uma concessão de AriSLA (concessão piloto 2016 "StressFUS") a AR.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Reagente de dissociação celular |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-colina acetiltransferase. Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_2079751; Número do lote: 2971003 |
| anti-cabra Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticorpo secundário usado para ensaios de immonofluorescência. RRID: AB_2534102; Número do lote: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Anticorpo secundário usado para ensaios de immonofluorescência. RRID: AB_162542; Número do lote: |
| 1757130 anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_398736; Número de lote: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. Número do lote: E0117 |
| anti-coelho Alexa Fluor 594 | Ciências Imunológicas | IS-20152-1 | Anticorpo secundário usado para ensaios de imunofluorescência |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Suplemento livre de soro para manutenção de células neuronais |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Meio de congelamento celular, usado aqui para progenitores de neurônios motores |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro |
| Blasticidina | Sigma-Aldrich | 203350 | Antibiótico nucleosídeo que inibe a síntese de proteínas em procariontes e eucariotos |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Albumina de soro bovino. Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunocoloração |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| Software Clampex 10 | Dispositivos | moleculares Clampex 10 | Sistema de registro de correntes de membrana |
| Corning Matrigel qualificado por hESC Matriz | Corning | 354277 | Preparação da membrana basal reconstituída a partir do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Usado para adesão de iPSC a suportes de plástico e vidro |
| CRYOSTEM ACF CONGELAMENTO MÍDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Meio de congelamento para iPSCs humanos |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| DAPI pó | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-fenilindol Mancha fluorescente que se liga à adenina– regiões ricas em timina no DNA usadas para coloração de núcleos em ensaios de immonofluorescência |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Inibidor da gama secretase |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagente para dissociação suave de iPSCs humanas |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Meio basal para cultura de células |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891-1G& nbsp; | Usado para induzir a expressão de transgenes dos vetores epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Linha iPSC humana comercial |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit para extração total de RNA de células eucarióticas cultivadas |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Fator Neurotrófico Derivado de Glial |
| Gibco Linha HiPSC Episomal | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Linha iPSC humana comercial |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Uma alternativa à L-glutamina com maior estabilidade. Melhora a saúde celular. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| iScript Transcrição Reversa Supermix para RT-qPCR | Kit de 1708841 Bio-Rad | para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real | |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Master mix de reação pronto para uso otimizado para PCR quantitativo baseado em corante (qPCR) em qualquer instrumento de PCR em tempo real |
| Produtos químicos K-Gluconato | Sigma-Aldrich | G4500 | para soluções eletrofisiológicas |
| Produtos químicos KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | para soluções eletrofisiológicas |
| Ácido L-ascórbico | LKT Laboratories | A7210 | Usado em cultura de células como antioxidante |
| Laminina | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro |
| Microscópio confocal de varredura a laser | Olympus | iX83 FluoView1200 | Microscópio confocal para aquisição de imagens de imunocoloração |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| Meio de montagem | Ibidi | 50001 | Solução de montagem utilizada para ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência |
| Amplificador de grampo de remendo multiclamp | Molecular Devices | 700B | Sistema de registo de correntes de membrana |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | produtos químicos para soluções eletrofisiológicas |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Aminoácidos Não Essenciais. Usado como suplemento para meio de cultura celular, para aumentar o crescimento e a viabilidade celular. |
| Neon 100 μ Kit | L Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Kit de eletroporação de células |
| Neon Sistema de transfecção | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Sistema de eletroporação de células |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Meio basal projetado para manutenção e maturação de longo prazo de populações de células neuronais sem a necessidade de uma camada alimentadora de astrócitos |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Meio de cultura iPSC humano |
| Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 157-8 | Usado para fixação celular em ensaios de imunocoloração |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Tampão de fosfato de Dulbecco Salino, com cálcio, com magnésio |
| PBS Ca2+/Mg2+ livre | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Tampão de Fosfato Dulbecco's Saline, sem Cálcio, sem |
| Penicilina/Estreptomicina de Magnésio | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Solução de penicilina/estreptomicina usada para prevenir a contaminação da cultura de células por bactérias. |
| poli-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Inibidor seletivo do receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol, t-Octylphenoxypolyetoxyethanol, Polietilenoglicol éter terc-octilfenílico. Usado para permeabilização celular em ensaios de imunocoloração |
| Microscópio vertical | Microscópio Olympus | BX51VI | para gravação eletrofisiológica equipado com câmera CoolSnap Myo |
| Y-27632 (Inibidor de ROCK) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Inibidor seletivo permeável à célula da proteína quinase (ROCK) contendo bobina enrolada associada a Rho. Aumenta a sobrevivência do iPSC |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Suporte para alto– análise microscópica final de células fixas |
Referências
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
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