Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Resumo

Este protocolo descreve o uso da cromatografia de permuta iónica alta especificidade com multi-ângulo de dispersão de luz para uma exata determinação da massa molar de proteínas, complexos de proteínas e peptídeos em uma amostra heterogênea. Este método é valioso para a avaliação da qualidade, bem como quanto a caracterização dos oligômeros nativos, variantes de carga e misturado-proteína amostras.

Resumo

Cromatografia de troca iônica com multi-ângulo de dispersão de luz (IEX-MALS) é um método poderoso para separação de proteínas e caracterização. A combinação da técnica da separação de alta especificidade IEX com a análise precisa de massa molar alcançada por MALS permite a caracterização de amostras de proteínas heterogêneas, incluindo misturas de formas oligoméricas ou populações de proteína, mesmo com muito massas molares semelhantes. Portanto, IEX-MALS fornece um nível adicional de caracterização de proteínas e é complementar a cromatografia de exclusão de tamanho padrão com técnica multi-ângulo de espalhamento de luz (SEC-MALS).

Aqui descrevemos um protocolo para uma base IEX-MALS experimentar e demonstrar este método na albumina de soro bovino (BSA). IEX separa BSA para suas formas oligoméricas, permitindo uma análise de massa molar por MALS de cada forma individual. Otimização de um experimento de IEX-MALS é também apresentada e demonstrada em BSA, alcançar excelente separação entre BSA monômeros e oligômeros maiores. IEX-MALS é uma valiosa técnica para avaliação da qualidade de proteína, desde que ele oferece uma boa separação e determinação da massa molar de várias espécies de proteína que existe em uma amostra.

Introdução

Caracterização quantitativa de produtos proteicos é cada vez mais essencial como meio de controle de qualidade (QC), tanto para fins de regulamentação na indústria biofarmacêutica e para garantir a confiabilidade e integridade das Ciências da vida de pesquisa^{1 , 2}. como descrito nos sites da proteína redes produção de proteínas e a purificação parceria na Europa (P4EU) e a associação de recursos para investigação biofísica na Europa e biofísica Molecular na Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs e https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respectivamente), proteína QC deve caracterizar não só a pureza do produto final, mas também seu estado oligoméricos, homogeneidade, identidade, conformação, estrutura, modificações do posttranslational e outras propriedades de^3,4.

Dentre os métodos mais comuns de caracterização de QC é SEC-MALS. Neste método, uma coluna analítica da SEC é acoplada ao MALS e detectores espectrofotométricos e refractometric, permitindo medições precisas da massa molar de cada pico de⁵. SEC-MALS determina a massa molar dos picos eluted independentemente do volume de eluição e supera a imprecisão da SEC analítica através da calibração de coluna. A adição de um módulo dinâmico de (DLS) luz-espalhamento adiciona capacidade de medição de tamanho permitindo a determinação do raio hidrodinâmico. Na pesquisa acadêmica, SEC-MALS normalmente é usado para determinar o estado oligoméricos de uma proteína, sua conformação, o nível de pureza, nível de agregação e proteínas modificadas, tais como glicoproteínas ou proteínas da membrana lipídica-solubilizado (determinar o massa molar de proteína e conjugar os componentes individualmente)^6,7,8.

Em muitos casos, a proteína final de um processo de purificação não é uma espécie molecular bem-defined, mas prefiro compreende uma heterogeneidade. As proteínas em tal mistura podem ser variadas em termos de estrutura (por exemplo, diferentes formas oligoméricas), conformações ou isoformas de proteínas. Heterogeneidade de proteína também pode ser um resultado de pequenas diferenças químicas causadas pelo processamento de lisina C-terminal ou desaminação asparagina/glutamina, levando a cobrar variação^9,10. Diferenças em modificações posttranslational como glicosilação também podem levar a amostras heterogêneas com variações de carga⁹. Estes diferentes tipos de heterogeneidade reflectem-se nas características biofísicas da proteína e podem afetar a estabilidade e a atividade biológica da proteína alvo¹¹.

