Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente

Resumo

A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.

Resumo

Várias técnicas dependem da detecção de sinais de fluorescência para identificar ou estudar fenômenos ou para elucidar funções. A separação destes sinais da fluorescência foi provada complicada até o advento da imagem latente hiperespectrais, em que as fontes da fluorescência podem ser separadas de se e de sinais do fundo e do autofluorescence (dado o conhecimento de seu espectral assinaturas). Entretanto, a imagem latente hiperespectrais tradicional, da emissão-exploração sofre dos tempos lentos da aquisição e das baixas relações do sinal-à-ruído devido à filtração necessária da excitação e da luz da emissão. Foi mostrado previamente que a imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração reduz o tempo necessário da aquisição ao simultaneamente aumentar a relação sinal-à-ruído de dados adquiridos. Usando equipamentos comercialmente disponíveis, este protocolo descreve como montar, calibrar e usar um sistema de microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação para a separação de sinais de várias fontes de fluorescência em uma única amostra. Quando altamente aplicável à imagem latente microscópica das pilhas e dos tecidos, esta técnica pode igualmente ser útil para qualquer tipo de experiência que utiliza a fluorescência em que é possível variar comprimentos de onda da excitação, incluindo mas não limitado a: imagem latente química, aplicações ambientais, cuidados com os olhos, ciência dos alimentos, ciência forense, ciência médica e mineralogia.

Introdução

A imagem latente espectral pode ser executada em uma variedade de maneiras e é referida por diversos termos^1,2,3,4. Em geral, a imagem espectral refere-se aos dados adquiridos em pelo menos duas dimensões espaciais e uma dimensão espectral. A imagem latente Multispectral e hiperespectrais é distinguida o mais frequentemente pelo número de faixas do comprimento de onda ou se as faixas espectrais são contíguas¹. Para esta aplicação, os dados hiperespectrais são definidos como os dados espectrais adquiridos com as faixas contíguas do comprimento de onda conseguidas pelo afastamento de comprimentos de onda Center não menos do que a metade da largura cheia no meio máximo (FWHM) de cada filtro do bandpass usado para a excitação (isto é, 5 nanômetro espaçamento de comprimento de onda Center para filtros de banda com larguras de banda 14-20 nm). A natureza contígua das bandas de dados permite um excesso de amostragem do conjunto, assegurando que os critérios de Nyquist são satisfeitos ao amostrando o domínio espectral.

A imagem latente Hyperspectral foi desenvolvida por NASA nos 1970s e nos 1980s conjuntamente com o primeiro satélite Landsat^5,6. A coleta de dados de várias bandas espectrais contíguas permitiu a geração de um espectro de radiância de cada pixel. Identificar e definir o espectro de radiância de componentes individuais permitiu não só detectar materiais de superfície por seus espectros característicos, mas também permitiu a remoção de sinais intervenientes, como variações no sinal devido à condições atmosféricas. O conceito de detecção de materiais utilizando seus espectros característicos foi aplicado em sistemas biológicos em 1996 quando Schröck et al. utilizaram combinações de cinco diferentes fluoróforos e seus espectros conhecidos para distinguir os cromossomas rotulados em um processo denominado Karyotyping espectral⁷. Esta técnica foi elaborada em 2000 por Tsurui et al. para a imagem latente da fluorescência de amostras do tecido, usando sete tinturas fluorescentes e a decomposição singular do valor para conseguir a separação espectral de cada pixel em combinações lineares dos espectros na referência na biblioteca⁸. Semelhante a seus homólogos de sensoriamento remoto, a contribuição de cada fluoróforo conhecido pode ser calculada a partir da imagem hiperespectral, dada a priori informações do espectro de cada fluoróforo.

A imagem latente de Hyperspectral foi usada igualmente nas áreas da^{agricultura 9},^{astronomia 10}, biomedicina¹¹, imagem latente química¹², aplicações ambientais¹³, cuidado¹⁴do olho, ciência de alimento¹⁵, ciência forense¹⁶,¹⁷, ciência médica¹⁸, mineralogia¹⁹e vigilância²⁰. Uma limitação chave de sistemas de imagem latente hiperespectrais do microscópio de fluorescência atual é que a tecnologia de imagem latente hiperespectrais padrão isola sinais da fluorescência em bandas estreitas por 1) primeiramente filtrando a luz da excitação para controlar a excitação da amostra, a seguir 2) mais adicional que filtra a luz emitida para separar a emissão da fluorescência em faixas estreitas que podem mais tarde ser separadas matematicamente²¹. Filtrar a iluminação da excitação e a fluorescência emitida reduzem a quantidade de sinal disponível, que abaixa a relação sinal-à-ruído e necessita tempos de aquisição longos. O sinal baixo e os tempos longos da aquisição limitam a aplicabilidade da imagem latente hiperespectrais como uma ferramenta diagnóstica.

