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Artigo de método

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

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DOI:

10.3791/59382

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31 de março de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Neste artigo

Resumo

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

Resumo

CCCTC-fator obrigatório (CTCF)-mediada estável topologicamente associando domínios (TADs) desempenham um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs. CTCF desempenha um papel importante na regulação da expressão espacial e temporal de genes HOX que controlam o desenvolvimento embrionário, modelação do corpo, hematopoiese e leukemogenesis. No entanto, permanece em grande parte desconhecido se e como HOX loci associados CTCF limites regulam a organização da cromatina e expressão dos genes HOX . No actual protocolo, foi gerada uma biblioteca em pool específico sgRNA todos os sítios de ligação CTCF os loci HOXA/B/C/D para examinar os efeitos da rompendo limites de cromatina CTCF-associado em formação TAD e gene Homeótico expressão. Através de CRISPR-Cas9 rastreio genético, o sítio de ligação do CTCF localizado entre genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) foi identificado como um regulador crítico do domínio de cromatina oncogênica, bem como sendo importantes para a manutenção de uma gravidez ectópica gene HOX padrões de expressão em MLL-rearranjou a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, esta biblioteca sgRNA triagem abordagem fornece novos insights sobre organização de genoma CTCF mediada loci de genes específicos e também fornece uma base para a caracterização funcional dos elementos normativos genéticas anotados, ambos de codificação e não-codificante, durante processos biológicos normais na época do projeto genoma pós humano.

Introdução

Recentes estudos de interacção do genoma revelaram que os formulários do genoma nuclear humano estável domínios topologicamente associados (TADs) que são conservados entre as espécies e tipos de células. A organização do genoma em domínios separados facilita e restringe as interações entre elementos reguladores (por exemplo, potenciadores e promotores). O fator de ligação CCCTC (CTCF) liga-se aos limites do TAD e desempenha um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs1. Dados de vinculação CTCF amplo do genoma revelaram, no entanto, que embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina em um site específico no tipo de uma célula, mas não na outra, sugerindo que funções do CTCF juntamente com outras atividades na formação de cromatina limites2. O que permanece desconhecido é se os elementos de contorno (sites de ligação CTCF) estão directamente relacionados com a função biológica do CTCF e como ocorrem esses links. Portanto, nós hypothesize que sítios específicos de ligação CTCF no genoma diretamente regulam a formação de TADs e controlam interações promotor/realçador dentro desses domínios ou entre domínios vizinhos. A conclusão dos humanos e projetos de sequenciamento do genoma do rato e subsequentes análises epigenéticas ter descoberto novas assinaturas genéticas e moleculares do genoma. No entanto, o papel de assinaturas/modificações específicas na regulação gênica e função celular, bem como seu mecanismo molecular (s), ainda tem que ser completamente compreendido.

Várias linhas de evidência suportam que o TADs CTCF-mediada representam cromatina funcional domínios3,4,5. Embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, genoma ampla CTCF ChIP-seq dados revelaram que CTCF muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina no tipo de uma célula, mas não em outros2. CTCF desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento mediando genoma organização4,6,7. Rompimento de limites CTCF prejudicada interações realçador/promotor e expressão do gene, levando à obstrução do desenvolvimento. Isto sugere que a CTCF mediada TADs não são apenas componentes estruturais, mas também unidades regulamentares necessárias para o adequado potenciador ação e gene transcrição5,8,9.

Genes HOX desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento embrionário, e eles são temporalmente e espacialmente restritas em seus padrões de expressão. O locus HOXA forma dois TADs estáveis separando genes anteriores e posteriores por um elemento de limite CTCF-associado em hESCs e IMR90 as células1. Relatórios recentes demonstraram que o HoxBlinc, um lncRNA de locus associado HoxB , Medeia a formação do CTCF dirigido Tad e interações realçador/promotor no locus HOXB . Isto leva à ativação do gene HOXB anterior durante ESC compromisso e diferenciação10. Além disso, em loci de genes específicos incluindo o locus HOXA , alteração do CTCF mediada TAD domínios mudados linhagem perfis de expressão de genes específicos e foi associada com o desenvolvimento da doença Estados11,12. A evidência suporta uma função primária para CTCF na coordenação da transcrição do gene e determinar a identidade da célula organizando o genoma em domínios funcionais.

