Um modelo in vitro para estudar a agregação Tau usando transdução mediada por Lentivirus de neurônios humanos

Resumo

Este protocolo detalha um procedimento em que as culturas neuronal humanas são transadas com construções lentivirais que codificam para o Tau humano do mutante. As culturas transadas exibem agregados Tau e patologias associadas.

Resumo

A agregação aberrante da proteína Tau é patogenicamente envolvida em um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Embora os modelos de rato de Taupatia forneceram um recurso valioso para investigar os mecanismos neurotóxicos da Tau agregada, está tornando-se cada vez mais aparente que, devido às diferenças do entre espécies na neurofisiologia, o cérebro do rato é inadequado para modelar a condição humana. Os avanços nos métodos de cultura celular tornaram as culturas neuronais humanas acessíveis para uso experimental in vitro e ajudaram no desenvolvimento de neuroterapêutica. No entanto, apesar da adaptação de culturas de células neuronais humanas, in vitro modelos de tauopatia humana ainda não estão amplamente disponíveis. Este protocolo descreve um modelo celular da agregação da Tau em que os neurônios humanos são transfundidos com os vetores lentiviral-derivados esse código para Tau patogenicamente mutado fundido a um repórter amarelo da proteína fluorescente (YFP). Culturas transdoadas produzem agregados Tau que mancham positivamente para a tioflavina e exibem marcadores de neurotoxicidade, tais como diminuição do comprimento axonal e aumento do volume lisossomal. Este procedimento pode ser um modelo útil e rentável para estudar tauopathies humanas.

Introdução

A agregação patológica da proteína Tau microtubule-associada é uma característica definidora de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a AD, a demência frontotemporal (FTD), a doença de pick, e a paralisia supranuclear progressiva (PSP)¹. Em um estado não-doente, a Tau liga-se e estabiliza os filamentos de microtúse em axônios neuronais². No entanto, a hiperfosforilação associada à doença da Tau promove a agregação de Tau, a dissociação dos microtúbulos e a toxicidade neuronal³. Os efeitos tóxicos da Tau agregada podem envolver a ativação aberrante de⁴ e receptores gl....

Protocolo

1. preparação de meios de comunicação e reagentes

1. Descongelar o revestimento da matriz da membrana do porão para placas da cultura em 4 ° c (não permita que a matriz da membrana do porão aqueça acima ou solidify). Fazer alíquotas de 1 mL e armazená-las a-20 ° c ou-70 ° c.
2. Reconstituir o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS) a 10 μg/mL e fazer 10 μL de alíquotas. Guarde-os a 4 ° c.
3. Para um novo, não aberto, 500 mL de frasco de DMEM/F12 com glutamina, adicione B27 (10 mL), N2 (5 mL), e penicilina-estreptomicina (5 mL). Coloque 50 mL deste meio de células-tronco neurais (NSC) em u....

Resultados

Os neurônios de Tau-RDLM-YFP-transdução foram marcados fluorescentamente com o YFP, e as culturas RDLM-dueadas apresentaram agregados após a transdução. Essas inclusões coradas positivas para a tioflavina (Figura 1). Como a Figura 1 demonstra, este protocolo produz culturas neuronais que exibem agregados de Tau tioflavina-positivos. Para experimentos iniciais, recomenda-se que a diferenciação neuronal seja confirmada Immunolabeling o marcador Neuron-específico β.......

Discussão

Este protocolo descreve a geração de um modelo in vitro de Taupatia humano que exiba agregados prata-mancha-positivos e emaranhados neurofibrilary thioflavin-positivos (NFTS). Além disso, as pilhas transfuídas exibem patologias Tau-induzidas tais como defeitos morfológicos, synaptogenesis reduzido, e um volume lysosomal aumentado. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece um modelo acessível e rentável de tauopatia neuronal, que pode ser usado para estudos de triagem de drogas, bem como para a análise da tox.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de 10 cm	Thermofisher	12556002
tubos de 15 mL Biopioneer		CNT-15
16% de paraformaldeído	Thermofisher	50-980-487
Placas de cultura de 24 poços	Thermofisher	930186
tubos de 50 mL Biopioneer		CNT-50
70% de etanol em frasco	de sprayVárias fontes	NA
Suplemento B27	Thermofisher	17504044
Matriz de membrana basal (Matrigel)	Corning	356231
FGF Basic Biopioneer		HRP-0011
Albumina de soro bovino	Sigma	A7906
Incubadora de cultura de células	Várias fontes	NA
Centrífuga	Várias fontes	NA
Meios de cultura DMEM-F12 com glutamina	Thermofisher	10565042
Etanol (concentração de 50% ou superior)	Várias fontes	NA
Anticorpos secundários marcados com fluorescência	Várias fontes, dependentes de experimentos	NA
Microscópio fluorescente	Várias fontes	NA
Lamínulas de vidro	Thermofisher	1254581
Lâminas de vidro	Thermofisher	12-550-15
Células-tronco neurais humanas	Várias fontes	NA
Vetores lentivirais	Várias fontes	ordem
Mídia de montagem	Thermofisher	P36934
Suplemento	N2Thermofisher	17502048
Penicilina-estreptomicina	Thermofisher	15140122
Solução salina tamponada com fosfato	Thermofisher	14190250
Anticorpos primários	Várias fontes, dependente do experimento	NA
Plataforma oscilante ou rotativa	Várias fontes	NA
Capuz	de cultura de células estéreisVárias fontes	NA
Tioflavina S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Banho-maria	fontes	NA

personalizada Várias