Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Resumo

O perfilamento Proteomic de proteínas tyrosine-nitrated foi uma técnica desafiante devido à baixa abundância da modificação da 3-nitrotyrosine. Aqui nós descrevemos uma aproximação nova para o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptide usando a angiotensina II como o modelo. Este método pode ser estendido para outros sistemas in vitro ou in vivo .

Resumo

A nitração proteica é uma das mais importantes modificações pós-translacionais (PTM) sobre os resíduos de tirosina e pode ser induzida por ações químicas de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS) em células eucarióticas. A identificação precisa dos sítios de nitorização nas proteínas é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos relacionados à nitração proteica, como inflamação, envelhecimento e câncer. Desde que as proteínas sulfonados são da baixa abundância nas pilhas mesmo circunstâncias induzidas, nenhuns métodos universais e eficientes foram desenvolvidos para o perfilamento e a identificação de locais da nitração da proteína. Aqui nós descrevemos um protocolo para o enriquecimento do nitropeptide usando uma reação da redução química e a rotulagem da biotina, seguidas pela espectrometria maciça de alta resolução. Em nosso método, os derivados de nitropeptídeos podem ser identificados com alta precisão. Nosso método exibe duas vantagens em comparação com os métodos relatados anteriormente. Primeiro, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear a amina primária em nitropeptídeos, que podem ser usados para gerar resultados quantitativos. Em segundo, uma ligação do dissulfeto que contem o reagente de NHS-biotina é usada para o enriquecimento, que pode mais ser reduzido e alquilados para realçar o sinal da deteção em um espectrómetro maciço. Este protocolo foi aplicado com sucesso ao peptide modelo angiotensina II no papel atual.

Introdução

A nitração de resíduos de tirosina em proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muitos processos biológicos. Devido às diferentes propriedades químicas entre tirosina e 3-nitrotirosina, uma proteína nitrada pode ter perturbado a atividade de sinalização^1,2. Conseqüentemente, é importante desenvolver os métodos que podem enriquecer e identificar locais da nitração em proteínas eficientemente. Como 3-nitrotirosina é uma modificação de baixa abundância em proteínas em comparação com outras formas de PTM, como fosforilação e acetilação, é desafiador para identificar locais de nitração endógena diretamente de linhas celulares ou amostras de tecido. No entanto, a metodologia de uso de espectrometria de massas (MS) para caracterizar o padrão de fragmentação do nitrotpeptídeo foi desenvolvida (por exemplo, Zhan & Desiderio³), que estabelece a base para novos métodos de nitroproteômica.

Atualmente, uma etapa de enriquecimento seguida por MS é a estratégia mais poderosa para o perfilamento de nitropeptídeos^4,5. Os métodos de enriquecimento podem ser classificados em duas classes. Uma classe é baseada em anticorpos que podem reconhecer a 3-nitrotirosina especificamente, enquanto que a outra classe é baseada na derivação química que reduz um grupo nitro para um grupo de amina^4,5. Para o método baseado em anticorpos, a coluna de afinidade com nitrotirosina é utilizada para o enriquecimento, a partir do qual o material eluído é ainda mais resolvido e analisado por MS^6,7de alta resolução. Para o método baseado na derivação química, os grupos de amina no N-Terminus do peptídeo ou lisina devem ser bloqueados no primeiro passo, quer por acetilação, Tags isobáricas para a quantificação relativa e absoluta (iTRAQ), ou tag de massa em tandem (TMT) reagentes. Em seguida, um redutor é usado para reduzir a nitrotirosina à aminotirosina seguida modificando o grupo recentemente formado da amina, que inclui a ligadura da biotina, a conversão do peptide do sulfidrilo, ou outros tipos de sistemas de etiquetagem^{8,9, 10,11}. A maioria dos protocolos estabelecidos até agora baseiam-se em proteínas em excesso nitradas in vitro , em vez de proteínas endogenamente nitradas.

No presente estudo, um procedimento modificado da derivação química da nitrotirosina é desenvolvido para o enriquecimento e identificação do nitropeptídeo, o que mostra maior sensibilidade durante a detecção de SM e é adequado para fins de quantificação. Nosso estudo recente que emprega este método nos sistemas biológicos identificou que o nitração da proteína tirosina-quinase lymphocyte-específica (lck) em Tyr394 por RNS produziu das pilhas Myeloid-derivadas do supressor (mdscs) joga um papel importante no imunossupressão do microambiente do tumor¹². Conseqüentemente, nosso método da identificação do nitropeptide pode ser aplicado às amostras biológicas complexas também. Aqui, nós descrevemos nosso protocolo usando o peptide modelo angiotensina II, de que o teste padrão da fragmentação é sabido e amplamente utilizado em estudos nitroproteomic^8,9,10,11, como um exemplo.