Ensaios de controle de qualidade confiável de tais amostras heterogêneos exigem uma técnica de separação analítica altamente resolutivas. Há casos onde a boa separação pode ser desafiada para alcançar com colunas analíticas de SEC, devido a sua limitada resolução e separação habilidades¹², resultando em falha análise SEC-MALS. Combinar uma técnica de separação de alta especificidade como IEX com MALS pode superar a limitação de SEC-MALS em amostras heterogêneas e fornecem um método complementar para a caracterização da proteína (tabela 1 Amartely et al.¹²). Ao contrário da SEC, que separa macromoléculas por sua hidrodinâmica tamanho¹³, IEX separa macromoléculas por sua carga superficial¹⁴. Troca de ânion (AIEX) e bind de matrizes de permuta catiónica (CIEX) negativamente e positivamente carregadas variantes, respectivamente. Com uma separação bem entre as populações de proteínas que compartilham uma massa relativamente estreita ou uma forma, IEX-MALS com sucesso determina a massa molar de cada estado individual de proteína em uma amostra de mistura¹².

Aqui nós apresentamos um protocolo padrão para a execução de um experimento de IEX-MALS de separação e de análise de formas de BSA oligoméricas que existem na mesma amostra. A escolha de uma coluna de IEX para uma proteína específica é importante e discutidas, bem como as condições de pH e da condutividade dos buffers. A análise dos dados experimentais IEX-MALS também é descrita passo a passo. Embora a separação de oligômeros de BSA é bom e suficiente no SEC-MALS, BSA é um bom exemplo para mostrar os recursos do IEX-MALS e demonstrar a otimização de um experimento. Exemplos de separação pobre alcançado pela SEC-MALS e separação adequada e análise habilitado pelo IEX-MALS são discutidos em um anterior estudo¹².

Protocolo

1. preparação do sistema

1. Instalar o sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida e MALS/refrativa detectores de índice (RI) (ver Tabela de materiais), juntamente com seus respectivos softwares para controle, aquisição de dados e análise por dos fabricantes instruções.
2. Conecte os detectores MALS e RI a jusante de detectores de UV e condutividade do FPLC. Ignore o detector de pH a menos que seja absolutamente necessário para gradientes de pH, para minimizar o volume de interdetector entre os detectores de UV e MALS. Use o tubo capilar de 0,25 – 0,5 mm diâmetro (identidade) entre a coluna e detectores e tubo capilar de 0,75 mm identificação na saída do detector do RI para o coletor de lixo ou fração.
3. Certifique-se de que as conexões de sinal necessário entre os detectores e FPLC foram estabelecidas, incluindo uma saída analógica de UV do detector FPLC MALS Aux entrada e saída digital do FPLC para o MALS Autoinject In, através da caixa de e/s.

2. preparação da amostra e tampão

1. Filtre todos os reagentes, incluindo as lavagem e eluição buffers, com um filtro de 0,1 µm. Os primeiros 50 – 100 mL de tampão de filtro em um frasco de resíduos a fim de eliminar as partículas dos filtros a seco e manter o restante do buffer em um frasco limpo e estéril que tem sido lavado com água filtrada e tampado para impedir a entrada de poeira.
2. Ajustar uma amostra de BSA para um pH e força iônica (por exemplo, pH = 8, 50mm NaCl) que permitem a ligação à coluna IEX durante a diluição, ultrafiltração ou procedimentos de troca de amortecedor.
   Nota: É aconselhável pré-filtragem a amostra de proteína com o menor tamanho de poros que não remove o material de interesse (0,02-0,1 µm). Alternativamente, a amostra pode ser centrifugada em alta velocidade (13.000-16.000 x g) durante 10 minutos permitir que a precipitação de partículas grandes.
3. Prepare-se pelo menos 0,3-0,5 mg de BSA (consulte a Tabela de materiais) para injetar em uma coluna de 1 mL (5/50 mm) para a realização de uma análise MALS de boa qualidade. Observe que o volume da injeção é ilimitado.

