Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Gemma Pearson; Scott A. Soleimanpour

doi:10.3791/59398

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Artigo de método

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

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DOI:

10.3791/59398

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2 de maio de 2019

Gemma Pearson¹ , Scott A. Soleimanpour¹^,²

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²VA Ann Arbor Healthcare System

Neste artigo

Resumo

Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.

Resumo

Mitophagy é uma via de controle de qualidade mitocondrial essencial, que é crucial para bioenergética de células beta de Islet pancreáticas para abastecer a liberação de insulina estimulada por glicose. A avaliação da mitophagia é desafiadora e muitas vezes requer repórteres genéticos ou múltiplas técnicas complementares não facilmente utilizadas em amostras de tecido, como as ilhotas pancreáticas primárias humanas. Aqui nós demonstramos uma aproximação robusta para visualizar e quantificar a formação de complexos endógenos principais do mitofagia em ilhotas pancreatic humanas preliminares. Utilizando a técnica sensível do ensaio da ligadura da proximidade para detectar a interação dos reguladores NRDP1 e USP8 de mitofagia, nós podemos quantificar especificamente a formação de complexos mitofagia essenciais in situ. Ao acoplar essa abordagem à contracepção para o fator de transcrição PDX1, podemos quantificar complexos de mitophagia, e os fatores que podem prejudicar a mitofagia, especificamente dentro das células beta. A metodologia que descrevemos supera a necessidade de grandes quantidades de extratos celulares necessários para outros estudos de interação proteína-proteína, como a imunoprecipitação (IP) ou espectrometria de massas, e é ideal para amostras de Islet humanas preciosas geralmente não disponíveis em quantidades suficientes para estas abordagens. Além disso, esta metodologia elimina a necessidade de técnicas de triagem de fluxo para purificar as células beta de uma população de Ilhéus heterogêneo para aplicações proteicas a jusante. Assim, nós descrevemos um protocolo valioso para o visualização do mitofagia altamente-compatível para o uso em populações heterogêneas e limitadas da pilha.

Introdução

As células beta pancreáticas produzem a insulina necessária para manter a homeostase normal da glicose, e sua falha resulta no desenvolvimento de todas as formas de diabetes. As células beta mantêm uma capacidade mitocondrial robusta para gerar a energia necessária para o metabolismo da glicose de casal com liberação de insulina. Recentemente, tornou-se evidente que a manutenção da massa mitocondrial funcional é de importância crucial para a função de célula beta ideal¹^,^2,3. A fim de sustentar a massa mitocondrial funcional, as células beta dependem de mecanismos de controle ....