Apesar de seu papel no desenvolvimento embrionário, durante a hematopoiese, genes HOX regulam a função de célula (HS/PC) de haste e progenitoras hematopoiética. Isso é feito controlando o equilíbrio entre a proliferação e diferenciação de10,13,14,15. A expressão dos genes HOX é fortemente regulamentada em toda a especificação e a diferenciação das células hematopoiéticas, com maior expressão em HS / PCs. HOX expressao diminui gradualmente durante o amadurecimento, com seus níveis mais baixos ocorrendo em diferenciados de células hematopoiéticas16. Desregulagem do gene HOX é um mecanismo dominante das transformações leucêmicas por propriedades de auto-renovação e diferenciação de dysregulating levando a transformação leucêmicas17,18HS/PCs. No entanto, o mecanismo de estabelecimento e manutenção normal vs padrões de expressão oncogênica de genes HOX , bem como redes de regulação associadas permanece obscuro.

Rastreio de biblioteca CRISPR-Cas9 sgRNA tem sido amplamente utilizado para interrogar de genes codificantes de proteínas19 como genes bem como não-codificantes, como20 e miRNA lncRNA21 em diferentes espécies. No entanto, o custo para usar a biblioteca de sgRNA CRISPR-Cas9 para identificar novos alvos genômicos permanece elevado, porque o sequenciamento do genoma do elevado-throughput é muitas vezes aplicado para verificar o rastreio de biblioteca de sgRNA. Nosso sistema de rastreio de sgRNA está focada em locus específico do genoma e avalia o direcionamento sgRNAs através de uma etapa de RT-PCR de acordo com a expressão de gene marcador, como HOXA9. Além disso, Sanger sequenciamento confirmou que o sgRNA foi integrado no genoma e mutações Indel pode ser detectado para identificar o sgRNA segmentação local. Através do rastreio genético do CRISPR-Cas9 locus específico, o limite de cromatina de CBS7/9 foi identificado como um regulador fundamental para estabelecer o domínio de cromatina oncogênicos e manter padrões de expressão de gene HOX ectópica na patogênese da LMA 12. o método pode ser amplamente aplicado para identificar não somente a função específica de limite CTCF no desenvolvimento embrionário, a hematopoiese, leukemogenesis, mas também limite CTCF como alvos terapêuticos para futura terapia epigenética.

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Protocolo

1. CTCF sgRNALibrary projeto usando uma ferramenta on-line

  1. Desenha o sgRNA sítios de ligação CTCF os loci de HOX humano usando a ferramenta de designer perturbação genética plataforma (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Sintetiza um total de 1.070 sgRNAs consistindo de sgRNAs visando 303 genes alvos aleatórios, 60 controles positivos, 500 controles não-humanos-direcionamento e 207 elementos CTCF ou lncRNA alvejando genes (Figura 1, tabela 1). Cada elemento de DNA alvo é alvo de diferentes sgRNAs de 5-10.

