A fertilização in vitro é uma técnica comumente utilizada com uma variedade de organismos modelo para manter as populações de laboratório e produzir embriões sincronizados para aplicações a jusante. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa esta técnica para diferentes populações do peixe Tetra mexicano, Astyanax mexicanus.
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Artigo de método
Coleção gamete e fertilização in vitro de Astyanax mexicanus
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Astyanax mexicanus está emergindo como um organismo modelo para uma variedade de campos de pesquisa na ciência biológica. Parte do sucesso recente desta espécie de peixe teleósteo é que possui caverna cruzar e populações de Rio-habitação. Isso possibilita o mapeamento genético de traços hereditários que foram fixados durante a adaptação aos diferentes ambientes dessas populações. Enquanto esta espécie pode ser mantida e criada no laboratório, é desafiador tanto para obter embriões durante o dia e criar embriões híbridos entre as cepas. In vitro a fertilização (IVF) foi usada com uma variedade de organismos modelo diferentes para produzir com sucesso e repetidamente animais no laboratório. Neste protocolo, mostramos como, aclimatizando a . mexicanus a diferentes ciclos de luz juntamente com mudanças na temperatura da água, podemos mudar os ciclos de reprodução para uma hora escolhida do dia. Posteriormente, mostramos como identificar peixes parentais adequados, coletar gametas saudáveis de machos e fêmeas, e produzir progênies viáveis usando FIV. Isto permite procedimentos relacionados tais como a injeção de construções genéticas ou a análise desenvolvente a ocorrer durante horas de trabalho normais. Além disso, esta técnica pode ser usada para criar híbridos entre as populações de cavernas e de superfície, e assim possibilitar o estudo da base genética de adaptações fenotípicas a diferentes ambientes.
Introdução
Nos últimos anos, Astyanax mexicanus tornou-se um organismo modelo em diferentes áreas, como biologia do desenvolvimento, biologia evolutiva, biologia comportamental e fisiologia1,2,3,4 . A singularidade deste sistema vem desta espécie tendo vários morfotipos que se adaptaram a ambientes muito diferentes. O Morfotipo da habitação de superfície vive nos rios onde há uma biodiversidade elevada e uma abundância de fontes de alimento para os peixes. Em contraste, os morfotipos de caverna de a. mexicanus, o cavefish, vivem em cavernas onde A biodiversidade, fontes de alimentos e oxigênio são drasticamente diminuídos1. Cavefish diferem dos peixes de superfície em uma variedade de fenótipos tais como a ausência de olhos e de pigmentação, resistência de insulin, e a habilidade de armazenar a gordura2,3,4. No entanto, peixes de superfície e cavefish ainda pertencem à mesma espécie e são, portanto, interfertile.
Para ambos os morfotipos, definiu-se um conjunto de condições para permitir a manutenção e reprodução rotineiras em condições laboratoriais5,6. Entretanto, as modificações genéticas, os estudos de desenvolvimento embrionário apropriados, e a criação dos híbridos são ainda desafiantes por diversas razões. A. mexicanus primeiramente desova durante horas da noite que é inconveniente para experiências subseqüentes em estágios embrionário adiantados tais como a injeção de construções genéticas ou a monitoração de processos de desenvolvimento embrionário adiantados. Além disso, a geração de híbridos de superfície e caverna é desafiadora usando a desova natural, uma vez que os morfotipos da caverna têm um ritmo circadiano alterado7 que, em última análise, afeta a produção de óvulos viáveis. Procedimentos de fertilização in vitro bem sucedidos, porém invasivos, foram descritos para outras espécies de Astyanax , onde a produção de gameta e o comportamento de desova foram aprontado usando injeções hormonais8,9. Procedimentos de fertilização in vitro menos invasivos (i.e., obtenção de gametas de desova manual sem a injeção de preparações hormonais) têm sido descritos, mas não consideram as diferenças no ciclo de desova entre os morfotipos de caverna e superfície de a. mexicanus a 6.
Outros organismos do modelo de peixe, como o zebrafish, podem ser facilmente modificados geneticamente e estudados a um nível embrionário, porque os obstáculos acima mencionados foram resolvidos com sucesso. A implementação de técnicas padronizadas de melhoramento genético, fertilização in vitro e criopreservação de espermatozóides têm empurrado o zebrafish para frente e solidificado o uso do modelo nas ciências biológicas10. Portanto, estender essas técnicas para a . mexicanus irá fortalecê-lo como um sistema modelo.
Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para o IVF que ajudará a fazer a . mexicanus mais acessível. Apresentaremos uma configuração de reprodução que permite deslocar os ciclos de luz dos peixes de dia para noite para que os óvulos viáveis possam ser obtidos durante o dia sem injeção de preparações hormonais. Nós, então, fornecer uma descrição detalhada de como obter os óvulos e Milt usado para IVF. Este método permitirá a produção de embriões durante o horário de trabalho normal e tornará mais viável a jusante aplicações em comparação com o uso de embriões de desova natural.
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Protocolo
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) do Instituto de pesquisas médicas da Stowers.
1. manipulação de ciclo claro
- Configurar tanques de peixes dentro de um opaco, totalmente fechado (proteção de luz), fluxo-através do sistema de aquicultura contendo várias fileiras de tanques (Figura 1).
Nota: o sistema de escoamento, como mostrado na Figura 1 , utiliza água do sistema para esvaziar o lixo através do tubo de suporte traseiro de cada tanque e flui para um cárter que esvazia em um dreno sanitário. Neste experimento, utilizou-se uma taxa de câmbio de água de um galão (US) por hora através de um emissor de gotejamento. - Manter a temperatura de cada tanque com um elemento de aquecimento independente que é usado para alterar manualmente a temperatura durante o processo de escorva.
- Configure linhas individuais de forma a permitir fotoperíodos separados em cada um. Instale as portas em cada fileira que podem ser fechados para impedir que a luz entre ou escape.
Nota: o controlador automatizado pode permitir a manipulação de todos os fotoperíodos com o menor distúrbio para o peixe. - Equipar o rack com uma luz de trabalho vermelha e cortinas blackout para o acesso durante as horas escuras.
2. ajustando o fotoperíodo e os peixes da escorva para a coleção do gameta
- Retire os peixes desejados (Figura 2a) dos racks gerais do sistema e coloque em racks de reprodução para permitir o ajuste do fotoperíodo 14 dias antes da escorva.
Nota: isto permite que os peixes aclimatizar a um novo ambiente. - Mantenha o peixe a 22,8 ° c (73 ° f) durante este período usando o sistema de aquecimento aquático instalado. O fotoperíodo normal é de 6 a.m. a 8 p.m. luz e 8 p.m. a 6 a.m. escuro. Para o rack ciclo de luz, mude o fotoperíodo para 10 p.m. para 12 p.m. luz e 12 p.m. para 10 p.m. escuro, ajustando o temporizador que alimenta a luz dentro do rack.
Nota: machos e fêmeas são alojados no mesmo tanque para permitir que os comportamentos de escorva natural ocorra. Enquanto a desova pode ocorrer no tanque, os peixes ainda podem ser usados para fertilização in vitro, uma vez que os gametas são liberados nos estágios11. - Uma vez que os peixes são aclimatizados, comece a escorar os animais para desova5 como descrito nas etapas 2.3.1 a 2.3.5.
Nota: este procedimento demora seis dias no total. Durante este tempo, mude a temperatura para Prime a produção de óvulos usando um sistema de aquecimento aquático instalado. Usando os calefatores aquáticos 50W (veja a tabela dos materiais), ajuste o calefator diretamente à temperatura (a escala no calefator está em Fahrenheit) dada no protocolo em cada etapa. Dependendo do tamanho do tanque e da taxa de escoamento da água, o tempo de ajuste da temperatura pode diferir. Neste experimento, a temperatura foi ajustada ao meio-dia e a equilibração da temperatura assumiu os próximos 18 h.- No dia 1, aumente a temperatura de 22,8 ° c (73 ° f) para 24,4 ° c (76 ° f).
- No dia 2, aumente a temperatura de 24,4 ° c (76 ° f) para 26,1 ° c (79 ° f).
- No dia 3 e 4, mantenha a temperatura a 26,1 ° c (79 ° f). Os peixes estarão prontos para desovar durante o dia e o IVF pode ser executado.
Nota: dependendo do peixe individual, as fêmeas podem desovar no dia 3 e/ou dia 4. Recomendamos tentar obter óvulos no dia 3 e/ou dia 4, dependendo do sucesso da coleção de óvulos. - No dia 5, abaixe a temperatura de 26,1 ° c (79 ° f) a 24,4 ° c (76 ° f).
- No dia 6, abaixe a temperatura de 24,4 ° c (76 ° f) a 22,8 ° c (73 ° f).