Uma modalidade da imagem latente foi desenvolvida que empreuse da imagem latente hiperespectrais mas impulsiona o sinal disponível, reduzindo desse modo o tempo necessário da aquisição^21,22. Esta modalidade nova, chamada imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração, adquire dados espectrais da imagem variando o comprimento de onda da excitação e coletando uma escala larga da luz emitida. Tem sido demonstrado anteriormente que esta técnica produz aumentos de ordem de magnitude na relação sinal/ruído em comparação com as técnicas de digitalização de emissões^21,22. O aumento na relação sinal-ruído é em grande parte devido ao bandpass largo (~ 600 nanômetro) da luz de emissão detectada, quando a especificidade for fornecida filtrando somente a luz da excitação em vez da emissão da fluorescência. Isto permite que toda a luz emitida (para cada comprimento de onda da excitação) alcangue o detetor²¹. Adicionalmente, esta técnica pode ser usada para discriminar a autofluorescência de rótulos exógenos. Além disso, a capacidade de reduzir o tempo de aquisição devido ao aumento do sinal detectável reduz o perigo de fotobranqueamento, bem como permite varreduras espectrais a uma taxa de aquisição que é aceitável para imagens de vídeo espectral.

O objetivo deste protocolo é servir como um guia de aquisição de dados para a microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Além disso, as descrições são incluídas que ajudam a entender o caminho de luz e hardware. Também é descrita a implementação de software de código aberto para um microscópio de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Por fim, são fornecidas descrições sobre como calibrar o sistema para um padrão rastreável pelo NIST, ajustar as configurações de software e hardware para obter resultados precisos e desmisturar o sinal detectado em contribuições de componentes individuais.

Protocolo

1. dispositivo de set-up

1. Fonte luminosa: selecione uma fonte luminosa espectral da largo-faixa com saída de poder superior e colimação elevada (uma lâmpada de arco de 300 W xe foi usada para estes estudos).
2. Obturador (opcional): Adicione um obturador ao caminho óptico para reduzir o fotobranqueamento para imagens de lapso de tempo.
3. Sistema ajustável do filtro: incorpore um conjunto de ajustamento mecânico e um filtro sintonizável da fino-película (TFTF) ajustado para permitir a escala comprimento de onda desejada da excitação (por exemplo, 360-485 nanômetro).
4. Microscópio: Use um microscópio de fluorescência invertido, incluindo uma torre de filtro dichroic motorizado e controlador.
   1. Cubo do filtro da fluorescência: Monte um cubo do filtro da fluorescência da longo-passagem. Para obter melhores resultados, escolha um espelho dicróico e filtro de emissão de passagem longa no mesmo comprimento de onda para obter a separação ideal da excitação da luz de emissão (por exemplo, 495 nm).
   2. Objetivo: usar um objetivo apocromático adequado para garantir o foco uniforme sobre a faixa de comprimento de onda utilizada para o experimento (um objetivo de água de 60x foi utilizado para este estudo).
   3. Estágio automatizado (opcional): Use um estágio automatizado para amostragem rápida de vários campos de visão e/ou campos muito grandes através da costura da imagem. Calibre o palco com o objetivo e a câmera.
5. Câmera: selecione uma câmera apropriada para atingir os requisitos de resolução espacial, sensibilidade e ruído do experimento (este sistema utilizou uma câmera sCMOS de alta sensibilidade).