2. sgRNA biblioteca clonagem

  1. Clone os oligonucleotides sintetizados para o vetor de Lentivirus espinha dorsal CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digeri o vetor de LentiCRISPRv2 com a enzima de restrição BsmBI a 37 ° C por 2 h.
    2. Procure a presença da maior banda (cerca 12.873 bp) sobre o gel após a digestão de BsmBI e purificá-la em seguida com o kit de extração do gel.
      Nota: Um pedaço de pequeno enchimento kb 2 também está presente no gel após a digestão, mas isso deve ser ignorado.
    3. Ligam os oligonucleotides sintetizados e digerido LentiCRISPR vector com 150 ng de digerido LentiCRISPR DNA, 1 µ l de 10 µM oligos, 2 µ l de tampão de ligase x T4 10, 1 µ l de T4 ligase e incube-os a 16 ° C durante a noite.
  2. Transforme a Lentivirus CRISPR/sgRNA biblioteca em células electro-competente para amplificação.
    1. Preparar o electroporator em 1.8 kV, 200 Ω e 25 µF. Em seguida, pré-aquecer a recuperação de mídia SOC em banho maria a 37 ° C e pré-aquecer LB placas de antibiótico ampicilina a 37 ° C.
    2. Descongele as células competentes no gelo por 10 min.
    3. Prepare os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e 1 mm cubetas de eletroporação no gelo.
    4. Misture 1 µ l de um 10 ng / µ l biblioteca plasmídeo em 25 μL de células competentes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misture suavemente por agredir o fundo do tubo algumas vezes manualmente.
    5. Uma vez que a cubeta é bastante fria, transfira a mistura de célula DNA/competente para isso. Toque duas vezes na bancada e limpe qualquer gotículas de água do exterior da cubeta com um papel absorvente. Depois, coloque a cubeta no módulo electroporation e pressione o pulso.
    6. Imediatamente adicione 975 µ l de 37 ° C pré-aquecido SOC media. Mix por pipetagem para cima e para baixo e transferir para um tubo de 15 mL.
    7. Girar e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
    8. Diluir 100 células µ l em 900 µ l da mídia SOC... e coloque uma placa de ágar antibiótico ampicilina LB 100 µ l. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
  3. Extrai o DNA do plasmídeo de colônias combinadas usando uma coluna maxi-prep, conforme detalhado no protocolo do fabricante.
    1. Raspar todas as colónias da placa de ágar LB e inocular uma cultura de acionador de partida de 2 mL de meio de antibiótico ampicilina LB e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação vigorosa (~ 200 x g).
    2. Diluir a 1: 500 a cultura starter em 100 mL de meio de ampicilina LB e incubar a 37 ° C, durante 12-16 h com agitação vigorosa (~ 200 x g).
    3. Colher o sedimento de célula bacteriana por centrifugação a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    4. Ressuspender o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de suspensão.
    5. Lyse o sedimento suspenso com 10 mL de tampão de Lise e vigorosamente inverter 4 - 6 vezes. Incube o lisado por 5 min à temperatura ambiente.
    6. Neutralize o lisado com 10 mL de tampão de neutralização refrigerados. Misture por inversão suavemente os tubos de 4 - 6 vezes e incube-lo por 20 min no gelo.
    7. Spin para baixo a 13.500 x g durante 30 min a 4 ° C. Prontamente, transferi o sobrenadante contendo o plasmídeo de DNA para um novo tubo.
    8. Repita a etapa 2.3.7 e prontamente transferir o sobrenadante contendo o plasmídeo de DNA para um novo tubo.
    9. Equilibrar a coluna aplicando-se 10 mL de tampão de equilíbrio e permita que a coluna vazia pelo fluxo de gravidade.
    10. Adicionar o sobrenadante para a coluna e deixe-o entrar a resina pelo fluxo de gravidade.
    11. Lave a coluna com 2 x 30 mL de tampão de lavagem.
    12. Eluir o DNA com 15 mL de tampão de eluição.
    13. Precipitar o DNA com 10,5 mL de isopropanol temperatura ao DNA eluted. Mix e spin para baixo imediatamente a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° C e suavemente, decante o sobrenadante.
    14. Lavar o sedimento de DNA com 5 mL de etanol a 70%, pelota do ADN de centrifugação a 15.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante claro.
    15. Repita a etapa 2.5.14 mais duas vezes.
    16. Centrifugar a pelota do ADN em 15.000 x g durante 10 minutos e suavemente, decante o sobrenadante sem perturbar o sedimento de DNA.
    17. Secar ao ar livre a pelota por 5-10 min e dissolver o DNA em um volume necessário de buffer (buffer de TE, pH 8.0).

3. a alta Titer sgRNA geração de Lentivirus de biblioteca

  1. Preparação de células: células de cultura HEK293T em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS) e antibiótico penicilina de 1% (vol/vol)-estreptomicina (PS) em frascos de T-25. Colocá-los na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
  2. Pacote de lentivirus: co transfect HEK293T células com 20 µ g de vetores de biblioteca purificado da etapa 2, 15 µ g do plasmídeo de pacote (psPAX2) e 10 µ g do plasmídeo de envelope (pMD2.G) para 48 h antes da colheita os vírus.
  3. Coleção de vírus: após 48 h, vírus de recebero sobrenadante e filtrar o sobrenadante através de uma membrana PVDF de ligação de baixa proteína de 0,45 µm de vírus.
  4. Concentração de vírus: concentrar-se o sobrenadante Lentivirus 50-fold usando o concentrador e testar o vírus MOI na etapa 5.
  5. Armazenamento de vírus: o concentrado de alíquota vírus e guarde no congelador a-80 ° C.