Nota: forneça uma folga de 7 dias antes de repetir este ciclo de temperatura. Recomenda-se continuar mantendo os peixes neste fotoperíodo desde que este reduzirá o tempo total necessário pelos peixes para ajustar a este ciclo claro deslocado.
3. coleção fêmea do gameta
- Comece inserindo um pano umedecido em uma tampa de placa de Petri e fechando o prato para criar uma câmara humidificada e impedir que os óvulos SECem durante o processo de coleta.
- Em seguida, escolha uma fêmea para a coleção. Os peixes gravid com grandes, salientes do abdômen provavelmente serão a melhor escolha para este procedimento (Figura 2a).
Nota: para diferenciar entre machos e fêmeas do adulto a. mexicanus, utilizou-se o método de bola de algodão12. - Imobilizar uma fêmea usando água gelada e colocá-la na posição supina em um suporte de animais de esponja umedecida. Faça isso colocando o peixe em água do sistema de 4 ° c por pelo menos 30 s ou até que o peixe seja imobilizado (ou seja, perda de movimento de brânquias, veja Ross e Ross13 para obter detalhes).
Nota: Trabalhe rapidamente e tente evitar aquecer o peixe até que o procedimento seja concluído. Isto pode incluir periodicamente mergulhando as pontas gloved dos dedos na água fria ou em oferecer a anestesia suplementar. Outros métodos de anestesia (por exemplo, MS-22213) também podem ser usados. as diretrizes do IACUC do Instituto de pesquisas médicas de Stowers, a coleta manual de óvulos é considerada um procedimento não invasivo, que não requer anestesia completa (por exemplo, através de MS-222). - Uma vez posicionado, borre o lado ventral do peixe com um pano delicado Limpe como contato com a água fará com que os óvulos para ativar.
- Segure a fêmea entre o polegar e o dedo indicador. Aperte suavemente contra os lados laterais da cavidade coelômica na direção da abertura urogenital enquanto rola levemente os dedos. Colete os óvulos expressos usando uma espátula descartável.
- Transfira estes óvulos para o prato de Petri humidificado.
Nota: várias garras de óvulos podem ser combinadas no mesmo prato se não forem necessários dados de parentagem específicos. Os óvulos podem ser armazenados em 24 ° c e são os melhores quando usados para IVF dentro de 30-60 minutos após a coleção. - Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação preenchido com água do sistema.
Nota: Coloque o peixe de volta no tanque de armário escuro para futura coleção de óvulos quando necessário.
4. coleção masculina do gameta
- Escolha um macho para a coleção.
Nota: não existem sinais visíveis exteriormente da qualidade do gameta masculino. No entanto, os peixes devem aparecer saudáveis na aparência antes de usar neste procedimento. Para diferenciar entre machos e fêmeas do adulto a. mexicanus, utilizou-se o método bola de algodão12. - Imobilizar um macho usando água gelada e colocá-lo na posição supina em um suporte de animal de esponja umedecido. Imobilizar colocando o peixe em água do sistema de 4 ° c durante pelo menos 30 segundos ou até que o peixe seja imobilizado (i.e., perda de movimento de brânquias, ver Ross e Ross13 para mais detalhes).
Nota: Trabalhe rapidamente e tente evitar aquecer o peixe até que o procedimento seja concluído. Isto pode incluir periodicamente mergulhando as pontas gloved dos dedos na água fria ou em oferecer a anestesia suplementar. Outros métodos de anestesia (por exemplo, MS-22213) também podem ser usados aqui. as diretrizes do IACUC do Instituto de pesquisas médicas de Stowers, a coleta manual de espermatozóides é considerada um procedimento não invasivo, que não requer anestesia completa (por exemplo, através de MS-222). - Blot o lado ventral do peixe com uma limpeza delicada do tecido como o contato com a água ativará o Milt.
- Coloc delicadamente a extremidade de um tubo capilar na abertura urogenital.
- Expelir o Milt aplicando a pressão delicada nos lados dos peixes com o polegar e o forefinger. Comece distal às brânquias, movendo-se para a abertura urogenital.
- Recolher o Milt no final de um tubo capilar. A sucção delicada pode ser necessária pelo uso de um tubo do aspirador. Evite quaisquer fezes que possam ser expelidas com o Milt.
- Dispense o Milt em um tubo de centrífuga vazio 1,5 mL e diluir com o dobro do volume de esperma Extender E400 (ver tabela de materiais). Mantenha o gelo.
