Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Louis Masclef; Uriarte Maxime; Oumaima Ahmed; Nadine Sen Nkwe; Haithem Barbour; Nicholas  V.G. Iannantuono; Amina Boubekeur; Salima Daou; El Bachir Affar

doi:10.3791/59385

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Artigo de método

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

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DOI:

10.3791/59385

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25 de julho de 2019

Louis Masclef^*¹ , Uriarte Maxime^*¹ , Oumaima Ahmed¹ , Nadine Sen Nkwe¹ , Haithem Barbour¹ , Nicholas V.G. Iannantuono¹ , Amina Boubekeur¹ , Salima Daou¹^,² , El Bachir Affar¹^,²

¹Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, ²Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Resumo

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em várias vias de sinalização e é notavelmente envolvida na coordenação da função de cromatina e processos associados ao DNA. Esta modificação envolve uma ação seqüencial de diversas enzimas que incluem E1 ubiquitin-ativando, E2 ubiquitina-conjugating e E3 ubiquitina-ligase e é revertida por deubiquitinases (DUBs). A ubiquitinação induz a degradação de proteínas ou alteração da função protéica, incluindo modulação da atividade enzimática, interação proteína-proteína e localização subcelular. Uma etapa crítica em demonstrar a ubiquitinação da proteína ou o deubiquitination é executar in vitro reações com componentes purified. As reações eficazes do ubiquitinação e do deubiquitination podiam extremamente ser impactadas pelos componentes diferentes usados, pelos cofactores da enzima, pelas condições do amortecedor, e pela natureza do substrato. Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a realização de reações de ubiquitinação e deubiquitinação. Nós ilustramos estas reações usando componentes mínimos do rato polycomb repressive complexo 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, uma ligase de ubiquitina E3 que monoubiquitinates histona H2A em lisina 119. A deubiquitinação da H2A nucleossomal é realizada por meio de um complexo mínimo de Policomb repressivo Deubiquitinase (PR-DUB) formado pelo deubiquitinase humano BAP1 e pelo domínio do adaptador DEUBiquitinase (DEUBAD) de seu fator ASXL2. Esses ensaios de ubiquitinação/deubiquitinação podem ser conduzidos no contexto de nucleossomas recombinantes reconstituídos com proteínas purificadas por bactérias ou nucleossomas nativos purificados de células de mamíferos. Destacamos as complexidades que podem ter um impacto significativo sobre essas reações e propomos que os princípios gerais desses protocolos possam ser rapidamente adaptados a outras ligases e deubiquitinases de ubiquitina da E3.

Introdução

A ubiquitinação é uma das modificações pós-translacionais mais conservadas e é fundamental para uma grande variedade de organismos, incluindo leveduras, plantas e vertebrados. A ubiquitinação consiste na fixação covalente da ubiquitina, um polipeptídeo de aminoácido 76 altamente conservado, para direcionar proteínas e ocorre em três etapas sequenciais envolvendo três enzimas, ou seja, E1-ativando, E2-conjugating e E3 ligase¹^, ²^,³. Esta modificação pós-translacional desempenha papéis centrais em um amplo espectro de processos biológicos. De fato, as ligases da E3, que proporc....