A derivação de um flavonol é crucial para sua aplicação na saúde e na indústria alimentícia. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a biossíntese de um flavonol de um flavanone e discutimos as etapas cruciais e suas vantagens sobre outras aproximações.
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Artigo de método
Biossíntese de um flavonol de um Flavanone estabelecendo uma cascata Bienzimática de um pote
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides com uma variedade de atividades biológicas e farmacológicas. Aqui, nós fornecemos um método para a síntese enzimática in vitro de um flavonol. Neste método, Atf3h e Atfls1, dois genes chave na via biossintética dos flavonóis, são clonados e superexpressos em Escherichia coli. As enzimas recombinantes são purificadas através de uma coluna de afinidade e, em seguida, uma cascata bienzimática é estabelecida em um tampão sintético específico. Dois flavonóis são sintetizados neste sistema como exemplos e determinados pelas análises de TLC e HPLC/LC/MS. O método exibe vantagens óbvias na derivação de flavonóis sobre outras abordagens. É tempo e trabalho de poupança e altamente rentável. A reação é fácil de ser controlada com precisão e, assim, escalada para a produção em massa. O produto-alvo pode ser facilmente purificado devido aos componentes simples do sistema. No entanto, este sistema é geralmente restrito à produção de um flavonol de um flavanone.
Introdução
Os flavonóis são uma subclasse importante de flavonoides vegetais e estão envolvidos no desenvolvimento de plantas e na pigmentação1,2,3. Mais importante, estes compostos possuem uma ampla gama de atividades benéficas para a saúde, tais como anti-câncer4,5, anti-oxidativo6, anti-inflamatória7, antiobesidade8, anti-hipertensivo9 e as propriedades de recuperação de memória10, levando a um grande número....
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Protocolo
1. isolar o RNA total dos tecidos da planta26,27
- Homogeneizar os tecidos da planta.
- Colete 100 mg de um tecido vegetal fresco (por exemplo, mudas de 4 semanas de idade de Arabidopsis Arabidopsis thaliana). Congelar o tecido e um pilão e argamassa com nitrogênio líquido, seguido pela moagem do tecido em pó.
- Adicionar 1 mL de reagente de isolamento de RNA (ver tabela de materiais) na argamassa. O reagente será congelado imediatamente. Homogeneizar a amostra de tecido com o pilão quando o reagente congelado derrete.
- Transfira o homogeneate a um tub....
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Resultados
F3H e FLS1 são duas importantes enzimas chave na conversão de um flavanone em um flavonol em plantas como mostrado na Figura 1. Desenvolver um sistema biossintético in vitro para a produção de um flavonol a partir de um flavanone, Atf3h (GenBank adesão não. NM_ 114983.3) e Atfls1 (GenBank adesão não. NM_ 120951.3) os genes foram clonados a partir das mudas de 4 semanas de idade a. Arabidopsis thaliana em um vetor de expressão procar.......
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Discussão
Um grande número de estudos são focados na derivação de flavonóis devido à sua potencial aplicação na saúde e na indústria alimentar. No entanto, a extração tradicional de plantas utilizando solventes orgânicos e síntese química possui desvantagens intrínsecas, que restringem seu uso na produção de flavonóis. Aqui, nós relatamos um método detalhado para produzir um flavonol de um flavanone em um potenciômetro estabelecendo uma cascata bienzimática in vitro. As etapas críticas neste protocolo são: 1) obtenção de enzimas r.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade Yangzhou especialmente nomeado professor start-up fundos, Jiangsu especialmente nomeado professor start-up fundos, seis Talent Peaks projeto na província de Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e um projeto financiado por o desenvolvimento do programa acadêmico prioritário das instituições de ensino superior de Jiangsu (medicina veterinária). Agradecemos ao centro de testes da Universidade Yangzhou para análises de HPLC e MS de flavonoides.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2 vezes; Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | amplificação de PCR de genes com alta fidelidade |
| Agilent 1200 Series RRLC system com um sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS | Agilent Technologies, Inc | N/A | um equipamento para análise de flavonóides por HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (versão B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | um software para coleta de dados do sistema Agilent 1200 Series RRLC com um sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS |
| dihidrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | produto intermediário para a produção de kaempferol a partir de naringenina |
| diidroquercetina | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | produto intermediário para a produção de quercetina a partir de eriodictyol |
| Kit de limpeza de DNA | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purificação de DNA eriodictyol amplificado por PCR ou purificado em gel |
| Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | Substrato B21160 | para a produção de quercetina | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | cepa de bactérias para expressar genes-alvo |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | cepa de bactérias para proliferação de plasmídeos |
| FreeZone 1 Litro Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | um equipamento para liofilização de flavonóides dissolvidos em solvente orgânico Kit de extração de |
| gel | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purificação de uma banda de DNA de um gel de agarose |
| Sistema de imagem em gel | Xangai Tanon Ciência & Fornecedor:Technology Co., Ltd. | Tanon- 2500 | um equipamento para visualização da banda de DNA em um gel de agarose ou mancha de flavonóide em uma placa TLC de poliamida |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. | LLC PLN350-1KT | minipreparação de plasmídeos |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | produto de reação final e substância padrão |
| MassHunter Quanlitative Analysis (versão B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | um software para análise de dados HPLC/LC/MS |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | um equipamento para determinação da concentração de DNA/RNA |
| naringenina | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrato para a produção de kaempferol |
| Ni-IDA Resina de Agarose | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purificação de proteínas de fusão marcadas com His |
| pET-32a (+) | Novagen | 69015-3 | plasmídeo para clonagem e expressão de genes alvo |
| sequenciamento de plasmídeo | GENEWIZ Suzhou | N / A | sequenciamento de plasmídeos recombinantes síntese de primers |
| GENEWIZ Suzhou | N / A | síntese de primers PCR | |
| quercetina | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | Q111273 | produto de reação final e substância padrão |
| Kit de síntese de cDNA SuperRT | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | síntese da primeira fita de cDNA a partir de RNA total |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligação de uma inserção em um vetor linearizado DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolamento de RNA total |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | um software para design de primer de PCR e análise de sequência de DNA |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | um software para análise de dados de HPLC |
Referências
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Cha....
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Reimpressões e permissões