Observação: Milt de vários machos podem ser agrupados se dados de parentesco específicos não são necessários. Esta etapa pode ser usada para estender o tempo de trabalho do Milt por diversas horas, mas não é exigido para a fecundação imediata. - Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação preenchido com água do sistema.
Nota: coloc o peixe de volta no tanque escuro do armário para a coleção futura do esperma quando necessário.
5. fertilização in vitro
- Usando uma pipeta nova para cada estoque, misture o esperma pipetando e/ou agitando o lado do tubo antes de fertilizar como o esperma no Milt pode estabelecer-se na solução E400 sobre o tempo.
- Dispense o Milt ou a solução prolongada do Milt nos óvulos recentemente recolhidos.
- Adicione rapidamente 1 mL de água do sistema à embreagem para ativar o esperma e os ovos para a fertilização. Evite misturar ou agitar o conteúdo do prato e permitir que 2 min para a fertilização ocorra.
Nota: a mistura e agitação reduz consideravelmente as taxas de fertilização e deve, portanto, ser evitada14. - Adicionar E2 embrião Media para encher o prato 2/3RD completo.
Nota: dependendo do procedimento subseqüente, os embriões podem ser usados imediatamente (por exemplo, para a injeção de construções genéticas como descrito antes de15) ou os embriões podem ser incubados nos meios do embrião E2 em 23 ° c até que alcancem 5 DPF. Neste ponto de transferência de embriões para o sistema de habitação principal recirculação usando água do sistema.
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Resultados
O protocolo apresentado aqui é baseado principalmente em um protocolo previamente publicado6. No entanto, desde a. mexicanus gera durante as horas noturnas, nós projetamos um rack de habitação para a criação de peixes que pode mudar o fotoperíodo independente do horário de trabalho (Figura 1). O ciclo de luz dos peixes é alterado dentro de um sistema de aquicultura totalmente fechado, que contém três fileiras de tanques (
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Discussão
Enquanto IVF é um método padronizado para muitos organismos modelo diferentes, como zebrafish, protocolos existentes para a. mexicanus não levam em conta que esta espécie naturalmente gera durante as horas noturnas6. Dado que os peixes cavefish e de superfície diferem completamente dràstica em seus ritmos circadiano, o ciclo da maturação dos óvulos igualmente difere entre os morphotypes da caverna e da superfície. Enquanto as temperaturas de preparo e as horas para a superfície a. mex...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Philippe Noguera e Kimberly Bland por seu apoio na produção de vídeo. Os autores também gostariam de reconhecer toda a equipe de Aquatics do Instituto de Stowers para o husbandry animal. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento institucional para DPB e NR. NR foi apoiado pela Fundação Edward Mallinckrodt e JDRF. A RP foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de Centrífuga de 1,5 mL | Eppendorf | #22364111 | |
| Placas de Petri de 100 mm | VWR International | #25384-302 | |
| Tubo de Aspirador | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrado 1-5 µ L Tubos Capilares | Drummond | #2-000-001 | |
| Espátulas Descartáveis | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S Aquecedores Aquáticos 50W | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipeta | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pontas de Pipeta | Thermo Scientific | #2079E | |
| Incubadora Sanyo MIR-554 | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glicose, 30 mM HEPES Ajuste para pH 7.9 com 5M KOH e filtre esterilize. A solução pode ser armazenada a 4 ? C por até 6 meses. | ||
| Suporte de Animal | Feito de espuma de sucata | ||
| Sistema de Água | Água Deionizada suplementada com Sal Marinho Instantâneo do Oceano [Blacksburg, VA] para atingir uma condutância específica de 800 µ S/cm. Os parâmetros de qualidade da água são mantidos dentro dos limites seguros (limite superior da faixa de nitrogênio amoniacal total, 1 mg/L; limite superior da faixa de nitrito, 0,5 mg/L; limite superior da faixa de nitrato, 60 mg/L; temperatura, 22 & graus; C; pH, 7,65; oxigênio dissolvido 100 %) | ||
| Toalhetes de Tecido | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µ M KH2PO4, 50 µ M Na2HPO4, 1,0 mM CaCl2, 0,7 mM NaHCO3. Ajuste o pH para 7,2 a 7,4 usando ácido clorídrico 2 N. Esterilize por filtro. Conservado à temperatura ambiente durante um período máximo de duas semanas. |
Referências
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Reimpressões e permissões