3. escolha e desenvolvimento de um método IEX para uma proteína

1. Calcule o ponto isoelétrico (pI) da proteína baseada a sequência primária, para que os servidores como ferramenta de Protparam sobre o ExPASy Web site pode ser usado de¹⁵. Observe que o pI de BSA é 5,8.
2. Selecione os parâmetros de tipo e buffer de coluna.
   1. Use buffers diferentes para AIEX e CIEX, dependendo o pK da reserva e a natureza iônica do buffer. Use buffers catiônicas quando executando a coluna AIEX e buffers aniônicos quando executando a coluna CIEX com counterions pequenos. Neste exemplo, use o tampão de 20 mM Tris-HCl, pH 8, para a análise da BSA em uma coluna AIEX.
   2. Para uma proteína com uma pI inferior a 7, tais como a BSA, use uma coluna AIEX e tampão com um pH mais elevado do que o pI pelo menos duas unidades. Para uma proteína com uma pI superior a 7, use uma coluna CIEX e tampão com um pH mais baixo do que o pI da proteína pelo menos duas unidades.
   3. Otimize o tampão pH de acordo com a força de ligação entre a proteína e a matriz de coluna. Se uma proteína não ligar bem à coluna, use um pH mais longe o pI. Certifique-se que a proteína é estável em pH usado.
   4. Use uma baixa concentração de sal na ligação e lavar os buffers para permitir a ligação da proteína para a matriz, desde que o emperramento da proteína depende da força iônica da amostra carregada. Proteínas geralmente exigem um pouco de sal para a sua estabilidade; Portanto, use a 50mm NaCl (ou sal alternativo) durante as etapas de carregamento de proteína e coluna de lavagem.
   5. Para tampão de eluição, use um máximo de 0,5 M de NaCl para separar a proteína da coluna.
      Nota: Altas concentrações de sal não são recomendadas quando se trabalha com o refratômetro de RI padrão-modelo devido à limitação de alcance do instrumento. No entanto, um modelo de alta concentração pode ser usado e pode acomodar 2 M NaCl.
3. Execute um método inicial como segue.
   1. Carregar de 1 mg de BSA (170 µ l de 6 mg/mL) em ~0.5 mL de um tampão de carregamento do buffer de 20 mM Tris-HCl, pH 8, contendo 50 mM de NaCl. Lavar a coluna com a mesma reserva para um volume de coluna de 10-15 (CV) permitir que a eluição completa de desacoplado moléculas e partículas do sistema até o espalhamento de luz (LS), UV, e sinais de RI são totalmente estabilizados.
   2. Execute um gradiente linear, curto de sal de 20 – 30 CV, usando o tampão de eluição de 20 mM Tris-HCl, pH 8, contendo 0,5 M NaCl para separar a proteína da coluna. Executar um gradiente de 0 – 100% (ou gradiente generalizada alternativa) do tampão de eluição ou dividi-lo para dois gradientes: 0 – 50% de tampão de eluição, seguido por um gradiente de adicional de 50%-100% de tampão de eluição, cada gradiente para 10-20 CV. Para BSA, use um gradiente generalizado de 15%-70% para 30 CV para o método inicial.
      Nota: Em alguns casos, o método inicial pode fornecer separação para uma análise confiável de MALS, e pistas adicionais não são necessárias. Em muitos casos, o método inicial fornece apenas orientação para otimização de método ainda mais.
4. Otimize o método IEX para aumentar a resolução e melhorar a separação de pico, alterando parâmetros diferentes.
   1. Altere o gradiente inclinação e comprimento. Gradientes curtos com altas encostas fornecem picos intensos com menos separação, enquanto gradientes longos com encostas suaves fornecem picos mais baixos com melhor separação. Encontre o equilíbrio entre o pico de intensidade resolução e sinal para análise MALS ideal.
      Nota: Carregar uma quantidade maior de proteína pode aumentar LS, UV, e sinais de RI mas fá-lo em detrimento da resolução.
   2. Use um perfil de concentração de sal em etapas para a eluição. Lembre-se que uma combinação de passos e gradiente linear é comumente usada.
   3. Diminua a taxa de fluxo para melhorar a separação de pico.
      Nota: Para matrizes com partículas muito pequenas, isto não é muito significativo.
   4. Altere o pH do tampão para aumentar a variação de carga entre as populações de proteína na amostra e melhorar a separação entre essas variantes. Note-se que as proteínas que não são devidamente separadas em um pH podem ser separadas em diferente pH.
   5. Use um pH gradient, linear ou gradual, para separar as proteínas da coluna IEX. Use gradientes de eluição que combinam ambos pH e variações de concentração de sal se necessário.
   6. Use sais mais fortes, como MgCl₂, ou mais fraco de sais, tais como acetato de sódio, para aumentar a sensibilidade e resolução¹⁶.
   7. Use mais colunas IEX ou uma matriz de coluna diferente com partículas menores para melhorar as habilidades de separação.
   8. Altere o tipo de coluna (AIEX/CIEX) para fornecer um padrão diferente de separação. Note-se que matrizes com ligantes de fortes, fracos ou combinadas (mista) também estão disponíveis e podem melhorar a resolução de algumas amostras.
   9. Use uma coluna de um fornecedor diferente com o ligante mesmo anexado a resinas de matriz diferente. A resina em si, independentemente do ligante, pode interagir de forma diferente com as proteínas e afetar o perfil de separação.
   10. Inclua aditivos (moléculas que estabilizam as proteínas na solução) em buffers para melhorar a estabilidade da proteína e evitar a agregação da proteína, para melhorar a experiência do IEX.
       Nota: Exemplos de tais aditivos são açúcares, álcoois, ureia, detergentes não iônicos ou zwitteriônico e caotrópicas e kosmotropic sais^17,18.

