Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.
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Artigo de método
Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Expressão inducible, tecido-específica é uma ferramenta importante e poderosa para estudar a dinâmica espaço-temporal da perturbação genética. Combinando o GreenGate flexível e eficiente sistema com o comprovada e aferido LhGR sistema (aqui denominado GR-LhG4) para a expressão inducible de clonagem, geraram um conjunto de linhas de Arabidopsis transgênicas que pode guiar a expressão de um efetor gaveta em uma variedade de tipos de célula específica nos três os meristemas planta principal. Para este fim, escolhemos o sistema GR-LhG4 previamente desenvolvido, com base em um fator de transcrição quimérico e cognato pOp-tipo promotor garantindo controlo apertado sobre uma ampla gama de níveis de expressão. Além disso, para visualizar o domínio de expressão onde o fator de transcrição sintética está ativo, um repórter fluorescentes mTurquoise2 ER-localizada sob o controle do promotor pOp4 ou pOp6 é codificado em linhas de motorista. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para gerar uma linha de driver ou efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium de Arabidopsis. Usando vários ou todos os driver de linhas, o efeito de contexto específico de expressar um ou múltiplos fatores (efetores) sob controle do promotor sintético pOp pode ser avaliadas rapidamente, por exemplo em plantas de F1 de um cruzamento entre um efetor e múltiplo linhas de motorista. Esta abordagem é exemplificada pela expressão ectópica de VND7, um factor de transcrição do NAC capaz de induzir a deposição de parede ectópica secundária de célula de forma autónoma de célula.
Introdução
Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para....
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Protocolo
Vetores e módulos podem ser obtidos no repositório sem fins lucrativos, Addgene (https://www.addgene.org).
1. clonagem usando GreenGate
- Cartilhas do projeto usando as saliências listadas na tabela 1, substituir 'NNNN' com sequências de tipo-específico do adaptador do módulo listado abaixo: para a frente: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ de sequência específica, reverter: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + reverso complemento de 3´ sequência específica. Adicione as bases sublinhadas para garantir a manutenção do quadro de leitura.
Saliências de módulo:
Nota: no âmbito GreenGate padrão, seis módulos....
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Resultados
Geração de linhas de driver e efetoras através de clonagem GreenGate
O GreenGate clonagem sistema baseia-se na GoldenGate clonagem e uso a endonuclease de restrição do tipo IIS Bsaeu ou sua isoschizomer Eco31I. Como saliências produz a enzima distante do seu local de reconhecimento assimétrica, a composição de base das saliências podem ser livremente escolhido, que é a base forma a modularidade do sistema. Cada elemento gerado pelo PCR, por exemplo, uma sequê.......
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Discussão
Aqui, descrevemos os passos necessários para gerar e aplicar um conjunto de ferramentas abrangente e versátil para inducible, célula tipo específico trans-ativação. Atravessando a fronteira transportando cassettes effector sob controle do promotor pOp com linhas de motorista permite estudar os efeitos de expressão mis na geração F1, permitindo a rápida avaliação de perturbação genética em uma ampla gama de tipos de células. Alternativamente, effector construções podem ser usadas para transformar linhas .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Trabalho em nossos laboratórios é suportado pelo Fundação de pesquisa alemã (DFG) subvenções WO 1660/6-1 (S.W.) e GR 2104/4-1 (T.G.) e SFB1101 (para T.G. e J.U.L) e por um Conselho Europeu de investigação consolidador conceder (PLANTSTEMS 647148) de T.G. S.W. é suportado através de Emmy Noether comunhão da DFG através de Grant WO 1660/2.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ampicilina | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Purificação | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Câmara de cultura para imagem Sarstedt | AG & Co. KG | Câmara de cultura de tecidos de 1 poço, em lamínula II | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, Reino Unido | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| (0,30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda azul 63x objeto de imersão em água | Leica, Wetzlar, Alemanha | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Holanda | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA objetiva de imersão em água | Nikon, Minato, Tóquio, Japão | ||
| Placa de Petri 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Alemanha | 627102 | |
| placa de Petri 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Alemanha | 628102 | |
| placa de Petri 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Alemanha | 688102 | |
| Ágar Plant | Duchefa, Haarlem, Holanda | P1001 | |
| Extração de plasmídeo | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Iodeto de propídio (PI)Lâmina de | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | ||
| Tubos de reação | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Alemanha | ||
| Spectinomicina | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sacarose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazina | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetraciclina | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µ l | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µ l | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
Referências
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.<....
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Reimpressões e permissões
