Artigo de método

Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD

DOI:

10.3791/59439

⸱

25 de agosto de 2019

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1Section on Light and Circadian Rhythms (SLCR), National Institute of Mental Health, 2Howard Hughes Medical Institute, Department of Neuroscience, Scripps Research Institute

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós descrevemos dois métodos não-invasores para controlar cronicamente a atividade neuronal usando a quimiogenética nos ratos. Os Eye-gotas foram usados para entregar o Clozapine-N-óxido (CNO) diário. Nós igualmente descrevemos dois métodos para a Administração prolongada de CNO na água bebendo. Estas estratégias para o controle neuronal crônico exigem a intervenção mínima que reduz o stress dos animais.

Resumo

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Estratégias quimiogenéticas surgiram como ferramentas confiáveis para o controle remoto da atividade neuronal. Entre estes, os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) tornaram-se a aproximação chemogenetic a mais popular usada na neurociência moderna. A maioria de estudos entregam o ligante Clozapine-N-óxido (CNO) usando uma única injeção intraperitoneal, que seja apropriada para a ativação/inibição aguda da população neuronal alvejada. Há, no entanto, apenas alguns exemplos de estratégias para a modulação crônica de neurônios controlados por DREADD, a maioria dos quais dependem do uso de sistemas de parto que necessitam de intervenção cirúrgica. Aqui, nós expandimos em duas estratégias não invasoras para entregar o ligante CNO para manipular cronicamente a população neural nos ratos. O CNO foi administrado por meio de gotas oculares repetitivas (diárias), ou cronicamente através da água potável do animal. Estes paradigmas não invasivos resultam em uma ativação robusta dos receptores de designers que persistiram ao longo dos tratamentos CNO. Os métodos descritos aqui oferecem alternativas para o controle crônico de atividade neuronal de DREADD-negociado e podem ser úteis para experimentos projetados para avaliar o comportamento em animais em movimento livre, com foco em métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os avanços técnicos no campo da neurociência permitiram aos cientistas identificar e controlar com precisão a atividade de populações neuronais particulares1. Isso contribuiu para melhor compreender a base dos circuitos neuronais e seu impacto no comportamento animal, bem como, revisando dogmas estabelecidos2,3. Entre essas novas ferramentas, as estratégias optogenéticas e quimiogenéticas tiveram um impacto profundo não só na qualidade das descobertas, mas também na forma como os experimentos são concebidos e projetados4. No presente manuscrito, focamos em estratégias quimiogenéticas para o controle da ativação de neurônios por meio de estratégias de receptores-ligantes projetados. Os receptores do desenhador ativados exclusivamente por drogas do desenhador (DREADDs) representam uma das ferramentas chemogenetic as mais populares para o controle remoto da atividade neuronal, como revisto por Roth 20165. DREADDs utilizam receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que são especificamente ativados por um ligand inerte, Clozapine-N-óxido (CNO)6.

A maioria dos estudos utiliza o CNO administrado por injeções intraperitoneal (i.p.), que efetivamente controla a dosagem e o tempo de ativação de receptores projetados de forma aguda. No entanto, quando a ativação de DREADD repetitiva ou crônica é necessária, o uso de múltiplas injeções i.p. se torna inviável. Para abordar esse problema, foram relatadas diferentes estratégias para o parto crônico de CNO, incluindo os minipumps implantados7 e as cânulas intracranianas8,9. Para diferentes extensões, todas essas estratégias causam o estresse e a dor dos animais10, e necessitam de uma intervenção cirúrgica que também possa ter um impacto direto nas respostas comportamentais a serem testadas11. Aqui, nós descrevemos três estratégias não invasoras para a entrega crônica de CNO.

