Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.
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Artigo de método
Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Eletroforese em gel de DNA usando agarose é uma ferramenta comum em laboratórios de biologia molecular, que permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho. Após a separação, o DNA é visualizado pela coloração. Este artigo demonstra como usar o DNA de tiazol laranja para manchar. Laranja de tiazol compara-se favoravelmente a métodos comuns de coloração, em que é sensível, barata, excitáveis com UV ou luz azul (para não danificar a amostra) e mais seguro do que o brometo de etídio. Laboratórios já equipados para executar experiências de electroforese de DNA utilizando o brometo de etídio geralmente podem alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes, usando luz UV para a deteção. Deteção de luz azul para evitar dano da amostra além disso pode ser alcançada com um filtro de fonte e de emissão de luz azul. Laboratórios já equipados para a deteção de luz azul podem simplesmente alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes.
Introdução
A finalidade desse método é identificar o DNA em gel de agarose usando tiazol laranja (a) para a deteção de fluorescência. Devido a seu perfil de segurança de baixo custo e favorável, laranja tiazol pode ver benefício particular em laboratórios de ensino de graduação e laboratórios de pesquisa, realizando a biologia molecular, especialmente a ligadura e a clonagem.
Brometo de etídio permanece o corante mais comum para detecção de DNA em gel de agarose. Isto é principalmente porque pode ser obtido muito barata e requer apenas excitação com luz UV para a deteção. Ambas as ethidium brometo e tiazol laranja são baratos, com deteção de baixos li....
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Protocolo
1. preparar o gel
Nota: Para protocolos de eletroforese de gel geral, ver também P.Y. Lee, et al. 14.
- Misture a agarose (~ 1% p/v, percentagem pode ser variada para separações de determinado tamanho) em buffer (aproximadamente 70 mL para um mini gel (8 x 7 cm)). Buffers são comumente TAE (pH tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8,6) ou TBE (pH tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).
- Adicione tiazol laranja para uma concentração final de 1,3 μg/mL.
- Dissolva tiazol laranja em DMSO, tornar-se uma solução ....
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Resultados
Laranja de tiazol permite a detecção de DNA, sem o uso de brometo de etídio e sem usar luz UV nocivas para o DNA. Brometo de etídio é conhecido para ser mutagénico, para que eliminá-la do laboratório pode ser vantajoso. Luz UV danifica o DNA e reduz a eficiência de transformação significativamente, Considerando que a luz azul não danifica o DNA. Limites de detecção são semelhantes entre o brometo de ethidium, tiazol laranja e um corante comercial comum, azul-luz – detectável do DNA (Figura 1.......
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Discussão
Brometo de etídio tem sido uma ferramenta padrão no laboratório de biologia molecular, apesar de toxicidade conhecida. Ele também sofre de exigir que a luz UV, que danifica o ADN, como ele está sendo detectado. Laranja de tiazol oferece uma alternativa barata para brometo de etídio, bem como corantes comerciais úteis mas caros.
Os benefícios da laranja tiazol são, portanto, duas vezes. Primeiro, laranja tiazol simplesmente pode ser usada como um substituto para o brometo de etídio. Géis podem .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização a TDG de Christopher Newport University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Escada de DNA de 2 logs | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Grau de Análise Genética) | Fisher | BP1356-100 | |
| Lanterna de luz azul | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE LED azul | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| etídio brometo | Fisher | BP1302-10 | Para comparação, não é necessário para o protocolo |
| Aparelho de gel (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Kit de extração de gel Qiagen | 28704 | ||
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessário para usar lanterna de luz azul.* |
| SafeImager 2.0 (Transiluminador de luz azul) | Invitrogen | G6600 | pode ser usada como alternativa |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Para comparação, não é necessário para o protocolo |
| TAE (Tris-Acetato-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Os óculos também estão incluídos no Invitrogen G6600 |
Referências
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N.
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Reimpressões e permissões
