Artigo de método

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

DOI:

10.3791/59322

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23 de agosto de 2019

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.

Resumo

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MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica através de sua capacidade de destabilizar o mRNA e inibir a tradução de mRNAs alvo. Um número cada vez maior de estudos identificou miRNAs como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer, e também como alvos terapêuticos, acrescentando uma dimensão extra à avaliação e tratamento do câncer. No contexto do cancro de tiróide, os resultados do tumorigênese não somente das mutações em genes importantes, mas igualmente da superexpressão de muitos miRNAs. Assim, o papel do miRNAs no controle da expressão gênica da tireoide está evoluindo como um importante mecanismo de câncer. Nisto, nós apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da entrega do Mirna-inibidor como uma modalidade terapêutica no cancro de tiróide usando o xenograft humano do tumor e os modelos transplantação orthotopic do do rato. Após a engenharia de células tumorais estáveis da tireóide expressando GFP e luciferase, as células são injetadas em camundongos nus para desenvolver tumores, que podem ser seguidos por bioluminescência. A inibição in vivo de um miRNA pode reduzir o crescimento do tumor e upregulate alvos do gene de miRNA. Este método pode ser utilizado para avaliar a importância de um determinado miRNA in vivo, além de identificar novos alvos terapêuticos.

Introdução

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O câncer de tireóide é uma malignidade endócrina com uma incidência crescente, embora, em termos gerais, tenha um bom desfecho1. No entanto, alguns pacientes desenvolvem formas agressivas da doença que são intratáveis e as bases moleculares são pouco compreendidas2.

miRNAs são 22-nucleotídeo-longo não-codificando RNAs que regulam a expressão de gene em muitos tecidos, tipicamente pela ligação do par-base à 3 ' região untranslational (3 ' UTR) do mensageiro do alvo RNAs (mRNAs), provocando a degradação do mRNA ou a repressão translacional 3. º ,

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Protocolo

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A experimentação animal foi realizada em conformidade com o direito da Comunidade Europeia (86/609/CEE) e a lei espanhola (1201/2005), com aprovação do Comité de ética do Consejo superior de Investigaciones científicas (CSIC, Espanha).

1. inoculação do flanco de células e tratamento antagomiR intratumoral

  1. Preparação de células
    1. Engenheiro de uma linha de células de câncer de tireóide humano Cal62 (KrasG12R e p53A161D mutações) para sobre-expressão uma construção transgênica que constitutivamente expressa GFP e luciferase (CMV-Firefly Luc-ires-EGFP). Selecione as células transgênicas ....

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Resultados

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Nós usamos dois modelos diferentes dos ratos para determinar se a neutralização de um miRNA poderia suprimir o crescimento do tumor. Conformemente, as pilhas humanas do tiróide Cal62-Luc do tumor foram injetadas por via subcutânea nos flancos de ratos nus para gerar um modelo do xenograph. Após duas semanas, os tumores foram estabelecidos e poderiam ser medidos com calipers. Nesse momento, os camundongos foram injetados intratumoralmente com o inibidor do miR-146B, ou um controle adequado, e o volume tumoral foi seguido .......

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Discussão

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Este artigo descreve um método para estudar a função in vivo de um miRNA a fim compreender melhor seu papel na iniciação e na progressão do tumor, e em seu potencial como um alvo terapêutico no cancro de tiróide. Os modelos do xenograft do tumor descritos aqui são baseados no uso das pilhas que podem ser controladas por seu sinal do bioluminescência, permitindo a medida do crescimento do tumor in vivo a influência de um tratamento. Além disso, descrevemos o uso de um tratamento baseado em miRNA para o câncer de tireóide,.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Raquel arocha Riesco por sua assistência com o tratamento e cuidado de camundongos. Agradecemos ao Dr. J. Blanco (Instituto Catalonian de química antecipada-CSIC) e ao Dr. e. mato (Institut de Reserca de l' Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Espanha) por gifting as células CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP e Cal62-Luc, respectivamente.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AntagomiR: inibidor de miRNA mirVanaThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Matriz de Membrana Basal: Matriz de Membrana Basal Matrigel AnticorpoCorning# 354248
DICER deAbcamab14601IHQ: 1/100
In vivo reagente de entrega: Invivofectamine 3.0 ReagenteThermo FisherIVF3005
In vivo software de imagem: IVIS-Lumina II Imaging SystemCaliper Life Sciences
Controle negativo: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1Thermo Fisher4464077In Vivo
Ready PCNA anticorpoAbcamab92552WB: 1/2.000
PTEN anticorpoSanta Cruzsc-7974WB: 1/1.000
XenoLight D-Luciferina - Substrato Bioluminescente de Sal K+PerkinElmer122799Diluído em PBS
alta concentração

Referências

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  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al.

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