Para esta finalidade, os ratos foram injetados estereotaxicamente no hipocampo com um vírus adeno-associado (AAV) que codifica uma versão projetada do receptor muscarínicos do excitatórios m3 (hM3Dq) que quando ativado pelo ligante CNO conduz à explosão-como o acendimento de neurônios6. Mostrou-se anteriormente que um único olho-gota contendo CNO pode efetivamente provocar uma ativação robusta de DREADD-expressando neurônios12. Aqui nós descrevemos um método modificado para a entrega repetitiva de gotas de olho. Para alcançar o controle crônico e sustentado dos receptores do desenhador, nós descrevemos em seguida uma estratégia não invasora para entregar CNO aos ratos através da água bebendo. Finalmente, nós descrevemos um paradigma alternativo para entregar CNO na água bebendo durante uma janela restrita do tempo. A atividade locomotora de camundongos, bem como o comportamento de beber e o consumo de soluções calórica doces, são, na sua maioria, restritas à porção escura do ciclo claro/escuro13,14. Por isso, adotou-se um protocolo baseado na preferência do camundongo pela sacarose. Medindo a indução do gene imediato-cedo c-fos em pilhas AAV-infectadas, como um leitura para a ativação neuronal12,15, nós encontramos que estas estratégias da entrega de CNO robustamente ativam neurônios dreadd-controlados sobre prolongado Durações.

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Protocolo

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Todos os animais foram manuseados de acordo com as diretrizes dos comitês de cuidado e uso do animal do Instituto Nacional de saúde mental (NIMH). Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o número de animais utilizados.

1. injeções de vírus associadas ao adeno no hipocampo

Nota: O tipo selvagem ratos masculinos do fundo misturado (híbrido B6/129 F1, 3 meses velho) era para injetado estereotaxicamente com um AAV que codifica o receptor muscarínicos m3 (hM3Dq) no hipocampo. Durante todo o experimento, camundongos foram alojados em um único, uma luz regular de 12 h: 12 h de ciclo escuro (T24), com acesso a alimentos e água ad libitum.

  1. Antes de realizar cirurgias estereotómicas, limpe e esterilize o quadro estereotódico e todos os instrumentos necessários.
    Nota: os cortinas cirúrgicos podiam ser usados para manter um campo estéril e para reduzir a perda de calor do rato.
  2. Anestesiam profundamente o rato utilizando isoflurano. Para fazer isso, primeiro ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para aproximadamente 1,5 L/min e, em seguida, ajuste o vaporizador de isoflurano para aproximadamente 3-5% para a indução e aproximadamente 1-3% para manutenção.
    1. Para garantir que o animal está totalmente inconsciente, aperte a pata do mouse; o animal é adequadamente anestesiado quando a resposta vacinal à pinça está ausente.
  3. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento para manter a estabilidade da temperatura do corpo do mouse.
  4. Raspar a parte superior da cabeça e fixar a cabeça do mouse para o quadro estereotódico. Então, aplique o lubrificante protetor da ocular nos olhos, limpe a superfície esfregando com o Povidone-Iodo e o etanol 70%, e exponha o crânio usando um bisturi estéril.
  5. Calibre o quadro para o ponto de Bregma, em seguida, perfurar em uma coordenada medial-lateral de 2,9 mm e uma coordenada anterior-posterior-2,7 mm para atingir o hipocampo.
    Nota: se outro alvo cerebral precisa ser injetado, determine as coordenadas desejadas para injeção usando o Paxinos e Franklin mouse Atlas16.
  6. Uma vez exposto o cérebro, injetar unilateralmente 90 nL do AAV na profundidade dorsal-ventral de-3,0 mm no hipocampo usando um microinjector e puxou pipetas microcapilares (Figura 1a).
    Nota: consulte a tabela de materiais para o título de AAV usado neste experimento. Para outras áreas cerebrais, ajuste o volume de injeção de AAV conforme necessário.
  7. No final do procedimento cirúrgico, feche a incisão com suturas de náilon e aplique antibióticos tópicos no local da ferida.
  8. Administrar analgésicos (buprenorfina, 0,1 mg/kg) sistemicamente imediatamente após a cirurgia, e 4-6 horas depois.
  9. A partir de 4 semanas após a injeção, os camundongos sujeitos a qualquer um dos paradigmas descritos na seção a seguir para controlar cronicamente os neurônios expressando o receptor excitatória designer.