4. experimento IEX-MALS

1. Abrir o New\Experiment de método no software MALS e selecione o método on-line da pasta de métodos do sistema de Espalhamento de luz . Se o módulo DLS está disponível e DLS dados devem ser adquiridos, selecione o método on-line da subpasta Luz Scattering\With QELS .
2. Defina os parâmetros da execução sob a seção de configuração .
   1. Definir a taxa de fluxo da execução na seção Genérico da bomba para a taxa de fluxo usada no FPLC (1,5 mL/min) e digite ou verifique se os parâmetros de reserva sob a seção de solvente .
   2. Digite o nome de proteína (BSA), incremento do índice de refração (dn/dc; o padrão é de valor para as proteínas 0,185 mL/g), coeficiente de extinção UV no comprimento de onda de 280 nm (0,66 g/L^-1·cm^-1) e a concentração da amostra em proteína (6 mg/mL) o guia de amostra sob a seção do Injector . Inserir o volume de amostra para injeção (170 µ l), bem como sob a mesma seção.
   3. Na aba Coleção básica , sob a seção de procedimento , selecione a opção de gatilho na Autoinject e definir a duração do percurso para que a coleta de dados será continuada pelo menos 5 min depois o gradiente tem alcançado seus valor final.
3. Defina os parâmetros do experimento no software FPLC.
   1. Crie uma nova experiência na guia Editor de método . A experiência inicial será um gradiente linear de sal ou pH (ver passo 3.3). Para o método otimizado, criar um gradiente mais específico ou um programa gradual de acordo com os resultados de eluição durante o método inicial (ver passo 3.4 e Figura 1). Inclua um sinal de pulso no método que acionará a coleta de dados no software MALS.
   2. Lavar a coluna e válvulas com os buffers relevantes: 20 mM Tris-HCl, pH 8, com 50 mM de NaCl para o tampão de lavagem (uma válvula) e a mesma reserva com 500 mM de NaCl para o tampão de eluição (válvula B). Certifique-se que a lavagem da coluna final usa o buffer de vinculação, que contém uma baixa concentração de sal, para permitir a ligação da proteína para a matriz de coluna. Uma maciça lavagem de impurezas fortemente acopladas, use 0,5 M de NaOH antes de lavar com os buffers relevantes, seguidos por uma lavagem de tampão de neutralização.
   3. Coloca a amostra de proteína no loop usando uma seringa. Se mais de 10 mL da amostra é carregado, use uma superloop ou a válvula da bomba do instrumento FPLC enquanto ignorando o filtro da bomba e o misturador do FPLC.
4. Comece o experimento no software MALS clicando no botão executar e depois no software FPLC. Dados serão coletados após ter recebido o sinal de pulso do instrumento FPLC através do detector MALS.
5. Aplica os mesmos parâmetros da gerência e as instruções descritas em etapas 4.1 – 4.4 se o IEX-MALS é realizada manualmente com um modo de fluxo contínuo em vez de um método autônomo.
6. Uma vez que o método final foi verificado e executar, execute exatamente o mesmo método usando uma injeção em branco (tampão de carregamento em vez de amostra). É importante que o sincronismo entre o pulso de autoinject e o gradiente de fuga em branco é idêntico da amostra executar.

