Avaliação da proliferação queratinócito em duas e três dimensões tipo I colágeno substratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de duas formas diferentes de substratos de cultura utilizando colágeno tipo I. Dependendo de como o colágeno é manipulado, moléculas de colágeno ou mantêm a forma bidimensional, não-fibrosa ou remontá em formas tridimensionais, como fibrila. Proliferação celular na tipo I colágeno é drasticamente afectado pela formação de fibrila.

Resumo

Tipo I colágeno, útil como um substrato para a cultura de células, existe em duas formas: a forma bidimensional, não-fibrosa e formas tridimensionais, como fibrila. Ambas as formas podem ser preparadas com o mesmo colágeno tipo I. Em geral, a forma não-fibrosa promove a proliferação e a adesão celular. O formulário de fibrila (géis) fornece mais condições fisiológicas em muitos tipos de células; Portanto, o gel de cultura é útil para examinar comportamentos fisiológicos de células, tais como a eficácia da droga.

Pesquisadores podem selecionar a forma apropriada de acordo com a finalidade de sua utilização. Por exemplo, no caso dos queratinócitos, cultura em-gel tem sido usada como uma modelo de cicatrização de feridas. FEPE1L-8, uma linha de celular de queratinócitos cultivadas na forma não-fibrosa de tipo eu colágeno, promover a adesão celular. Notavelmente, proliferação de queratinócitos é mais lenta no formulário fibrila que a forma não-fibrosa. Protocolos para a preparação de colágeno tipo I para cultura de células são simples e têm aplicações largas, dependendo das necessidades de experimentais.

Introdução

Intersticiais tecidos conjuntivos compreendem um tridimensional malha de proteína de composição heterogênea, composto principalmente de tipo eu de fibrilhas de colagénio¹. Fibrilhas de colagénio desempenham um papel fundamental como um andaime para células^1,2,3 e interagirem com outras proteínas de matriz extracelular (ECM)³. In vitro, diferentes formas de tipo I colágeno pode ser usado como substratos para cultura de células, dependendo a manipulação método^1,2,3,4. Sob condições ácidas, tipo I colágeno mantém a forma não-fibrosa⁵. Revestimento da superfície dos pratos de cultura com a forma não-fibrosa promove célula adesão e proliferação de^6,7. Em pH fisiológico e temperatura, tipo I moléculas de colágeno remontá em fibrilas que formam géis, possuindo uma estrutura tridimensional^{1,2,3,4, 5,6,7,8}. Existem vários importantes diferenças entre as formas não-fibrosa do tipo e fibrila eu colágeno, incluindo a rigidez da matriz e eficiências de reconstrução de componentes de ECM pelas células durante a cultura¹. Rigidez da matriz é um dos fatores regulatórios mais estudados da célula cultura^{1, 9}. No entanto, as interações complexas entre substratos e células continuam a ser esclarecido. Para examinar as interações complexas entre células e fatores ambientais, um sistema simples é útil. Comparação do comportamento celular em duas formas diferentes de colágeno pode ajudar a simplificar o efeito de fatores ambientais. Dependendo a finalidade da sua utilização, formas diferentes de tipo eu colágeno pode ser seletivamente usado. Normalmente, os queratinócitos estão em contato com a membrana basal, mas não com colágeno tipo I. No entanto, durante a cicatrização de feridas, queratinócitos mover-se para o tecido conjuntivo cutâneo, proliferam e curar a ferida de¹⁰.

Recentemente, temos demonstrado que a concentração de cálcio extracelular é importante para a proliferação de queratinócitos células de linha usando o sistema de cultura na forma fibrila de colágeno imitando o tecido conjuntivo dérmico¹¹tipo I. Quando a linha de celular de queratinócitos FEPE1L-8 foi cultivado no formulário fibrila de colágeno tipo I, a forma das células era redonda e suas proliferações foram paradas em uma concentração de cálcio extracelular de 30 μM¹¹. Quando a concentração de cálcio foi aumentada para 1,8 mM, crescimento celular foi recuperado¹¹. As células cresceram sob ambas as concentrações de cálcio (30 μM e 1,8 mM) quando cultivadas na forma não-fibrosa¹¹, Considerando que eles eram mais sensíveis à concentração de cálcio exógeno quando cultivadas no formulário fibrila. FEPE1L-8 foi gerado através do transfection com papilomavírus tipo 16 transformadora genes E6 e E7 de carcinoma cervical humano, oncogenicidade, inibir a proliferação ilimitada com diferenciação limitada potencial como queratinócitos normais ^12,13. FEPE1L-8 células podem ser mantidas com o uso de alguns tipos de queratinócitos meio específico, incluindo K110 tipo-II com aditivo suplemento K-1 (K110)⁶. Aqui, descrevemos o protocolo de cultura de linhagem celular de queratinócitos humanos sobre os não-fibrosa e formas de fibrila de colágeno tipo I.