2. entrega repetitiva de CNO usando Eye-gotas

  1. ACCLIMATE os animais para a manipulação por agarrando cada rato 3 min diariamente por 3-4 dias antes da administração de colírio.
  2. Dissolver clozapina-N-óxido (CNO,5 mg) em 1 mL de solução salina estéril 0,9% (solução de estoque: 5 mg CNO/mL). Mantenha a solução refrigerada a 4 ° c.
  3. Pesar cada rato antes de iniciar o experimento para determinar a quantidade de CNO a ser entregue. Use 1-3 μL de gota (por olho) para atingir 1,0 mg de CNO/kg de peso corporal.
    Nota: por exemplo, um rato de 20 g deve receber colírio bilateral (2 μL cada).
  4. Entregue os olhos-gotas durante a fase inativa (da luz) dos ratos, 2 h antes que as luzes se Desligem (tempo do zeitgeber (ZT) 10). Nos casos em que a CNO necessita de ser entregue durante a fase activa (escura) dos ratinhos, assegure a presença de luz vermelha fraca para uma correcta manipulação dos animais.
    Observação: precauções devem ser tomadas para evitar interromper o ciclo circadiano (e claro/escuro) de animais experimentais.
    1. Utilizando uma micropipeta P10, carregue a quantidade requerida (1-3 μL) de solução de CNO para atingir 1,0 mg de CNO/kg.
      Nota: Use uma ponta de pipeta nova e estéril para cada olho-gota. Neste conjunto de experimentos, foram realizados colírio bilateral de CNO; Entretanto, se uma concentração menor de CNO é exigida, os Eye-Drops unilaterais poderiam igualmente ser aplicados.
    2. Imobilize o rato através do scruff.
    3. Expelir lentamente a solução até que um gotículo estável se forma na ponta da pipeta.
    4. Cuidadosamente trazer a gota perto da córnea do olho do mouse até que a solução é entregue. A ponta da pipeta nunca deve entrar em contato com o olho do mouse.
    5. Solte o mouse, colocando-o de volta em sua gaiola de casa.
  5. Repita este procedimento diariamente durante 5 dias.
    Nota: esta duração pode ser ajustada de acordo com os requisitos experimentais.
  6. Para experimentos de controle, use camundongos injetados por AAV/DREADD submetidos a tratamento simulado (colírio contendo apenas solução salina), e camundongos injetados com um vetor vazio (por exemplo, AAV/mCherry) expostos ao protocolo de colírio de CNO descrito.

