Aqui nós descrevemos dois métodos não-invasores para controlar cronicamente a atividade neuronal usando a quimiogenética nos ratos. Os Eye-gotas foram usados para entregar o Clozapine-N-óxido (CNO) diário. Nós igualmente descrevemos dois métodos para a Administração prolongada de CNO na água bebendo. Estas estratégias para o controle neuronal crônico exigem a intervenção mínima que reduz o stress dos animais.
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Artigo de método
Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estratégias quimiogenéticas surgiram como ferramentas confiáveis para o controle remoto da atividade neuronal. Entre estes, os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) tornaram-se a aproximação chemogenetic a mais popular usada na neurociência moderna. A maioria de estudos entregam o ligante Clozapine-N-óxido (CNO) usando uma única injeção intraperitoneal, que seja apropriada para a ativação/inibição aguda da população neuronal alvejada. Há, no entanto, apenas alguns exemplos de estratégias para a modulação crônica de neurônios controlados por DREADD, a maioria dos quais dependem do uso de sistemas de parto que necessitam de intervenção cirúrgica. Aqui, nós expandimos em duas estratégias não invasoras para entregar o ligante CNO para manipular cronicamente a população neural nos ratos. O CNO foi administrado por meio de gotas oculares repetitivas (diárias), ou cronicamente através da água potável do animal. Estes paradigmas não invasivos resultam em uma ativação robusta dos receptores de designers que persistiram ao longo dos tratamentos CNO. Os métodos descritos aqui oferecem alternativas para o controle crônico de atividade neuronal de DREADD-negociado e podem ser úteis para experimentos projetados para avaliar o comportamento em animais em movimento livre, com foco em métodos de entrega de CNO menos invasivos.
Introdução
Os avanços técnicos no campo da neurociência permitiram aos cientistas identificar e controlar com precisão a atividade de populações neuronais particulares1. Isso contribuiu para melhor compreender a base dos circuitos neuronais e seu impacto no comportamento animal, bem como, revisando dogmas estabelecidos2,3. Entre essas novas ferramentas, as estratégias optogenéticas e quimiogenéticas tiveram um impacto profundo não só na qualidade das descobertas, mas também na forma como os experimentos são concebidos e projetados4. No presente manuscrito, focamos em estrat....
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Protocolo
Todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes dos comitês de cuidado e uso do animal do Instituto Nacional de saúde mental (NIMH). Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o número de animais utilizados.
1. injeções de vírus associadas ao adeno no hipocampo
Nota: O tipo selvagem ratos masculinos do fundo misturado (híbrido B6/129 F1, 3 meses velho) era para injetado estereotaxicamente com um AAV que codifica o receptor muscarínicos m3 (hM3Dq) no hipocampo. Durante todo o experimento, camundongos foram alojados em um único, uma luz regular de 12 h: 12 h de ciclo escuro (....
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Resultados
Observou-se que a entrega repetitiva de CNO utilizando colírio provocou uma indução robusta da expressão de c-fos na maioria dos neurônios infectados (Figura 1C), demonstrando que a efetividade da entrega de CNO é sustentada durante a exposição repetitiva. Além disso, uma indução significativa de c-fos foi observada em amostras coletadas 2 h após o tratamento com CNO, em comparação com as amostras obtidas 6 h após a exposição à CNO (figuras 1D-E), demonstrando que as alteraç.......
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Discussão
DREADDs surgiram como uma abordagem popular e eficaz para manipular remotamente a atividade neuronal17. O projeto de estratégias alternativas para a entrega CNO aumentará amplamente o espectro de opções disponíveis para configurações experimentais específicas. Além disso, estratégias não invasivas para a entrega da CNO minimizam qualquer potencial interpretação errónea dos resultados, reduzindo os efeitos colaterais adversos que podem impactar diretamente a saúde do animal. Aqui, nós descrevemos d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de saúde mental (ZIA MH002964-02). Gostaríamos de agradecer o apoio do núcleo comportamental de roedores NIMH IRP (ZIC MH002952).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | #A2153-100G | Pó liofilizado > 96% (eletroforese em gel de agarose) |
| Camundongos C57BL / 6J | O laboratório Jackson | # 000664 | camundongos machos, 3 meses de idade |
| Capilares | Drummond Scientific Company | # 3-000-203-G / X | Diâmetro externo: 1,14 polegadas |
| Clozapina-N-óxido Sigma | #C0832 | 5 mg | |
| Forano | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurano, |
| USP Microinjetor III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Injetor Programável de Nanolitros |
| Mídia de montagem | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold reagente antifade |
| Paraformaldeído | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Solução aquosa a 16% (sem metanol), 10 mL |
| Anticorpo c-Fos primário | Tecnologia de sinalização celular | #2250S | c-Fos (9F6) MAb de coelho ( 100µ L) |
| rAAV5 / hSyn-hm3D-mCherry | UNC Título do núcleo | ~ 3 x 10 < sup > 12 < / sup> vg / mL | |
| rAAV5 / hSyn-mCherry | UNC Título do núcleo | ~ 3x10e12 vg / mL | |
| Anticorpo secundário | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Burro anti-coelho IgG (H + L), 2mg / ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
Referências
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of dep....
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Reimpressões e permissões