4. otimizado puromicina concentração

  1. Cultura de células de leucemia: células de cultura MOLM13 AML em RPMI 1640 suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS) e 1 x antibióticos penicilina-estreptomicina (PS) num balão de T-125. Coloque-os em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: As células normalmente são passadas a cada 4-5 d em um split ratio de 1:4 ou 1:6, nunca permitindo que as células alcançar mais de 70% confluência.
  2. Configure MOLM13 células em uma placa de 12 com uma densidade de 1,0 x 104 células/mL, em um volume total de 2 mL por bem (2.0 x 104 células).
  3. Ensaio de tempo-curso: células MOLM13 tratar com puromicina durante 7 dias em aumentar as concentrações (0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL)
    1. Configurar MOLM13 células sem puromicina no dia 0 e configurar 3 poços replicar sem puromicina como um controle do dia 0 ao dia 7.
    2. Trate MOLM13 células com 0,1 µ g/mL, 0,2 µ g/mL, 0,5 µ g/mL, 1,0 µ g/mL e 2,0 µ g/mL, separadamente, com cada condição experimental contendo 3 poços de replicar.
    3. Conta a proporção de células vivas e fazer uma curva de sobrevivência do dia 0 ao dia 7, contendo todas as condições.
  4. Curva de sobrevivência: colorir células com Trypan azul e contagem de viabilidade diariamente para obter as curvas de sobrevivência para cada concentração de puromicina.
  5. Otimizando a concentração mínima de puromicina: determinar a concentração mínima de puromicina através de coloração de azul de Tripan, no qual MOLM13 todas as células são mortas entre 5-7 dias.

5. titulação de Lentivirus biblioteca em células de leucemia MOLM13

  1. AML células preparação: coletar células da LMA MOLM13 com o meio de transdução (RPMI 1640, 10% FBS, PS 1% e médio de revestimento 8,0 µ g/mL) em uma densidade de 1,5 x 106 células /mL.
  2. Células MOLM13 lugar na placa de 12 com 1,5 x 106 células em cada poço.
  3. Descongelar o lentivirus: Retire o lentivirus concentrada do freezer-80 ° C e derretê-lo no gelo.
  4. MOLM13 mistura de células com uma dose diferente do lentivirus concentrada em poços separados, incluindo 0, 1, 2,5, 5, 7,5 e 10 µ l (totais 6 grupos).
  5. Imediatamente Centrifugue estas misturas a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C e transferir as placas 12-poços para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para 4 h.
  6. Após 4 h, spin para baixo as células infectadas a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  7. Delicadamente aspirar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, re-suspender as células transduzidas com mídia fresca (RPMI 1640, PS FBS e 1% de 10%) e transferi-los para frascos de T-25 e incubar a 37 ° C, durante 48 h sem puromicina.
  8. Após 48 h, dividir estas células em 2 frascos (2 grupos): um grupo experimental tratado com 1 puromicina µ g/mL por 5 dias e um grupo controle sem puromicina durante 5 dias.
  9. Realize puromicina durante 5 dias com 1 puromicina µ g/mL de acordo com o passo 4 até que todas as células não transfectadas controle estão mortas. Troca de mídia fresca cada 2 dias.
  10. Medir o valor MOI otimizado para transdução, dividindo o número de células vivas, tratados com puromicina com o número de células sem puromicina.

6. transdução da biblioteca KO em pool CRISPR-Cas9

  1. Transdução com lentivirus: infectar 1.5 x 106 MOLM13 células com 0,3 MOI de lentivirus sgRNA pool no meio (RPMI 1640, 10% FBS, PS 1% e 8 µ g/mL de meio de revestimento) na placa de 6 e usar as células sem a infecção de lentivirus como um controle.
  2. Imediatamente Centrifugue a placa de 6 a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C, para spinfect as células e transferir as placas para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 para 4 h.
  3. Gire para baixo as células infectadas a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Delicadamente Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, re-suspender as células transduzidas com mídia fresca (RPMI 1640, PS FBS e 1% de 10%) e transferi-los para frascos de T-25 e incubar a 37 ° C, durante 48 h sem puromicina.
  5. Após 48 h, trate as células com 1 puromicina µ g/mL por 5 dias. Troca de mídia fresca depois de 2 dias e manter-se em uma densidade de célula ideal.
  6. Propagar o único clone em placas de 96 poços, com limitação de métodos de diluição e incubar estes clones único a 37 ° C e 5% de CO2. Cultura-los por 3-4 semanas.
  7. Depois de uma única célula cresce em uma população, transfira metade das células em placas de 24 boas para ainda mais cultura sob puromicina e verifique se estes clones na próxima etapa. Com o resto das células.