5. análise dos dados experimentais IEX-MALS

1. Realizar a análise passo a passo na seção de procedimento no software MALS. A Coleção básica Exibir exibe a coleção de dados brutos da experiência.
   1. Use a guia Despiking para suavizar os cromatogramas se eles apresentam um monte de barulho. Normalmente, uso o nível normal .
   2. Definir a linha de base para todos os sinais (todos LS, UV e RI detectores) na exibição de linha de base .
   3. Defina os picos para análise na exibição de picos . Verifique se os valores corretos do dn/dc e o coeficiente de extinção de UV para a proteína sob cada pico.
      Nota: Para proteínas, é comum usar um valor padrão de incremento de RI 0,185 mL/g, mas para outras macromoléculas, dn/dc diferentes valores devem ser usados, de acordo com a natureza da molécula. O dn/dc médio de polinucleótidos (DNA/RNA) é 0,17 mL/g¹⁹, enquanto sacáridos, tais como a sacarose, tem um valor de dn/dc média de 0,145 mL/g²⁰ e os valores do dn/dc de lipídios e detergentes variam entre 0,1 – 0,16 mL/g²¹.
   4. Analise a massa molar e o raio usando os parâmetros de ajuste e a função de correlação sob as vistas de massa Molar & raio de LS e R_h de QELS .
2. As alterações de sinal RI significativamente durante o IEX-MALS executar devido ao aumento da concentração de sal. Portanto, subtrai o sinal de linha de base da injecção de em branco para cálculos em massa que requerem dados do RI.
   1. Abra a proteína e o experimentos de IEX-MALS em branco. Botão direito do mouse no nome do experimento de proteína, selecione o Método de aplicare escolha a pasta de Subtração de base na caixa de diálogo arquivo. Selecione o tipo correto de método (por exemplo, on-line) para análise em massa molar padrão. Observe que os parâmetros e configurações definidas para o experimento de proteína serão salvo no novo método aberto.
   2. Em vista da Subtração de linha de base , clique em Importar em branco para importar os sinais de fuga em branco. Em instrumentos (ao lado do botão de Importação em branco ), verifique todos os detectores de subtrair.
   3. Na exibição de picos , ajuste os valores de dn/dc (se necessário) devido a condutividade da solução para a área do pico de proteína, desde que o RI da solução é alterado durante a execução de¹².
3. Calibre o sistema IEX-MALS com monômero de BSA.
   Nota: Normalmente, o sistema IEX-MALS periodicamente calibrado para alinhamento de pico, banda ampliando e normalização dos detectores para o detector de 90°, usando uma proteína monodisperso com um raio de rotação (R_g) de angular < 10 nm, como monômero de BSA. Neste exemplo, BSA serve tanto como a molécula de calibração e em si é objecto de análise em massa molar.
   1. Alinhar os picos, no âmbito dos procedimentos > configuração de exibição.
   2. Executar normalização sob a vista de normalização , entrando 3.0 nm como o valor de_g R.
   3. Sob Banda ampliando no guia de configuração do mesma, escolher o pico e combinar os sinais UV e LS para o sinal de RI, utilizando o botão Executar caber .
4. O gráfico dos resultados é mostrado na exibição de Resultados de encaixe . Altere as escalas do eixo e outros parâmetros do gráfico clicando sobre o gráfico, selecionando Editar, e em seguida, clicando no botão avançado . Uma figura do gráfico com mais opções de exibição também está disponível na guia Gráfico de EASI : selecione a Massa Molar do menu suspenso na parte superior da janela, Exibir .
5. Observe que todos os resultados, incluindo a massa molar, raio, nível de pureza e outros, estão disponíveis na exibição de relatório (resumo ou detalhada) sob a seção de resultados . Use o botão do Designer de relatórios para adicionar mais resultados ou parâmetros, bem como figuras, para o relatório.

Resultados

BSA é uma proteína comum que é usada em cromatografia para calibração do sistema experimental²² e é altamente adequado para a prática do IEX-MALS, bem como a SEC-MALS. É principalmente monomérica com uma massa de monômero teórica de 66,7 kDa e geralmente incorpora um pequeno número de dímeros e maior oligómeros²³.

BSA foi analisada na IEX-MALS usando uma coluna analítica de troca de ânion (ver Tabela de materiais). Uma ampla linear gradiente consistindo de 30 CV de 75 mM a 350 mM NaCl separou monômeros BSA os oligómeros superiores. Análise MALS a jusante resultou em uma massa molar de monômero calculado de 66.8 kDa ± 0,7 e em uma massa molar calculado dímero de 130 ± 5 kDa (Figura 1A).