Protocolo

1. preparação do meio de cultura de queratinócitos

Nota: Execute todos os procedimentos sob condições assépticas.

1. Adicione 5 mL de penicilina-estreptomicina e 10 mL de suplemento aditivo K-1 500 mL do meio de K110 tipo-II (K110) utilizando uma pipeta.

2. preparação da forma fibrila de colágeno tipo I

Nota: Execute procedimentos até o passo 2.6 sob condições assépticas.

1. Manter 10 x tampão fosfato salino (PBS (-)), água desionizada, colágeno, uma placa de cultura de 96 poços e um tubo de 2 mL vazio no gelo.
   Nota: Não use o mesmo prato para preparar as formas não-fibrosa e fibrila.
2. Adicione 1,12 mL de água desionizada para um tubo vazio de 2 mL com uma pipeta. Adicione 200 µ l de PBS de x 10 (-) para a água deionizada no tubo de 2 mL com uma pipeta. Agite o tubo várias vezes.
3. Adicione 0,66 mL de colágeno para o tubo de 2 mL com uma pipeta. Delicadamente e rapidamente aperta o tubo várias vezes.
   Nota: Evite a formação de bolhas na solução tanto quanto possível. Prepare a solução de colágeno imediatamente antes da utilização.
4. Despeje 100 µ l da solução de colágeno da etapa 2.3 em cada poço da placa de 96 poços de cultura. Agite suavemente a placa de cultura em uma esquerda certo movimento.
   Nota: Cobrir toda a superfície dos poços com a solução de colágeno. Se a solução não cobrir toda a superfície, espalhe a solução usando a ponta da pipeta. Evite a formação de bolhas na solução tanto quanto possível.
5. Coloque a placa de cultura numa incubadora de CO₂ e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Check a gelificação do colagénio e mova a placa de cultura para uma bancada limpa.
   Nota: Confirme gelificação inclinando a placa de cultura.
6. Despeje delicadamente 150 µ l de K110 sobre o gel com uma pipeta ao longo da parede do poço, lugar de cultura numa incubadora de CO₂ da placa e incubar a 37 ° C, durante 1 h. mover a placa de cultura para uma bancada limpa. Antes da cultura de pilha, delicadamente descartar o K110 usando uma pipeta.
   Nota: Para proteger o gel, a ponta da pipeta deve tocar a parede do poço.

3. preparação da forma não-fibrosos de colágeno tipo I

Nota: Execute todos os procedimentos sob condições assépticas.

1. Adicionar 4 µ l de colágeno para 1,2 mL de 1mm ácido clorídrico (HCl) em um tubo de 1,5 mL e misture suavemente com uma pipeta.
   Nota: Prepare imediatamente antes da utilização de colágeno. Manter o colagénio e HCl refrigeradas até o momento da utilização.
2. Despeje 100 µ l de colágeno em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços, com uma pipeta. Agite suavemente a placa de cultura à esquerda para a direita o movimento e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
   Nota: Certifique-se que toda a superfície dos poços é coberta com a solução.
3. Após a incubação, descartar a solução de colágeno e lavar os poços com PBS (-) duas vezes, usando uma pipeta.
4. Despeje a 150 µ l de 1% bovina albumina de soro/PBS (-) (1% de BSA) para um poço da placa de 96 poços cultura e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. antes da cultura de pilha, descarte a BSA 1%.
   Nota: Certifique-se que toda a superfície dos poços é coberta com a solução.

4. cultura de células de FEPE1L-8

Nota: Execute todos os procedimentos sob condições assépticas.

1. Manter FEPE1L-8 células em K110 100mm cultura prato numa incubadora de CO₂ e incubadas a 37 ° C e 5% CO₂, a semi Confluencia.
2. Preparar K110, tripsina e inibidor de tripsina em banho maria a 37 ° C.
3. Retire cuidadosamente o meio do prato de cultura, adicionar 3 mL de tripsina 0,05%, com uma pipeta, coloque o prato numa incubadora de CO₂ e incubar a 37 ° C por 5 min. Após incubação, verificar o desprendimento de células da superfície do prato cultura usando microscopia de contraste de fase em ampliação de 10x.
   Nota: A morfologia das células isoladas torna-se redondo. Se as células se espalhou, incube por um período adicional de 5 min.
4. Adicionar 3 mL de inibidor de tripsina e coletar as células isoladas em um tubo de centrífuga de 15 mL com uma pipeta. Centrifugar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL a 200 x g por 5 min.
5. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de K110 usando uma pipeta. Contar as células usando microscopia de contraste de fase em ampliação de 10x e preparar a concentração de células no 5.0 x 10⁴ células/mL por diluição adequada com K110.
6. Delicadamente as sementes 0,1 mL de K110 com células em cada poço da placa de cultura usando uma pipeta ao longo da parede do poço. Coloque a placa de cultura numa incubadora de CO₂ e incubar a 37 ° C para a hora indicada (2 h, 1 dia, 3 dias).
   Nota: Para proteger o gel, a ponta da pipeta deve tocar a parede do poço.