7. a despistagem da biblioteca de KO CRISPR-Cas9 em pool com uma etapa RT-qPCR

  1. Determine a eficácia do clone integrado sgRNA triagem por avaliar a expressão do gene marcador HOXA9 com um passo transcriptase reversa cadeia da polimerase (RT-qPCR uma etapa).
    Nota: HOXA9 são altamente expressa em células MOLM13 AML em leukemogenesis22,23.
  2. Contagem de sgRNA integrada MOLM13 célula e transferência 1 x 104 células por poço em uma chapa de PCR de 96 poços.
  3. Centrifugar o tubo a 1.000 x g por 5 min e então cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar o centrifugado.
  4. Lavam-se células com 125 µ l de tampão PBS e centrifugar o tubo a 1.000 x g por 5 min. Então 120 µ l do sobrenadante com uma pipeta de remover e reter cerca de 5 µ l de PBS em cada poço.
  5. Adicione 50 µ l da célula lise mestre mistura contendo 48 µ l de tampão de lise celular, 1 µ l de solução de proteinase K (10 mg/mL) e 1 µ l de solução de DNase (1 mg/mL) a cada poço. Em seguida, pipeta e descer 5 vezes para re-suspender o centrifugado.
  6. Incubar a mistura durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por 5 min a 37 ° C e em seguida de 75 ° C por 5 min.
  7. Armazene o lisado celular no congelador-80 ° C.
  8. A preparação da reação de RT-qPCR uma etapa: descongelar a mistura de reação de uma etapa e outros componentes de reação de 4 ° C. Em seguida spin para baixo brevemente para coletar soluções na parte inferior dos tubos e colocar no gelo sem luz. Misture e girar suavemente.
  9. Adicionar 1 µ l de lisado celular nos poços PCR com a mistura de reação de RT-qPCR, incluindo 1 µ l de primer para a frente do gene marcador (300 nM) e inverter a primeira demão (300 nM), 0.125 µ l de transcriptase reversa (10 U / µ l) e 5 µ l da mistura de reação de uma etapa (2x).
  10. Selar poços com película opticamente transparente e suavemente vórtice e misturar os componentes da reação.
  11. Coloque a placa PCR de 96 poços em um instrumento PCR em tempo real.
  12. Executar a reação de transcrição reversa para 10 min a 50 ° C, seguido de inactivação de polimerase e desnaturação do ADN por 1 min a 95 ° C.
  13. Executar o RT-PCR com 40 ciclos de reação de PCR: desnaturação por 15 s em fluorescência de 95 ° C, recozimento/extensão e placa lendo por 20 s em 60 ° C e então análise de curva de derretimento 65-95 ° c através de incrementos de 0,5 ° C em 2-5 s/etapa.
  14. Configure upregulated, ativador e nenhum grupo de mudança de acordo com os níveis de expressão do gene HOXA9 em comparação ao controle, separadamente. Use o gene β-actina como um controle do gene das tarefas domésticas.

8. verificação da sgRNAs integrada Clones positivos através da genotipagem e sequência de Sanger

  1. Verifique se os clones de expressão HOXA9 diminuída através de Sanger sequenciamento e realizar PCR com 50-100 genoma de ng MOLM13 DNA, 5 µ l do polymerase amortecedor da reação (10x), 1 µ l para a frente da primeira demão (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) e 1 µ l reverso primeira demão (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µ l do dNTP (10mM), polymerase de 1 unidade (5 U /µL). Realizar a reação de PCR com a desnaturação inicial a 94 ° C por 30 s e em seguida mais desnaturação a 94 ° C, durante 20 s, recozimento a 56 ° C durante 20 s, extensão a 68 ° C, durante 20 s (total 30 ciclos), uma extensão final a 68 ° C por 10 min e em seguida, segurando a 4 ° C.
  2. Extrair e purificar os produtos PCR (bp tamanho 285) com um Kit de purificação de PCR.
  3. Ligam os produtos PCR purificados para o vetor T com 2 µ l T4 ligadura buffer (10x), 50 ng T vector DNA (50 ng / µ l), 25 ng purificado PCR DNA (285 bp), ligase do T4 de 1 µ l (3 unidades / µ l) e lugar a ligadura se misturam em uma incubadora a 16 ° C durante a noite.
  4. Transferir a mistura de ligadura em células competentes DH5α, crescer em uma placa de ágar antibiótico ampicilina LB e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  5. Escolha os único clones da placa LB e verificá-los por genotipagem e Sanger sequenciamento.

