Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

Resumo

Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

Resumo

A citotoxicidade é um parâmetro crítico que precisa ser quantificado ao estudar drogas que podem ter benefícios terapêuticos. Por causa disso, muitos ensaios de triagem de drogas utilizam a citotoxicidade como uma das características críticas a serem perfiladas para compostos individuais. As células na cultura são um modelo útil para avaliar a citotoxicidade antes de prosseguir para o acompanhamento de compostos promissores de chumbo em modelos animais mais dispendiosos e trabalhoso. Nós descrevemos uma estratégia para identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em um tdTomato que expressa a linha de pilhas de haste neural humanas (NSC). A estratégia utiliza dois ensaios complementares para avaliar o número de células. Um ensaio funciona através da redução de 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) para formazan como um proxy para o número da célula e o outro conta diretamente o tdTomato expressando NSCs. Os dois ensaios podem ser realizados simultaneamente em um único experimento e não são trabalhoso, rápido e barato. A estratégia descrita nesta demonstração testou 57 compostos em uma tela preliminar exploratória para a toxicidade em um formato da placa de 96 poços. Três dos hits foram caracterizados mais em uma resposta da dose de seis pontos usando o mesmo ajuste-acima do ensaio que a tela preliminar. Além de proporcionar excelente corroboração para toxicidade, a comparação dos resultados dos dois ensaios pode ser efetiva na identificação de compostos que afetam outros aspectos do crescimento celular.

Introdução

Uma das características mais importantes que precisa ser determinada para um composto químico que tem potencial terapêutico é a sua toxicidade para as células animais. Esta característica determinará se uma droga é um bom candidato para um estudo mais extenso. Na maioria dos casos, os compostos com toxicidade mínima são procurados, mas há situações em que um composto com a capacidade de matar tipos de células específicas é de interesse, por exemplo, drogas antitumorigenic. Embora os animais inteiros sejam os melhores sistemas do modelo para determinar a toxicidade sistemática, o custo e o trabalho envolvidos são proibitivos quando mais do que alguns compostos precisam....

Protocolo

1. cultura NSC

Nota: a manipulação de uma linha NSC humana será descrita abaixo, mas qualquer linha celular pode ser usada para este protocolo. Todo o trabalho da cultura da pilha é executado em um armário de segurança biológico.

1. Cubra uma placa de 96 poços com membrana basal/matriz extracelular (ECM).
   1. Thaw alíquota de ECM (tabela de materiais), que facilitará a fixação de NSC, no gelo. Diluir o ECM para a concentração apropriada (geralmente 1:100) em meio de base de 10 mL (tabela de materiais) e adicionar 50 μL por poço a cada um dos 60 poços interiores de uma placa de poço 96 (

Resultados

Os dados de contagem de células automatizadas identificaram onze compostos com menos de 25% de viabilidade quando normalizados para o controle DMSO, enquanto os dados do MTT identificaram esses mesmos compostos mais dois adicionais (tabela 1 e tabela 2, vermelho sombreado). Os dois compostos encontrados para serem tóxicos apenas no ensaio de MTT (poços F3 e G10) tiveram 31% e 39%, respectivamente, o número de células tdTomato-positivas como o controle e por ordem de classificação foram o.......

Discussão

O objetivo preliminar deste artigo era descrever uma estratégia que pudesse eficientemente e barata identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em uma baixa-à avaliação da moderado-taxa de transferência. Duas técnicas ortogonais foram utilizadas para avaliar o número de células para aumentar a confiança nas conclusões e oferecer insights adicionais que não estariam disponíveis se apenas um único ensaio fosse utilizado. Um dos ensaios usou um Imager da pilha fluorescente para contar diretamente pilhas tdTom.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Componente médio de células-tronco neurais.
Pipetador de bancada	Sorenson Bioscience	73990	Fornece a capacidade de pipetar a biblioteca de compostos em uma placa de 96 poços de uma só vez.
BioLite 96 poços multidish	Thermo Scientific	130188	Qualquer placa de cultura de células de 96 poços funcionará.  Nós os usamos em nosso trabalho.
Microscópio de cultura celular	Nikon	Eclipse TS100	Inspeção visual das células para garantir a densidade adequada.
Citação 5/ Leitor de imagem	BioTek	CYT3MFV	Usado para imagens celulares e leituras de absorbância.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvente para compostos usados em tela. Dissolve os precipitados de MTT para facilitar as medições de absorbância.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Componente médio de células-tronco neurais.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Matriz de membrana basal de células-tronco neurais.  Permite que as células se liguem às placas de cultura de células.
Gen5 3.04	Software de análise BioTek		para determinar a contagem de células para células que expressam tdTomato.
Glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081	Componente de meio de células-tronco neurais.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Armazenamento de bibliotecas compostas.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Reagente de ensaio ativo para determinar a viabilidade celular.
Pipeta multicanal	Rainin	E8-1200	Adição coluna por coluna de meio de cultura celular, MTT ou DMSO.
Meio neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049	Meio de base de células-tronco neurais.
Cubo de filtro RFP Filtro	de 1225103 BioTek		em Cytation 5 usado para imagens de células que expressam tdTomato.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Reagente de dissociação celular.