5. estimativa do número de células viáveis

1. K110, incubar em banho maria a 37 ° C. Mix 130 µ l de sal de tetrazólio, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazólio, sal monossódico (WST-8) e 1,3 mL de K110 em um tubo de 2 mL com uma pipeta.
2. Mova a placa de cultura para uma bancada limpa e suavemente descartar o K110 usando uma pipeta. Delicadamente lavar as células não-aderentes com K110, usando uma pipeta
3. Adicionar 110 µ l de K110 misturado com WST-8 em cada poço usando uma pipeta, coloque a placa de cultura numa incubadora de CO₂ e incubar a 37 ° C por 2 h.
4. Mova a placa de cultura para uma bancada limpa, coletar 100 µ l do meio condicionado de cada poço e mova-o para um poço de outra placa de 96 poços de cultura. Medir a absorvância no comprimento de onda de 450 nm (OD₄₅₀) usando um leitor de microplacas e estimativa do número de células viáveis.

Resultados

Uma representação esquemática do tratamento das superfícies dos pratos de cultura usando tipo I colágeno é retratado na Figura 1. Morfologias célula observadas nos formulários não-fibrosa e fibrila são apresentadas nos painéis e direito-lado esquerdo da Figura 2, respectivamente. FEPE1L-8 células foram cultivadas por 2h (painéis superiores) e 3 dias (painéis inferiores). No h 2 inicial de cultivo, as células aderiram em espalhe em ambas as formas de colágeno (Figura 2, painéis superiores). Três dias após a semeadura, células na forma não-fibrosa continuam a se espalhar e celular número aumentado (Figura 2, painel inferior esquerdo). Em contraste, as células no formulário fibrila mostraram limitado espalhando (Figura 2, painel canto inferior direito). FEPE1L-8 células continuaram a proliferar na forma não-fibrosa de tipo eu colágeno (Figura 3, linha preta sólida, fechados círculos pretos) e o prato não tratada superfícies (Figura 3, pontilhado cinza linha, círculos fechados de cinza). Em contraste, as células não proliferar no formulário fibrila (Figura 3, linha pontilhada, círculos abertos). Figura 2 e Figura 3 foram modificados de Fujisaki et al¹¹.

Figura 1 : Representações esquemáticas das superfícies de prato de cultura tratada com tipo colágeno. Sob condições ácidas, colágeno tipo I moléculas são adsorvidas na superfície de um prato na forma não-fibrosa (painel esquerdo). Sob condições neutras a 37 ° C, colágeno tipo I moléculas são reagrupadas em fibrilas e adsorvidas na superfície dos pratos sob a forma de gel (painel direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Morfologia de células FEPE1L-8. FEPE1L-8 células em K110 foram cultivadas utilizando o formulário não-fibrosa (10 µ g/mL; painéis esquerdos) ou forma fibrila (1 mg/mL; painéis certo) de tipo I colágeno para 2h (painéis superiores) ou 3 dias (painéis inferiores). Barras brancas indicam a 100 µm. Figura 2 foi modificado de Fujisaki et al. na Figura 1E – H¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Proliferação de células FEPE1L-8. O número de células viáveis foram estimado na forma não-fibrosa (linha preta sólida, círculos preenchidos pretos) ou sobre a fibrila verbo (linha pontilhada, círculo aberto) tipo I colágeno ou superfícies não tratadas prato (tracejado cinzento, cinzento círculos preenchidos) para 2 h, 1 dia e 3 dias. Foram realizados experimentos em triplica e valores são mostrados como meios + SD Esta figura foi modificada de Fujisaki et al. em Figura 1J¹¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Alguns componentes de ECM, incluindo colágeno tipo I, forma tridimensional de estruturas em vivo¹. Cultivo em tal um tridimensional, gel de substrato fornece mais condições fisiológicas em vitro que sobre uma superfície bidimensional, plástica^1,2,3,4. Inúmeros protocolos em relação ao método de cultura de gel têm sido relatados, como o uso de tipo I colágeno^{1,2,3,4,6,7, 11}e de^14,de colágeno tipo IV¹⁵Matrigel¹⁶. Tipo I colágeno é um material bem definido e amplamente utilizado devido à sua abundância e facilidade de manuseio. As características do tipo purificado eu colágeno dependem do animal espécie, idade e purificação métodos^5,17. Tipo I colágeno pode ser purificado usando ácido acético e/ou proteases, tais como a pepsina, papaína e proctase^5,17. Colágeno solúvel em ácido mantém amino-telopeptídeos e colágeno solúvel-protease são clivados amino-telopeptídeos^5,17. O comprimento reservado de amino-telopeptídeos depende do tipo de proteases, e a presença de telopeptídeos afeta a morfologia de fibrila e gel força^5,17. A viscosidade de fibrilhas de colagénio solúvel em ácido é maior do que a de protease-tratados colagénios¹⁷. Neste estudo, nós usamos ácido solúvel bovina colágeno tipo I. Pepsina-solubilizado colágeno também pode ser usado no presente protocolo de cultura de gel; no entanto, a força de gel é mais fraco¹⁷. Estas diferenças nos materiais podem causar diferenças comportamentais de célula, mas atualmente não são bem compreendidos.