9. detecção de sgRNAs mutação de Indel induzida por Nuclease digestão ensaio

  1. Detecta que o sgRNA integrado único clone induzido Indel taxas por um ensaio de teste de nuclease.
  2. Separadamente, preparar PCR amplicons com 50-100 ng Indel mutante (teste) e DNA de tipo selvagem (WT, referência) como modelo PCR, 5 amortecedor (10x) da reação da polimerase µ l dNTP 1 µ l (10mM), 1 unidade do polymerase (5 U / µ l), primeira demão para a frente de 1 µ l (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') e 1 µ L reverso da primeira demão (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). A reação de PCR foi realizada com a desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s e, em seguida, desnaturação a 98 ° C, durante 20 s, recozimento a 56 ° C durante 20 s, com extensão a 72 ° C por 30 s (total 30 ciclos) e uma extensão final a 72 ° C por 10 min e segurando a 4 ° C.
  3. Configurar o grupo de mistura doheteroduplex com 200 ng a "referência" (20 ng / µ l) e 200 ng de "teste" (20 ng / µ l) PCR amplicons no tubo de 0,2 mL do PCR e o grupo de mistura homoduplex com apenas 400 ng de "referência" PCR amplicons como um controle.
  4. Separadamente, incube a mistura doheteroduplex e homoduplex a 95 ° C por 5 min num copo de 1 L, preenchidos com 800 mL de água e depois de arrefecer gradualmente a temperatura para recozer e formar doheteroduplex ou homoduplexes.
  5. Separadamente a digerir 400 ng da mistura doheteroduplex e homoduplex recozida com 1 µ l indel mutação deteção nuclease (2,5 U / µ l) e 2 µ l da nuclease amortecedor da reação (10x) a 42 ° C por 60 min.
  6. Analisar as amostras digeridas com eletroforese em gel de agarose, o DNA de mistura de doheteroduplex deve ser cortado em pequenos fragmentos (bp 70-250) e o DNA do homoduplex (320 bp) não devem ser cortados.

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Resultados

CRISPR-Cas9 tecnologia é uma ferramenta poderosa da pesquisa para estudos de genômicas funcionais. Ele é rapidamente substituindo o gene convencional, técnicas de edição e tem alta utilidade para aplicações de gene com foco todo o genoma e individuais. Aqui, a primeiro individualmente clonado loci específicos CRISPR-Cas9-vestiu sgRNA biblioteca contém 1.070 sgRNAs consistindo de sgRNAs visando 303 genes alvos aleatórios, 60 controles positivos, 500 controles não-humanos-direcionamento e 2...

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Discussão

Genes codificantes de proteínas relacionadas com bibliotecas de sgRNA foram aplicadas em um sistema funcional de triagem para identificação de genes e redes, regulação de funções celulares específicas através de sgRNA enriquecimento24,25,26 ,de27,28. Região não-codificante vários relacionados com bibliotecas de sgRNA também foram mostradas em telas funcionais...

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Divulgações

Temos sem conflitos de interesse relacionados a este relatório.

Agradecimentos

Os autores também agradecer Nicholas Cesari para editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado por concessões do Instituto Nacional de saúde (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromicinaThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 células Tecnologias de Vida 
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems Ligase PromegaA137A
T4New England Biolabs  Kit de Extrato de Gel M0202S
QIAquickQIAGEN28706
QIAuick Kit de purificação PCRQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR®   Kit verde de uma etapaBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Soro fetal bovino (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicilina/estreptomicina/L-glutamina Tecnologias de Vida 
Concentrador Lenti-X Solução Clontech631232
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific  25-507
Tampão TAE Thermo Fisher Scientific FERB49
Surveyor® Kits de Detecção de Mutações IntegradoDNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrífuga 5424 REppendorf5404000138
Banhos Secos Digitais/Aquecedores de BlocoThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Ultra-Low FreezersThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2  IncubadorasThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Gabinete de Segurança Biológica Classe IIThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Lenda™ Série de Centrífugas XT/XFThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™   Isotemp™ Banhos de ÁguaThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™   Localizador™ Sistemas Plus Rack and BoxThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Sistema de Detecção de PCR em Tempo RealBio-Rad1855195
MiniAmp™ TermocicladorApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™   Coruja™ EC300XL2 Fonte de Alimentação CompactaThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™   Coruja™ EasyCast™ Sistemas de Eletroforese em Gel Mini B1Thermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Rotador de Tubos e RotisseriesVWR International10136-084
VWR® Mini agitador de incubaçãoVWR International12620-942
Balança analítica MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX e DS-11 FX+ EspectrofotômetroDeNovix Inc.DS-11 FX
C7373031196508410378016

Referências

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