3. tratamento crônico de CNO entregado através da água bebendo

  1. Fazer pequenas garrafas usando 50 mL (plástico) tubos cônicos e borracha rolha bicos; Cubra com a folha de alumínio para evitar todos os efeitos luz-negociados na estabilidade de CNO.
  2. Três dias antes de começar com o tratamento de CNO, substitua garrafas de água regulares com os frascos pequenos, contendo 10 ml da água regular, para permitir que os ratos aclimatar a eles. Fixe as garrafas nas gaiolas usando fita adesiva.
  3. Meça o consumo de água diário para cada rato.
  4. Pesar cada rato antes de iniciar o experimento.
  5. Dissolver clozapina-N-óxido (CNO,5 mg) em 1 mL de solução salina estéril a 0,9%. Refrigerar a solução de estoque em 4 ° c.
  6. Use o peso corporal e a quantidade média de água consumida para definir a concentração de solução de CNO para atingir 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
    Nota: os ratos machos adultos (~ 20 g de peso corporal) consomem ~ 5 mL de água por dia (Figura 2a). Portanto, para atingir uma concentração de CNO de 1 mg de CNO/kg, 6,4 μL de solução de estoque de CNO deve ser adicionado a um volume final de 8 mL de água (concentração final: 4 μg CNO/mL). Assim, a dose de CNO para um animal de 20 g que bebe 5 mL de água por dia resulta em 1 mg de CNO/kg.
  7. Determine a dose óptima de CNO que indica a eficácia máxima com concentração mínima de CNO testando uma escala das concentrações. Realize uma análise da resposta da dose para determinar a dose óptima de CNO para o método da água bebendo.
    Nota: as seguintes doses de CNO foram testadas para este experimento: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL e soro fisiológico. 1,0 mg CNO/kg foi testado pela primeira vez, com base em protocolos i.p. e Eye-Drops.
  8. No dia 1, encha a garrafa com 8 mL de água regular e adicione a quantidade necessária de CNO.
    Nota: esta quantidade de água é suficiente para 24 h de acesso à água ad libitum para um rato macho adulto. No caso de outras espécies de roedores serem utilizadas, primeiro meça a quantidade de água consumida diariamente para determinar o volume necessário.
  9. Monitorar a saúde dos animais ao longo do protocolo para garantir que não há efeitos colaterais adversos causados pela água + consumo de CNO.
  10. Após 24 h, substitua as garrafas por água fresca + solução de CNO. Registre o volume consumido durante o dia anterior.
  11. Elimine a água + a solução CNO que não foi consumida em recipientes de resíduos. Descarte garrafas plásticas e substitua as rolhas de borracha todos os dias, após higienização deles de acordo com as diretrizes de instalação de animais.
    Nota: Não misture resíduos aquosos com solventes orgânicos. Contacte o serviço de eliminação de produtos químicos para obter instruções de armazenamento e recolha.
  12. Substitua as garrafas ao mesmo tempo todos os dias durante 5 dia.
    Nota: esta duração pode ser ajustada de acordo com os requisitos experimentais.
  13. Inclua grupos de controle, conforme descrito na etapa 2,6.

4. tratamento restrito de CNO utilizando a preferência dos camundongos pela sacarose

  1. 3 dias antes de começar com o tratamento CNO, coloque uma pequena garrafa contendo 10 mL de água + 1% de sacarose na gaiola, de preferência longe da garrafa de água original.
    Nota: Utilize as mesmas garrafas pequenas descritas no passo 3,1.
  2. Expor os animais à água + 1% de sacarose durante a última porção de sua fase ativa (ZT 18 – 24). Após esta exposição, retire a garrafa com água + sacarose da gaiola.
    Nota: as janelas de tempo diferentes da entrega de CNO podiam ser usadas. Adicionalmente, os camundongos podem ser colocados um ciclo claro/escuro invertido, onde o início da luz ocorre nas horas da noite para facilitar a entrega da CNO.
  3. Medir a água diária + 1% de consumo de sacarose para cada rato.
  4. Pesar cada rato antes de iniciar o experimento.
  5. Use o peso corporal e a quantidade média de água + 1% de sacarose consumida para determinar a dose de solução de CNO para atingir 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
    Nota: a dose óptima de CNO que indica a eficácia máxima com concentração mínima de CNO deve ser testada, como explicado na etapa 3,6.
  6. No dia 1, encha as garrafas com 5 mL de água + 1% de sacarose + CNO (1 mg CNO/kg) e coloque-as na gaiola (sempre no mesmo local) durante a determinada janela de tempo.
  7. No final da janela de tempo restrito, retire as garrafas e medir a quantidade de água + sacarose + CNO consumido.
    Observação: os materiais e as soluções são higienizados ou descartados conforme descrito anteriormente na etapa 3,11.
  8. Repita este procedimento diariamente durante 5 dias.
    Nota: esta duração pode ser ajustada de acordo com os requisitos experimentais.
  9. Inclua um grupo de controle, conforme descrito na etapa 2,6.