Protocolo

1. nitorização da angiotensina II

1. Para gerar peptídeo nitrado, diluir 10 μL de solução-mãe de angiotensina II (DRVYIHPF) (2 mM em água) em 390 μL de solução de PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mm nacl, pH 7,4) na concentração final de 50 μm.
2. Adicionar 10 μL de peroxinitrito (200 mM em 4,7% NaOH) à solução de angiotensina II para fazer a concentração final de peroxinitrito 5 mM.
   Nota: o peroxinitrito é instável e fácil de resolver quando está na forma ácida, assim que a solução do pai do peroxinitrito é mantida na solução básica e armazenada em-80 ° c.
3. Ajuste o valor de pH da solução para 7-8 por 1 M HCl. Para iniciar a reação de nitração, agitar o tubo em 400 rpm por 5 min.
4. Use uma coluna SPE de fase reversa disponível comercialmente (consulte a tabela de materiais) para a dessalinagem.
   1. Prepare 2 soluções para a dessalinagem, 5% metanol em água para a lavagem e 80% metanol em água para a eluição.
   2. Adicione 500 μL de metanol, seguido de 500 μL de água para pré-condicionar a coluna, coloque 1 pipetador ml com a ponta na parte superior da coluna, pressione o pipetador para acelerar o fluxo.
   3. Carregue 410 μL da amostra na etapa 1,3 na coluna, descarte o fluxo.
   4. Após a lavagem com 500 μL de metanol a 5%, use 300 μL de 80% de metanol para Eluir o nitropeptídeo, que é então totalmente seco por velocidade-VAC na configuração padrão à temperatura ambiente.
      Nota: a Dessalinagem é muito importante para as reacções, uma vez que o solvente deixado na etapa anterior pode ter um efeito negativo nas próximas etapas.

2. alquilação de aminas primárias por dimetil rotulagem

1. Reconstituir a Nitro-angiotensina II em pó em 100 μL de solução de bicarbonato de trietilamónio de 100 mM (TEAB).
   Nota: o valor de pH da solução deve estar entre 7 e 9, e certifique-se de que nenhuma amina primária é adicionada na solução.
2. Adicione 4 μL de formaldeído a 4% à solução, misture brevemente.
   PRECAUÇÃO: os vapores de formaldeído são tóxicos; realizar os experimentos em uma capa de fumaça.
3. Adicionar 4 μL de 0,6 M NaBH₃CN à solução, agitar o tubo a 400 rpm durante 1 h à temperatura ambiente.
4. Saciar a reacção de rotulagem adicionando 16 μL de solução de amônia a 1%, incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Adicione 8 μL de ácido fórmico para acidificar a solução e realize a dessalinagem utilizando a coluna SPE de fase inversa, conforme descrito na etapa 1,4.

3. redução da nitrotirosina para aminotirosina

1. Reconstituir o dimetil rotulado Nitro-angiotensina II em 500 μL de PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mm nacl, pH 7,4).
2. Adicionar 10 μL de 1 M de dithionate de sódio à solução e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Após a reação de redução, a cor amarela da solução torna-se clara.
   Nota: pesar 174,1 mg de dithionate de sódio e dissolvê-lo em água para fazer o volume final é de 1 mL. Esta solução pode ser armazenada a-20 ° c não mais do que uma semana.
3. Use a coluna SPE de fase inversa para a dessalinagem, conforme descrito na etapa 1,4.