Baseia a condutividade de reserva para os picos eluted, gradiente foi mudado para um programa diferente: um passo longo de 175 mM NaCl seguido por um gradiente linear de 175 mM a 500 mM de NaCl. O gradiente novo melhorou muito a resolução e excelente separação entre monômero de BSA (com uma massa molar calculado de 66,1 ± 0,7 kDa) e sua maior espécie oligoméricas (com uma massa média calculada de 132 ± 2 kDa) (Figura 1B). Para focar também a espécie oligoméricas alta e para calcular a massa molar de cada forma individual oligoméricas de BSA, aplicou-se um programa gradual de 200 mM e 250 mM de NaCl. Esta experiência resultou em uma excelente separação entre BSA monômero (com uma massa calculada de 62,4 ± 0.4 kDa), dímero (com uma massa calculada de 130 ± 10 kDa) e trímero (com uma massa calculada de 170 ± 10 kDa) (Figura 1C). Todos os experimentos de IEX-MALS mostram que BSA elutes principalmente como um monômero com um grau de pureza de 80%, de acordo com resultados de SEC-MALS onde monômeros BSA eluir com uma pureza de 85%¹².

Figura 1 : Otimização do experimento IEX-MALS para BSA. (A) IEX-MALS experimentar de BSA com um programa de gradiente de 75 – 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS experimentar de BSA com um programa de uma etapa de 175 mM NaCl seguido de um programa de gradiente linear de 175 – 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS experimentar de BSA com um programa passo de 200 mM e 250 mM de NaCl. Os cromatogramas exibem o UV em 280 luz de nm (azul), dispersando-se em um ângulo de 90° (vermelho) e o índice de refração (rosa) e as curvas de condutividade (cinza) em conjunto com a massa molar de cada pico calculado por MALS (preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

IEX-MALS é um método poderoso para separação de proteínas e caracterização que permite a determinação da massa molar exata de proteínas puras também a partir de amostras heterogêneas, caracterizando nativos oligómeros, emularem agregados, não covalente e covalentes complexos e proteínas conjugadas. Um programa consiste em um gradiente linear ou uma série de etapas de concentração de sal pode alcançar uma boa separação das populações proteína e permitir uma análise adequada de cada pico individual pelos MALS. Mais otimização através da variação de parâmetros diferentes, tais como gradiente de inclinação (consulte a etapa 3.4 do protocolo), pode ser realizada se uma melhor resolução é necessária. IEX-MALS pode ser um ensaio de controle de qualidade de proteínas valiosas, uma vez que fornece um nível adicional, crítico de caracterização de proteínas, complementar a outros métodos tais como SEC-MALS.

Enquanto SEC-MALS é uma técnica comum e padrão para determinação da massa molar da proteína, a relativamente baixa resolução das colunas SEC padrão analíticas pode limitar a medidas de massa molares exatas alcançadas por MALS¹². Alguns exemplos das limitações da SEC-MALS incluem soluções que contêm consecutivos oligómeros, altos níveis de agregação que não são totalmente separados do pico de monômero e populações heterogêneas com massas molares semelhantes, tais como proteínas modificadas.

IEX é um método mais complexo de cromatografia para projetar e realizar do que a SEC, mas as informações obtidas em um experimento de IEX-MALS podem complementar e às vezes ser ainda mais informativa do que análise de SEC-MALS. IEX-MALS com êxito tem caracterizado as variantes de anticorpo que compartilham os mesmos oligómeros molares de massas, que não são completamente separados na SEC e peptides curtos que são difíceis de analisar pela SEC^12,24. Além disso, macromoleculares assemblies que são grandes demais para ser separados pela SEC, como completo (contendo DNA viral) e vazias partículas de vírus adeno-associado (AAV), podem ser resolvidos pela IEX²⁵ antes da análise por MALS. Em comparação com a SEC, IEX oferece mais diversificada de recursos de separação¹⁴ e tem a flexibilidade de ajustar vários parâmetros para aumentar a resolução de pico, como tampão de pH, tipos de sal, tipos e comprimento da coluna e outros. Ao contrário do SEC, não há nenhuma limitação de volume para a injeção de amostra em IEX, e qualquer molécula pode ser analisada, independente do seu tamanho (ver tabela 1 Amartely et al.¹²). Esta é uma grande vantagem do IEX-MALS, principalmente para amostras com uma baixa intensidade de LS, como muito pequenas proteínas ou proteínas diluídas com tendência para a agregação após concentração. Desde colunas analíticas do IEX são mais estáveis e tendem a liberar menos partículas do que colunas SEC, IEX-MALS requer tempo da equilibração muito curto, e sinais LS são estabilizados muito rápido. Isso permite a execução de experiências individuais, como descrito no presente protocolo e à suspensão da execução conforme necessário.

