Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

Resumo

Este estudo apresenta uma estratégia alternativa para o método convencional de base analógica tóxica na identificação de superprodutores de aminoácidos usando marcadores raros-Codon-ricos para alcançar precisão, sensibilidade e alta taxa de transferência simultaneamente.

Resumo

Para satisfazer o mercado cada vez maior de aminoácidos, são necessárias cepas de produção de alto desempenho. Os produtores de aminoácidos são identificados convencionalmente, aproveitando as competições entre os aminoácidos e seus análogos. Entretanto, este método analógico-baseado é da baixa exatidão, e os análogos apropriados para ácidos aminados específicos são limitados. Aqui, apresentamos uma estratégia alternativa que possibilita uma triagem precisa, sensível e de alta produtividade de produtores de aminoácidos que usam marcadores raros e ricos em Codon. Esta estratégia é inspirada pelo fenômeno do viés de uso de Codon na tradução de proteínas, para o qual os códons são categorizados em comum ou raros com base em suas freqüências de ocorrência no DNA de codificação. A tradução de raros códons depende de suas RNAs de transferência raras correspondentes (tRNAs), que não podem ser totalmente carregadas pelos aminoácidos cognatos a fome. Teoricamente, os raros tRNAs podem ser cobrados se houver um excedente dos aminoácidos após o carregamento dos isoaceptores comuns sinônimos. Conseqüentemente, as traduções causadas por códons raros podiam ser restauradas alimentando ou superproduçoes intracelular dos aminoácidos correspondentes. esta suposição, um sistema de seleção ou triagem para a identificação de superprodutores de aminoácidos é estabelecido através da substituição dos códons comuns dos aminoácidos alvo com suas alternativas raras sinônimos nos genes de resistência a antibióticos ou os genes codificando proteínas fluorescentes ou cromogênicas. Nós mostramos que as expressões da proteína podem extremamente ser impedidas pela incorporação de códons raros e que os níveis de proteínas correlacionam positivamente com as concentrações do ácido aminado. Usando este sistema, superprodutores de múltiplos aminoácidos podem ser prontamente selecionados a partir de bibliotecas de mutação. Esta estratégia rara-baseada em Codon exige somente um único gene modificado, e o anfitrião é menos provável escapar da seleção do que em outros métodos. Ele oferece uma abordagem alternativa para a obtenção de superprodutores de aminoácidos.

Introdução

A produção atual de aminoácidos depende muito da fermentação. No entanto, os títulos e rendimentos para a maioria das cepas de produção de aminoácidos estão abaixo das demandas crescentes do mercado global de aminoácidos que vale bilhões de dólares^1,2. A obtenção de superprodutores de aminoácidos de alto desempenho é fundamental para a atualização da indústria de aminoácidos.

Estratégia tradicional para identificar produtores de aminoácidos explora as competições entre os aminoácidos e seus análogos na síntese protéica^3,4. E....

Protocolo

1. construção dos plasmís expressando os genes raros-Codon-ricos do marcador

1. Selecione um gene de marcador que contenha um número apropriado de códons comuns para o aminoácido alvo.
   Nota: para a L-leucina, o gene de resistência à kanamicina Kan^R, que contém 29 códons de leucina, dos quais 27 são códons comuns, é utilizado para a construção do sistema de seleção¹³. O gene GFP , que contém 17 códons comuns de 19 códons de leucina, ou o gene prancerpurple (PPG), que abriga 14 codões comuns de leucina, é utilizado para o sistema de triagem (tabela complementar 1 ).
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Resultados

Para o sistema de seleção, uma diminuição acentuada no OD₆₀₀ para cepas que abrigando o gene de resistência a antibióticos raro-Codon-rico deve ser observada em comparação com a cepa que abrigando o gene de resistência a antibióticos do tipo selvagem quando cultivado em um adequado médio (Figura 1a). Nas mesmas condições, a diminuição da célula OD₆₀₀ torna-se mais evidente, pois o número de raros códons no gene da resistência aos antibió.......

Discussão

O número de códons raros nos genes do marcador e o meio de seleção ou de triagem são críticos para inibir as expressões protéicas dos genes marcadores raros-Codon-modificados. Se não for detectada diferença significativa entre as expressões protéicas dos genes marcadores do tipo selvagem e seus derivados, aumentar o número de códons raros ou usar um meio limitado de nutrientes pode amplificar as diferenças. No entanto, se o efeito de inibição é muito forte, as expressões de proteínas não podem ser recuperados, mesmo por .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrila	Thermo	51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit	Transgen	EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	Transgen	EG101-01
Gibson assembly master mix	NEB	E2611S
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo Solarbio		I8070
L-leucina	Sigma	L8000
Microplate leitor	Biotek	Synergy 2
n-hexano	Thermo	H3061
Isotiocianato de fenila	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polimerase	Transgen	AP231-01
Trietilamina	Sigma	T0886
Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência	Agilent	1290 Infinity II
Tipo selvagem C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli célula competente	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 coluna	Agilent	Rolamento 959759-902K