4. biotinilação, enriquecimento, e detecção

1. Reconstituir o dimetil rotulado amino angiotensina II em 500 μL de PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mm nacl, pH 7,4).
2. Adicionar 5 μL de 40 nM NHS-S-S-biotina, dissolvidos em DMSO, à solução, após 2 h de incubação à temperatura ambiente, utilizar 1 μL de hidroxilamina a 5% para saciar a reacção.
3. Entretanto, equilibram grânulos do Agarose do estreptavidina adicionando 500 μL de PBS (10 milímetros NaH₂po₄, 150 milímetro nacl, pH 7,4), centrifugando em 580 x g por 5 minutos na temperatura ambiente e descartando o sobrenadante. Realize a equilibração 3 vezes.
4. Adicionar 100 μL de grânulos de agarose de estreptavidina ao sistema de reacção, incubar 1 h num agitador rotativo à temperatura ambiente. Lave 4 vezes com PBS (10 mM NaH₂po₄, 150 mm nacl, pH 7,4). Para cada etapa de lavagem, adicionar 500 μL de PBS para os grânulos, misture bem, em seguida, centrifugar a 580 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
5. Use 400 μL de ditiotreitol de 10 mm (DTT) para incubar com grânulos de agarose a 50 ° c por 45 min, gire para baixo em 580 x g por 5 min à temperatura ambiente e descarte os grânulos, acrescente 20 μL de 0,5 M de idoacetamida (iam) ao sobrenadante por 20 min na escuridão.
   Nota: o DTT é usado para quebrar a ligação do dissulfeto entre o link da biotina e do peptide, o último é liberado dos grânulos e alquilados mais por iam.
6. Use a coluna SPE de fase inversa para a dessalinagem mostrada na etapa 1,4.
7. Após a resolução dos peptídeos secos em 20 μL de 0,1% de ácido fórmico (FA), sujeitar o produto de cada seção à cromatografia líquida com análise de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS).
   1. Separe os peptídeos modificados de Ang II por uma eluição de gradiente de 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a um caudal de 0,300 μl/min com sistema de nano-HPLC que é diretamente interface com o espectrómetro maciço de alta resolução.
      Nota: a coluna analítica está em 75 μm de identificação, 150 mm de comprimento, embalado com resina C-18. A fase móvel A consistiu em 0,1% de ácido fórmico, e A fase móvel B consistiu em 100% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico.
   2. Opere o espectrómetro de massa no modo de aquisição dependente de dados, defina um único espectro de massa de varredura completa (300-1800 m/z, resolução de 60 000) seguido por 20 verificações MS/MS dependentes de dados a 28% de energia de colisão normalizada.
   3. Abra os dados de espectros de massa e identifique os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química foi realizada com sucesso.

5. quantificação do nitropeptídeo

1. Prepare 3 conjuntos de soluções Nitro-angiotensina II da etapa 1,4, cada conjunto contendo 2 concentrações de nitro-angiotensina II: conjunto #1, 20 nmol no tubo A e 20 nmol no tubo B, cada um em 100 μl de solução de TEAB; Definir #2, 10 nmol no tubo C e 20 nmol no tubo D, cada um em 100 μl de solução de TEAB; Definir #3, 40 nmol no tubo e e 10 nmol no tubo F, cada um em 100 μl de solução de TEAB.
   Nota: as duas concentrações de nitro-angiotensina II em cada conjunto são usadas para a rotulagem de dimetil, para reagir com formaldeído (luz) e formaldeído-D2 (pesado), respectivamente.
2. Para cada conjunto, adicione 4 μL de formaldeído a 4% e formaldeído-D2 à amostra a ser rotulada como leve e pesada, respectivamente. Siga as etapas 2,3 a 2,5 para terminar a rotulagem do dimetil.
3. Misture as amostras leves e pesadas rotuladas.
4. Siga as etapas de 3,1 a 4,6 para a redução, a biotinilação, o enriquecimento, e a deteção.

Resultados

O fluxograma para o perfilamento de nitropeptídeos neste manuscrito é mostrado na Figura 1. A Figura 2, 3, 4 e 5 mostram os espectros de massa da angiotensina II, Nitro-angiotensina II, dimetil rotulado Nitro-angiotensina II e dimetil rotulado amino angiotensina II, respectivamente. O peso molecular do composto pode ser refletido pelos valores de m/z do pico do mono-isótopo em cada figura, indicando que a modifi...

Discussão

O protocolo aqui descreve o enriquecimento e o perfilamento do nitropeptídeo. Utilizando-se a angiotensina II como peptídeo modelo, ilustramos o procedimento mostrado na Figura 1. Após a obtenção da nitro-angiotensina II, a amina primária no peptídeo deve ser bloqueada para evitar a conjugação de amina, que é uma das etapas mais críticas dentro do protocolo. No protocolo atual, a rotulagem de dimetil é usada para bloquear as aminas primárias por dois motivos: primeiro, possibilita a aquisiçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acclaim pepmap 100 coluna C18	Thermo-Fisher	164534
1 M Solução TEAB	Sigma-Aldrich	T7408
50% hidroxilamina	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrila	Thermo-Fisher	A955	MS
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775	Biologia Molecular Grau
formaldeído-D2	Toronto Produtos Químicos de Pesquisa	F691353
ácido fórmico	Sigma-Aldrich	695076	reagente ACS
Fusão Lumos espectrômetro de massa	Thermo
isoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
Metanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB coluna (10 mg)	Águas	186000383
peroxinitrito	Merck-Millipore	516620
cianoborohidrita de sódio	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
ditionato de sódio	Sigma-Aldrich	157953	Grau Técnico
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo