Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

Resumo

Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

Resumo

No processo de desenvolvimento, os embriões exibem uma habilidade notável de combinar seu teste padrão do corpo a seu tamanho de corpo; sua proporção corporal é mantida mesmo em embriões que são maiores ou menores, dentro de certos limites. Embora este fenômeno de escamação tenha atraído a atenção por mais de um século, a compreensão dos mecanismos subjacentes tem sido limitada, devido em parte à falta de descrição quantitativa da dinâmica do desenvolvimento em embriões de tamanhos variados. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma técnica nova para reduzir cirùrgica o tamanho de embriões do zebrafish, que têm grandes vantagens para a imagem latente vivo in vivo. Nós demonstramos que após a remoção equilibrada das pilhas e da gema no estágio da blástula em etapas separadas, os embriões podem rapidamente recuperar-se as circunstâncias direitas e tornar-se em embriões menores mas de outra maneira normais. Desde que esta técnica não exige o equipamento especial, é facilmente adaptável, e pode ser usada para estudar uma escala larga de problemas de escamação, incluindo o robustez do patterning mediado morfogênico.

Introdução

Os cientistas têm sabido por muito tempo que os embriões têm uma habilidade notável de dar forma a proporções constantes do corpo embora o tamanho do embrião possa variar extremamente circunstâncias naturais e experimentais^1,2,3. Apesar de décadas de estudos teóricos e experimentais, essa robustez à variação de tamanho, denominada escamação, e seus mecanismos subjacentes permanecem desconhecidos em muitos tecidos e órgãos. Para captar diretamente a dinâmica do sistema em desenvolvimento, estabeleceu-se uma técnica de redução de tamanho simples e reprodutível em zebrafish⁴, que tem a grande vantagem em imagens ao vivo in vivo⁵.

Zebrafish serviu como um animal modelo vertebrado para estudar várias disciplinas da biologia, incluindo a biologia do desenvolvimento. Em particular, o zebrafish é ideal para a imagem latente vivo⁶ de in vivo porque 1) o desenvolvimento pode prosseguir normalmente fora da mãe e do escudo de ovo, e 2) os embriões são transparentes. Além disso, os embriões podem resistir a alguma temperatura e flutuações ambientais, o que permite que eles sejam estudados em condições laboratoriais. Além da perturbação da expressão gênica convencional pela injeção de morfolino emRNA^7,8, avanços recentes na tecnologia crispr/Cas9 tornaram a genética reversa em zebrafish altamente eficiente⁹. Além disso, muitas técnicas clássicas em embriologia, como transplante celular ou cirurgia tecidual, podem ser^{aplicadas 4,}10,11.

As técnicas de redução de tamanho foram originalmente desenvolvidas em anfíbios e outros animais não vertebrados¹². Por exemplo, no Xenopus laevis, outro modelo popular de animais vertebrados, a bisection ao longo do eixo animal-vegetal na fase blástula pode produzir embriões com redução de tamanho^12,13. Entretanto, em nossas mãos esta aproximação de uma etapa conduz aos embriões dorsalizados ou ventralized no zebrafish, presumivelmente porque os determinantes dorsais são distribuídos desigual e um não pode saber sua localização da morfologia dos embriões. Aqui nós demonstramos uma técnica de corte de duas etapas alternativa para o zebrafish que produz embriões normalmente tornando-se mas menores. Com esta técnica, as pilhas são removidas primeiramente do pólo animal, uma região das pilhas ingênuas que faltam na atividade do organizador. Para equilibrar a quantidade de gemas e células, que é importante para a Epibolia e posterior morfogênese, gema é então removida. Aqui, detalhamos este protocolo e fornecemos dois exemplos de invariância de tamanho na formação de padrões; formação somita e padronização do tubo neural ventral. Combinado com a imagem latente quantitativa, nós utilizamos a técnica da redução do tamanho para examinar como os tamanhos dos somitos e do tubo neural são afetados em embriões reduzidos tamanho.

Protocolo

Todos os procedimentos relacionados aos peixes foram realizados com a aprovação da Comissão de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) na Harvard Medical School.

1. preparação da ferramenta e do reagente

1. Faça um loop de arame para cortar embriões
   1. Tomar 20 cm de fio de aço inoxidável que é rígida e não corrosivo com um diâmetro de 40 μm. Loop o fio através de vidro capilar (1,0 mm diâmetro exterior, 0,5 mm diâmetro interno, nenhum filamento), fazendo um pequeno loop na parte superior (loop comprimento é de 1,0 mm)
   2. Põr uma gota pequena do lustrador de prego desobstruído na ponta do capilar de vidro entre o laço do fio para segurá-lo no lugar. Deixe secar. Certifique-se de não obter qualquer esmalte na porção do loop, pois pode danificar os embriões.
   3. Prenda o capilar de vidro com o laço em um Chopstick de madeira (9 "chopsticks descartáveis de bambu quebrados ao meio) usando a fita do laboratório. Deixe aproximadamente 2,5 cm do capilar de vidro que estende além do chopstick, de modo que a peça do chopstick da ferramenta não mergulhe na água. Ajuste este comprimento à preferência.
2. Alternativamente, faça uma agulha de vidro para cortar embriões
   1. Belisque uma extremidade da pipeta de vidro de Pasteur com fórceps, ao segurar o outro lado com uma mão. Aqueça a parte fina da pipeta sobre uma lâmpada de espírito ou um queimador de Bunsen.
   2. Mão-puxe a pipeta de vidro. A pipeta ideal como um diâmetro de aproximadamente 30 μm e uma curva suave (raio de curvatura = aproximadamente 5 mm). O diâmetro e a curvatura apropriados são obtidos com prática e alguma possibilidade.
3. Prepare a celulose metílica
   1. A celulose metílica é usada para segurar os embriões ao cortar. Fazer 2% solução de metil celulose em solução de Ringer 1/3x (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, e 5 mm 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanoesulfonic ácido (HEPES; pH 7,2)). Agite o pó de metilo celulose em 1/3x solução de Ringer a 4 ° c durante a noite.
   2. Opcionalmente, adicione ~ 1,5 mL de vermelho de fenol (0,5% em solução de estoque DPBS) a 10 mL de solução de celulose metil 2%, até vermelho, para tornar a solução visível. Agite-a até que a cor se torne uniforme.

2. preparação de embriões de zebrafish para redução cirúrgica do tamanho

1. Coletar embriões
   1. Coloque um ou dois homens e uma ou duas fêmeas zebrafish em uma câmara de acasalamento preenchido com muita água. Separe machos e fêmeas usando um divisor de plástico. Use a linha AB para a imagem latente somite (seção 4) e uma linha transgénica do repórter do padronização do tubo neural (nkx 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, ou Olig2: dsred) para a imagem latente do tubo neural. Deixe-os na câmara durante a noite.
      Nota: A escolha dos adultos é importante para a obtenção de ovos que sobrevivem bem a cirurgia. Tipicamente, as fêmeas saudáveis novas produzem ovos saudáveis.
   2. Na manhã seguinte, transfira a câmara em águas rasas e coloque a câmara com ligeira inclinação. Retire o divisor para que o peixe pode acasalar.
   3. Recolher os ovos, derramando em um filtro de chá. Transfira os ovos para uma placa de Petri com água de ovo (para água de ovo de 20x, sal de mar instantâneo de 6 g, 1,5 g CaSO₄ e 1 L H₂O; use em 1x). Para uma melhor encenação, colete os ovos logo após a desova. Coloque os embriões numa incubadora de 28,5 ° c.
   4. Se necessário, injete morfolino, mRNA, etc., em estágios de 1 a 4 células seguindo um protocolo comum^7,8. Injete o mRNA para a etiqueta fluorescente da membrana (mem-mCherry, mem-mBFP1, ou mem-mcitrine) para a imagem latente do tubo neural (seção 5).
2. Dechorionato usando Pronase
   1. Em torno do 128-Cell ao estágio da 256-pilha, transfira embriões saudáveis a um prato de vidro de 35 milímetros enchido com a água do ovo. Retire o máximo de água do ovo possível do prato.
   2. Adicionar 1 mL de Pronase de 20 mg/mL. Agite suavemente os embriões ao redor movendo a placa e pipetando suavemente a solução para cima e para baixo para ajudar a dechorionação usando uma pipeta de vidro.
   3. Quando os corions começam a perder a elasticidade (geralmente 1-4 min após a adição de Pronase, dependendo da quantidade de ovos e água), adicione o máximo de água do ovo possível para diluir a Pronase. Avalie a perda da elasticidade delicadamente tocando o córion com fórceps; o córion deve segurar o dente sem imediatamente saltando para trás. Transfira os ovos para outro prato com água de ovo usando uma pipeta de vidro (neste ponto, a maioria dos corions não são quebrados).
      1. Alternativamente, despeje suavemente os embriões do prato em um grande 400 mL copo de vidro preenchido com água de ovo sem expor embriões ao ar. Então, deixe os embriões resolver completamente. Incline a taça para permitir que os embriões caiam de um lado. Colete esses embriões usando uma pipeta de vidro e transfira para um novo prato de vidro de 35 mm preenchido com a solução de 1/3x Ringer.
   4. Aguarde alguns minutos até que a maioria dos corions perdem a elasticidade completamente. Retire as restantes corions dos embriões, introduzindo suavemente os ovos em pipetagem. Retire os embriões danificados e incubar os embriões numa incubadora de 28,5 ° c.

3. redução e recuperação do tamanho cirúrgico

1. Prepare um prato de vidro limpo 35 mm. Espalhe aproximadamente 0,5 mL de celulose metil 2% (em solução de 1/3x Ringer, com vermelho de fenol para ajudar a Visualizar) perto do centro da parte inferior do prato maior usando uma espátula de plástico. Espalhe fina e uniformemente a celulose metílica a uma espessura de aproximadamente 0,5 mm.
2. Despeje aproximadamente 30 mL de solução de 1/3x Ringer para o lado do prato e deixe-se espalhar para o resto do prato, cobrindo a celulose metílica.
3. Coloc embriões dechorionated no estágio da 256-pilha-1K-pilha na celulose methyl de 2%. Ajuste a orientação dos embriões para o lado para visualizar as células e a gema. (Figura 1)
4. Pique aproximadamente 30%-40% das células do blastoderme perto do pólo animal cortando perpendicularmente ao eixo animal-vegetal usando o laço de arame (ou a agulha de vidro) (Figura 1, painéis superiores). Depois de remover as células, Bata suavemente as extremidades em conjunto para ajudar as células restantes ficar de volta. Em poucos minutos, as células mortas devem Slough fora quando o embrião começa a curar.
5. Fazer uma pequena ferida para a gema perto do pólo vegetal em vez de "cortar" a gema (Figura 1 painéis médios). Ferida a gema por entalhar a membrana de ovo com o fio montado. Yolk vai ooze para fora por alguns minutos depois de ferir, e então a ferida vai curar (Figura 1 painéis de fundo).
6. Quando a gema parar de escorar, mova o embrião usando um pipeta fora da celulose metílica no mesmo prato para permitir que eles se recuperem melhor.
7. Repita os passos 3.4-3.6 para todos os embriões. Deixe o prato estável durante 30 minutos enquanto os embriões se recuperam.
8. Transfira os embriões para um novo prato com a solução de 1/3x Ringer fresca e coloque-os na incubadora de 28,5 ° c para permitir que se recuperem completamente.
   1. Opcional Se o estágio de interesse for o estágio Somito precoce, os embriões podem ser incubados a 20 ° c após serem incubados a 28,5 ° c até o estágio de blindagem, para ajustar o tempo de experimentação e imagem.

4. imagem latente viva de Somitogenesis de zebrafish

1. Prepare 100 mL de solução de agarose a 1% adicionando 1 g de agarose a 100 mL de água de ovo, aquecendo até que o agarose esteja totalmente dissolvido. Deixe esfriar por 5-10 min a uma temperatura de 62-72 ° c.
2. Prepare uma montagem para a imagem latente.
   Nota: este guia foi desenvolvido para uso com um microscópio de campo largo invertido.
   1. Despeje ~ 15 mL de 1% de agarose em um 100 mm x 15 mm plástico petri prato.
   2. Coloque suavemente um modelo de molde de montagem dorsal v1⁵ na parte inferior da placa de Petri. Mantenha o molde na parte inferior usando um peso, tal como o tubo de 15 mL com água.
      Nota: Isto é assim que os embriões são tão próximos à parte inferior do prato de Petri como possível, ao usar um microscópio invertido. Embora os embriões sejam montados lateralmente para a imagem latente somite, aqui a montagem dorsal v1⁵ é usada desde que prende os embriões melhores em estágios somite adiantados.
   3. Deixe esfriar até agarose é totalmente solidificada. Despeje em ~ 30 mL de água de ovo com 0, 1% tricaína, e Retire cuidadosamente o molde por delicadamente curiosos fora com fórceps.
3. Monte embriões para a imagem latente somite
   1. Prepare 1% de baixo agarose de fusão em 1/3x solução de Ringer (ou água de ovo) e mantê-lo em 42 ° c. Aguarde até que a temperatura desce para 42 ° c.
   2. um microscópio de dissecção, coloque um embrião por poço. Pipetando aproximadamente 1 μL de agarose de baixa fusão no poço para ajustar finamente o tamanho do poço ao tamanho de embriões individuais que variam em tamanho, especialmente entre aqueles com e sem redução de tamanho.
   3. Oriente rapidamente os embriões antes que o agarose de baixo derretimento seja solidificado assim que os embriões enfrentam completamente lateralmente ao prato. Após a montagem de embriões, Coloque suavemente o deslizamento da tampa na montagem do agarose para segurar os embriões no lugar. A orientação é particular importante para a imagem latente a longo prazo do somite porque os embriões têm que exatamente ser montados lateralmente para que todos os limites somita sejam claramente imaged em estágios mais atrasados.
   4. Submerge longe da área de montagem e manipular um vidro de cobertura de 25 mm x 25 mm, de modo que é 45 graus de deslocamento da orientação do recuo quadrado feito pelo molde. Deslize a lamínula sobre o molde nesta orientação até que cada canto esteja descansando de um lado diferente do molde.
      Nota: Embora este protocolo seja para um microscópio invertido, coloc um vidro da tampa sobre o molde é ainda importante de modo que os embriões não se movam ao transferir ao microscópio.
4. Processo de formação de imagem somita
   1. Prewarm o microscópio a 28 ° c em uma incubadora construída com placas do foamcore e um calefator do armário.
   2. Coloque o prato de Petri com os embriões montados na fase do microscópio. Encontre o embrião montado no poço superior esquerdo da montagem de agarose com lente de ampliação mais baixa, em seguida, mude o objetivo para 10x.
   3. Configurar a aquisição de imagens.
      Nota: Esta instrução é para o campo brilhante.
   4. Encontre condições para a energia de luz, tempo de exposição e condensador para que o limite somita possa ser claramente visto. Usando as configurações da z-Stack, defina o plano de imagem mais baixo e mais alto desejado. Defina o intervalo de tempo e tempo total. Encontre e registre as posições XY de todos os embriões montados assim que os embriões múltiplos podem ser timelapse imaged imediatamente.
5. Meça os comprimentos de PSM e de somitos usando Fiji¹⁶.

5. imagem de padronização do tubo neural

1. Prepare 100 mL de solução de agarose a 1% adicionando 1 g de agarose a 100 mL de água de ovo, aquecendo até que o agarose esteja totalmente dissolvido. Deixe esfriar por 5-10 min a 62-72 ° c. Ajuste o tricaina a 0, 1%.
2. Prepare uma montagem dorsal para a imagem latente.
   Nota: este guia é desenvolvido para uso com um microscópio de fluorescência vertical. Para microscópios invertido os pratos inferiores do lamela são necessários e a orientação da montagem em etapa 3 é lanç.
   1. Despeje em ~ 15 mL de 1% de agarose em um 100 mm x 15 mm plástico petri prato. Flutue delicadamente um molde dorsal da montagem v1 na superfície do agarose para evitar introduzir bolhas de ar. Deixe esfriar até agarose é totalmente solidificada.
   2. Remova com cuidado o molde com fórceps ou uma lâmina de lâmina. Encha o prato com água de ovo com 0, 1% de tricaína e cubra até o uso.
3. Monte embriões para a imagem latente do tubo neural.
   1. Permitir que os embriões transgênicos ou injetados de tamanho fluorescente reduzidos e controle se desenvolvam até o estágio de 20-25 somita (aproximadamente 18-22 h após a fertilização). Os embriões que expressam uma etiqueta fluorescente da membrana (mem-mcherry, mem-mBFP1, ou mem-mcitrine) e um repórter transgênicas do padronização do tubo neural (nkx 2.2: mem-GFP, dbx1b: GFP, ou Olig2: dsred) são usados para a imagem latente.
   2. Substitua o meio da água do ovo na montagem dorsal preparada com solução de trabalho do tricaina de 0, 1%. Pipeta delicadamente nos embriões a ser imaged dentro aos poços do Monte dorsal.
   3. Manipule os embriões na orientação correcta, de modo a que a cabeça esteja virada para a frente na montagem e a cauda aponte para a retaguarda com a porção dorsal virada para a superfície da água.
   4. Orientar o embrião de tal forma que a cauda está deitado plana e não apontou para baixo para a parte inferior do prato. Às vezes é útil para descansar a porção posterior da cauda na borda lateral do poço de montagem para evitar que a cauda de afundar e inadvertidamente imagem do hindbrain. Repita para cada embrião. Certifique-se com embriões reduzidos do tamanho que não caem profundamente nos poços a ser imaged.
   5. Mergulhe fora da área de montagem e manipule um vidro de cobertura de 25 mm x 25 mm de modo que seja 45 ° offset da orientação do recuo quadrado feito pelo molde. Deslize a lamínula sobre o molde nesta orientação até que cada canto esteja descansando de um lado diferente do molde.
   6. Gire lentamente a cobertura até que caia suavemente sobre a área de montagem. Verifique se os embriões ainda estão montados nas posições e orientações corretas. Se muito movimento é causado pela queda do vidro, retire suavemente e repita a montagem a partir do passo C.
4. Imagem em 3-D o desenvolvimento da medula espinhal.
   1. Transportar suavemente o prato contendo embriões montados para o microscópio confocal. Para a imagem viva a longo prazo, seja certo usar um microscópio incubado. Caso contrário, as baixas temperaturas são toleráveis.
   2. a iluminação do campo do brightfield, navegue ao embrião à imagem e Centre o campo de visão na posição anterior-posterior preferida. Para permitir uma comparação detalhada entre embriões, esta posição em cada embrião deve ser consistente.
   3. Ajuste os parâmetros da imagem latente para excitar e capturar o sinal das proteínas fluorescentes que estão sendo imaged. Os parâmetros podem ser ajustados pelo olho para criar uma imagem desejada na amostra inicial. Para habilitar a consistência de medição, aplique essas configurações a todos os embriões no conjunto de dados. Se muitas pilhas z são necessárias otimizar as configurações de velocidade.
   4. Usando as configurações da pilha z, defina o plano de imagem mais baixo e mais alto desejado. Para obter uma qualidade de imagem ideal na pilha z, defina a resolução z como a mais alta que é ideal para a configuração de abertura. Boas imagens podem ser geradas com 1 μm de espaçamento z.
5. Analise os dados de imagem por qualquer método preferido.
   Nota: Neste caso, a análise foi realizada com scripts MATLAB personalizados que permitem a segmentação simples das porções neurais de uma imagem e a quantificação do sinal de imagem.

Resultados

A redução do volume de yolk é importante para a morfologia normal
Como descrito recentemente em Almuedo-Castillo et al.¹⁷, a redução do tamanho dos embriões pode ser alcançada sem reduzir o volume de gema. Para comparação com e sem redução do volume de gemas, realizamos tanto o corte em duas etapas (tanto blástula quanto gema) e o corte somente de blástula (Figura 2 e filme suplementar 1). Embriões picados em duas etapas apresentar...

Discussão

Historicamente, entre os animais vertebrados, a redução do tamanho tem sido realizada principalmente com embriões de anfíbios, dividindo os embriões ao longo do eixo animal-vegetal em uma fase de blástula¹². No entanto, existem principalmente duas diferenças entre os embriões de rã e de zebrafish quando Bisect embriões. Primeiro, no estágio em que os embriões de zebrafish se tornam tolerantes à dividindo (fase blástula), o organizador está localizado em uma área restri...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri PYREX de 60 mm	CORNING&	nbsp; 3160-60
Agarose	affymetrix	75817	Para fazer uma montagem para imagens ao vivo
Agarose, baixa temperatura de gelificação Tipo VII-A	SIGMA-ALDRICH	A0701-25G
CaCl2	EMD	CX0130-1	Para solução de 1/3 de Ringer
CaSO4	Para água
Lamínula (25 mm x 25 mm, Espessura 1)	Espátula Descartável CORNING	2845-25
	VWR	80081-188
Placa de espuma	ELMER'S	951300	Para incubadora de microscópio
Fórfólio (N.º 55)	FST	11255-20
Pipeta de vidro	VWR	14673-043
HEPES	SIGMA Life Science	H4034	Para solução de campainha 1/3
INCUKIT XL para incubadoras de armários	INCUBADORA Warehouse.com		Para incubadora de microscópio
Sal marinho instantâneo	Oceano instantâneo	138510	Para água de ovo
KCl	SIGMA-ALDRICH	P4504	Para solução de 1/3 de Ringer
Metilcelulose	SIGMA-ALDRICH	M0387-100G
NaCl	SIGMA-ALDRICH	S7653	Para solução de 1/3 de Ringer
Placa de Petri	Falcon	351029	Para fazendo uma montagem para imagem ao vivo
Fenol vermelho	SIGMA Life Science	P0290
Bomba de pipeta	BEL-ART PRODUCTS	F37898
Pronase	EMD Millipore Corp	53702-250KU
Tricaine-S (MS222)	WESTERN CHEMICAL INC
fino brilhante recozido 316L diâmetro. 0,035 mm Fios de tecelagem de aço inoxidável	Sandra		O fio que usamos foi obtido há ~ 20 anos e não conseguimos encontrar exatamente o mesmo. Este produto tem o mesmo material e diâmetro que o que usamos.