HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

Huacheng Luo; Amin Sobh; Christopher  D. Vulpe; Edmond Brewer; Sinisa Dovat; Yi Qiu; Suming Huang

doi:10.3791/59382

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Artigo de método

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

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DOI:

10.3791/59382

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31 de março de 2019

Huacheng Luo¹ , Amin Sobh² , Christopher D. Vulpe² , Edmond Brewer¹ , Sinisa Dovat¹ , Yi Qiu³ , Suming Huang¹

¹Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, ²Department of Physiological Sciences, University of Florida, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Neste artigo

Resumo

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

Resumo

CCCTC-fator obrigatório (CTCF)-mediada estável topologicamente associando domínios (TADs) desempenham um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs. CTCF desempenha um papel importante na regulação da expressão espacial e temporal de genes HOX que controlam o desenvolvimento embrionário, modelação do corpo, hematopoiese e leukemogenesis. No entanto, permanece em grande parte desconhecido se e como HOX loci associados CTCF limites regulam a organização da cromatina e expressão dos genes HOX . No actual protocolo, foi gerada uma biblioteca em pool específico sgRNA todos os sítios de ligação CTCF os loci HOXA/B/C/D para examinar os efeitos da rompendo limites de cromatina CTCF-associado em formação TAD e gene Homeótico expressão. Através de CRISPR-Cas9 rastreio genético, o sítio de ligação do CTCF localizado entre genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) foi identificado como um regulador crítico do domínio de cromatina oncogênica, bem como sendo importantes para a manutenção de uma gravidez ectópica gene HOX padrões de expressão em MLL-rearranjou a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, esta biblioteca sgRNA triagem abordagem fornece novos insights sobre organização de genoma CTCF mediada loci de genes específicos e também fornece uma base para a caracterização funcional dos elementos normativos genéticas anotados, ambos de codificação e não-codificante, durante processos biológicos normais na época do projeto genoma pós humano.

Introdução

Recentes estudos de interacção do genoma revelaram que os formulários do genoma nuclear humano estável domínios topologicamente associados (TADs) que são conservados entre as espécies e tipos de células. A organização do genoma em domínios separados facilita e restringe as interações entre elementos reguladores (por exemplo, potenciadores e promotores). O fator de ligação CCCTC (CTCF) liga-se aos limites do TAD e desempenha um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs¹. Dados de vinculação CTCF amplo do genoma revelaram, no entanto, que embora CTCF principalmente interage com os mesmos DN....