5. análise de dados

  1. Perfuse ratos intracardially com o paraformaldeído de 4% (PFA) 2 ou 6 h após ter recebido o último repetitivo (5º dia) CNO olho-gota. Quando CNO é entregado através da água bebendo, substitua a água de CNO + com água na extremidade da fase ativa do rato, a seguir perfuse o rato após 2 ou 6 h acesso do borne-CNO.
    Nota: se a exposição à luz puder afetar a indução de c-fos na área de interesse, mantenha os camundongos em escuridão constante durante o último dia dos experimentos e antes da perfusão.
  2. Dissecar cuidadosamente o cérebro e submergir em solução de PFA de 4% para 9-12h.
  3. Após a fixação da PFA, crioproteja o tecido cerebral usando uma solução de sacarose a 30% (Aguarde até que o cérebro afunda) e, em seguida, corte o cérebro usando um criostato.
  4. Transfira as secções do cérebro coronal (35 μm) para uma solução contendo 1X PBS, 10% de albumina sérica bovina e 0,3% de Triton X-100 durante 1 h à temperatura ambiente.
  5. Incubar as secções cerebrais com uma solução de anticorpos anti-c-fos (1:2500) a 4 ° c durante a noite com agitação constante.
  6. Após 3 lavagens de 5 min cada uma com uma solução contendo 1X PBS e 0,3% Triton X-100, incubar as amostras com uma solução de anticorpo secundário (1:500) conjugado com Alexa para 1 h à temperatura ambiente longe da luz e com agitação constante.
  7. Obter imagens digitais usando um microscópio confocal. Monte e processe imagens capturadas com um software de edição e análise de fotos (por exemplo, Adobe Photoshop).
  8. Para análise de dados, delinear e medir a área infectada por AAV (células mCherry (+)) usando o software ImageJ e quantificar o número de células c-fos (+) dentro desta região para obter o número de células ativadas por área. Combine os resultados obtidos a partir de 3 secções separadas por animal.

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Resultados

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Observou-se que a entrega repetitiva de CNO utilizando colírio provocou uma indução robusta da expressão de c-fos na maioria dos neurônios infectados (Figura 1C), demonstrando que a efetividade da entrega de CNO é sustentada durante a exposição repetitiva. Além disso, uma indução significativa de c-fos foi observada em amostras coletadas 2 h após o tratamento com CNO, em comparação com as amostras obtidas 6 h após a exposição à CNO (figuras 1D-E), demonstrando que as alteraç...

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Discussão

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DREADDs surgiram como uma abordagem popular e eficaz para manipular remotamente a atividade neuronal17. O projeto de estratégias alternativas para a entrega CNO aumentará amplamente o espectro de opções disponíveis para configurações experimentais específicas. Além disso, estratégias não invasivas para a entrega da CNO minimizam qualquer potencial interpretação errónea dos resultados, reduzindo os efeitos colaterais adversos que podem impactar diretamente a saúde do animal. Aqui, nós descrevemos d...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural do Instituto Nacional de saúde mental (ZIA MH002964-02). Gostaríamos de agradecer o apoio do núcleo comportamental de roedores NIMH IRP (ZIC MH002952).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BSASigma#A2153-100GPó liofilizado > 96% (eletroforese em gel de agarose)
Camundongos C57BL / 6JO laboratório Jackson# 000664camundongos machos, 3 meses de idade
CapilaresDrummond Scientific Company# 3-000-203-G / XDiâmetro externo: 1,14 polegadas
Clozapina-N-óxido Sigma#C08325 mg
ForanoBaxter#NDC 10019-360-60Isoflurano,
USP Microinjetor IIIDrummond Scientific Company#3-000-207Nanoject III - Injetor Programável de Nanolitros
Mídia de montagemInvitrogen#P36930Prolong Gold reagente antifade
ParaformaldeídoElectron Microscopy Sciences#15710Solução aquosa a 16% (sem metanol), 10 mL
Anticorpo c-Fos primárioTecnologia de sinalização celular#2250Sc-Fos (9F6) MAb de coelho ( 100µ L)
rAAV5 / hSyn-hm3D-mCherryUNC Título do núcleo~ 3 x 10 < sup > 12 < / sup> vg / mL
rAAV5 / hSyn-mCherryUNC Título do núcleo~ 3x10e12 vg / mL
Anticorpo secundárioInvitrogen#A21206Alexa Fluor TM 488 Burro anti-coelho IgG (H + L), 2mg / ml
Triton X-100americanbio.com#AB02025-00100
Ciência da vida do vetor: do vetor:

Referências

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