O protocolo de cultura de gel descrito neste estudo é muito simples. Muitas modificações deste método têm sido relatadas. Uma possível modificação para a cultura de queratinócitos é imitar a membrana basal. Gel de colágeno tipo IV pode ser melhor para manter uma estrutura de membrana basal, como substrato em vitro^15,18. No entanto, um longo período de incubação é necessário para a preparação do tipo IV colágeno gel^14,15,18. Em vez disso, mistura de colágeno tipo IV com tipo I gel de colágeno pode produzir substratos de cultura novela (tipo I / tipo IV colágeno híbrido géis)¹⁹. Estes geles híbrido são fáceis de manipular, exigem um tempo curto para gelificação e produzem mais condições de membrana basal-like para queratinócitos. No tipo I / geles de híbrido de colágeno tipo IV, queratinócitos sobrevivem, formam colônias e induzem a diferenciação terminal¹⁹. Este método híbrido tem aplicações versáteis.

Cultura em-gel usando tipo I colágeno afeta as células cancerosas. A forma de fibrila de colágeno tipo I, ativação de Akt e crescimento das células Caco-2 (uma linhagem de células do cancro do cólon) são suprimidos⁷. Além disso, o crescimento de células de melanoma humano (M24met) no formulário fibrila é preso no posto de controle G1/S²⁰. Além disso, marcadamente aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio é observado em murino 3T3-L1 preadipocytes cultivadas no formulário fibrila. Além disso, a migração e proliferação das células são estimuladas em direções opostas pelo não-fibrosa e formas de fibrila de tipo I de colágeno²¹.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina, de soro bovino (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Dissolva 1 g de pó BSA em 100 mL de PBS (-) e filtrado
Kit de Contagem de Células-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	sal de tetrazólio, 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)-2H  tetrazólio, sal monossódico (WST-8)
Colágeno tipo I (colágeno solúvel em ácido)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	de bovino (qualquer outra espécie disponível, a concentração é de 3,0 mg/mL
unidade de filtro de membrana descartável DISMIC acetato de celulose	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 µ M tamanho de poro
humano queratinócitos linha celular  FEPE1L-8			Doado Dr.W.G. Carter (Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	suplemento aditivo com 500 mg de BSA, 500 mg de extratos corporais da hipófise bovina, 2,5 mg de insulina, 0,05 µ g de h-EGF e 5 mg de heparina
K110 Tipo-II meio	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	meio de cultura basal de queratinócitos
K110 Meio tipo II com K-1 e penicilina-estreptomicina (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Adicionar 5 mL de Penicilina-Estreptomicina e 10 mL de suplemento aditivo (K-1) em 500 mL de meio de cultura basal de queratinócitos tipo II K110
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolva 1 bolsa de pó PBS (-) em 1000 mL de água deionizada e filtrado
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Dissolva 1 bolsa de pó PBS (-) em 100 mL de água deionizada e filtrado
Penicilina-Estreptomicina	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 unidades/mL de penisilina G e 10.000μ g/mL de sulfato de estreptmicina em solução salina fisiológica
Tampão fosfato solução salina vermelha Certificado BioPerformance, pH 7,4	Merck KGaA	P-5368-10 pack
Tripsina do pâncreas suíno	Merck KGaA	T4799
0,05 % de tripsina	Merck KGaA	T4799	Dissolve 0,25 g de tripsina e 0,186 g de EDTA.2Na em 500 mL de PBS (-) e filtrado
Inibidor de tripsina de soja	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Inibidor de tripsina	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Dissolver 50 mg de inibidor de tripsina e 500 mg de BSA em 500 mL de PBS (-) e filtrado