Ao contrário da SEC, que geralmente fornece resultados bem com apenas um experimento (usando uma coluna com o intervalo certo fracionamento), IEX pode exigir vários experimentos para conseguir a resolução ideal ajustando os parâmetros do método. Em experimentos IEX-MALS que são executadas com um gradiente de sal, a condutividade de reserva e, portanto, o RI mudar drasticamente durante a execução, com consequentes alterações para o sinal de RI. Isso requer um espaço em branco adicional executado para cada experimento IEX-MALS e uma análise com subtração de base (conforme descrito na etapa 5.2 do protocolo) a menos que a análise de concentração é limitada à detecção de UV (que exigem conhecimento a priori da extinção coeficientes para cada pico). A análise com subtração de linha de base é robusta para gradientes lineares, apesar de ainda mais o desenvolvimento do método ainda é necessário para a subtração de base bem sucedida de programas gradual sal. Os valores do dn/dc de cada pico devem ser ajustados de acordo com a condutividade de buffer específicos no pico eluted (cálculos podem ser encontrados na literatura¹²). Se uma proteína eluída em uma concentração de NaCl inferior a 200 mM (como no exemplo a BSA), este ajuste é insignificante.

A quantidade relativamente grande de proteína usado em IEX-MALS (como detalhado no passo 2.3 do protocolo) em relação ao SEC-MALS é importante para superar a dramática mudança do sinal RI causada por sal gradiente e as flutuações de RI devido a mistura imperfeita do buffers de gradientes. Se apenas detecção de UV é usada para medição de massa, quantidades menores podem ser utilizadas. A quantidade de proteína para injetar depende a massa molar da proteína, homogeneidade, pureza e o coeficiente de extinção de UV. A necessária massa injetada deve ser maior para proteínas menores e mais baixas para maiores proteínas (~ 1 mg por mg de proteína e ~0.2 um 20 kDa para uma proteína de 150 kDa). Amostras heterogêneas requerem a injeção de amostra mais desde que a quantidade é dividida entre várias populações. Analítica alta cromatografia líquida (HPLC) pode exigir menos material do que um sistema FPLC.

Recentemente, tem sido relatada em linha análise usando MALS durante os processos de purificação. Uma análise em tempo real é muito eficiente para a detecção de produtos de agregação que ocorrem durante a purificação e podem eliminar a necessidade de qualquer análise mais aprofundada da proteína depois da purificação,²⁶. Cromatografia IEX é frequentemente usada como um passo intermediário de purificação; assim, a combinação de colunas IEX preparativa com MALS pode ser útil não só como um método de caracterização analítica, mas também como uma análise em tempo real de processos de purificação em larga escala. Analíticos IEX colunas também são estáveis, com um baixo grau de liberação de partículas e, portanto, podem ser usadas com MALS. Outras técnicas de separação, tais como a cromatografia de afinidade ou cromatografia de troca hidrofóbicos, também podem ser combinadas com MALS quando submetido a amostras relativamente puras (para evitar a contaminação dos detectores de MALS e RI). Isso exigirá a adaptação e otimização de método para obter não só separação pico bom mas é também suficientemente limpa e RI sinaliza para uma análise bem sucedida de MALS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ä KTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	FPLC
0,02 µ m Filtro Whatman Anotop 10 mm	Filtro de Amostra	GE Healthcare	6809-1002
0.1 µ m Filtro Whatman Anotop 10 mm	Filtro de Amostra	GE Healthcare	6809-1012
0.1 µ m Filtro Whatman Anotop 25 mm	GE Healthcare	6809-2012	Filtro de fase móvel
BSA (pureza >97%)	Sigma	A1900	Albumina de soro bovino
miniDAWN TREOS	Wyatt Technology	WTREOS	MALS
mono Q HR 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01	Coluna analítica de troca aniônica
Optilab T-rEX	Refratômetro	WTREX	da Wyatt Technology
0.1 mm PES 1000 mL Stericup	Millipore	SCVPU11RE	Filtro de fase móvel
Cloreto de sódio	Sigma	71382	Grau HPLC NaCl
Base TRISMA	Sigma	Tampão T-1503	TRIS