2. software de aquisição

1. Escolha um pacote de software que permita o controle independente de cada componente de hardware, como o micro-gerente.
   1. Criando o arquivo de configuração: o arquivo de configuração é um conjunto de instrumentos e instruções salvos que o micro-Manager carregará para operar o hardware do sistema. Para criar um arquivo de configuração, clique em ferramentas ≫ assistente de configuração de hardware.
      1. Na etapa 1, clique em criar nova configuração ≫ avançar para continuar. Observe que o usuário pode optar por modificar ou explorar a configuração existente se um já estiver disponível.
      2. Na etapa 2, procure a lista de dispositivos disponíveis para encontrar os dispositivos para controlar através do micro-gerente, tal como o microscópio, a lâmpada, o estágio, o obturador, e a câmera. Quando realçado, clique no Add... para adicionar o dispositivo à lista de dispositivos instalados. Isso abrirá uma nova janela.
         1. Designe o rótulo do dispositivo na caixa rótulo . (por exemplo, câmera sCMOS)
         2. Em valor, selecione a porta com apropriada para cada dispositivo. Isso fará com que uma lista de propriedades do dispositivo apareça na parte inferior da janela.
         3. Deixe as propriedades do dispositivo em suas configurações padrão. Observe que os valores personalizados para cada propriedade de dispositivo podem ser inseridos conforme desejado.
         4. Quando cada dispositivo é adicionado, clique no botão Avançar para continuar para a próxima etapa. Observe que, se todos os dispositivos forem deixados de fora ou precisarem ser alterados, o arquivo de configuração poderá ser modificado posteriormente, conforme descrito na etapa 2.1.1.1.
      3. Na etapa 3, use os menus suspensas para selecionar a câmera padrão, o obturador e o estágio de foco. Se o obturador automático for desejado, clique na caixa de seleção abaixo da lista suspensa do estágio de foco. Se a direção do foco do estágio Z for conhecida, selecione-a na lista suspensa em direções de foco do estágio (avançado). Caso contrário, deixe o padrão como desconhecido.
      4. Na etapa 4, clique duas vezes nas caixas o cabeçalho delay [MS] para definir atrasos associados aos dispositivos automatizados, como atrasos de 100 ms para a lâmpada, estágio e obturador, e um atraso de 250 MS para comandos para o conjunto de ajuste mecânico para dar conta do tempo de comutação mecânica entre os filtros.
      5. Na etapa 5, atribua rótulos para os dispositivos de estado. A configuração para o sistema do microscópio da excitação-exploração usa etiquetas no bloco de filtro para identificar cada cubo do filtro da fluorescência (por exemplo, o estado 0 corresponde à etiqueta brilhante, o cubo vazio do filtro usado durante a imagem latente do brilhante-campo; enquanto Estado 3 corresponde ao rótulo 495 nm e personalizado 495 nm dichroic filtro cubo usado para separar a excitação e emissão de luz em 495 nm). As etiquetas são usadas igualmente no conjunto de ajustamento mecânico para armazenar os comandos de comutação para cada comprimento de onda da excitação (por exemplo, o estado 0 corresponde ao comando de ajustamento do comprimento de onda da excitação de 340 nanômetro para o conjunto de ajustamento mecânico).
      6. Na etapa 6, clique no botão procurar ao lado da caixa arquivo de configuração para escolher um local de salvamento e o nome do arquivo para o arquivo de configuração. Clique em concluir para salvar o arquivo de configuração.
   2. Grupos de inicialização e predefinições: o micro-Manager pode armazenar diferentes grupos dentro de cada arquivo de configuração para ativar ou alterar um subconjunto do hardware. Por exemplo, um grupo de "inicialização do sistema" e uma combinação predefinida armazenarão as configurações padrão, como o tamanho de binning e as taxas de leitura para a câmera.
      1. Crie um grupo (por exemplo, sistema) clicando em + na janela principal da subseção de grupo .
      2. Verificar qualquer uso no grupo? caixas dentro do grupo que exigirá um valor padrão a ser definido (por exemplo, binning na câmera padrão associada).
      3. Crie uma nova predefinição (por exemplo, "Startup") clicando em + na janela principal da subseção preset .
      4. Cada caixa marcada na etapa 2 aparecerá como uma opção predefinida aqui. Escolha um valor padrão a ser carregado para cada caixa marcada.
   3. Grupo e presets para comprimentos de onda de excitação: micro-Manager trata cada comprimento de onda de excitação como seu próprio canal com ele seu próprio comando de comutação de comprimento de onda; Portanto, cada um deve ser salvo como sua própria predefinição.
      1. Criar um novo grupo para conter um conjunto de comprimentos de onda de excitação desejados (por exemplo, "495 nm dichroic")
      2. Verifique o uso em grupo? Box denominado Label correspondente ao dispositivo VF-5.
      3. Crie uma nova predefinição nomeada para cada comprimento de onda de excitação (por exemplo, "340 nm").
      4. Atribua a cada predefinição o nome de propriedade apropriado e o valor predefinido (por exemplo, o nome da propriedade: "Label"; valor predefinido: "340 nm").
   4. Multi-dimensional ferramenta de aquisição: cliqueMulti-D ACQ.perto do canto superior esquerdo da janela do micro-Manager para abrir uma ferramenta personalizável para usar para capturar uma imagem da amostra em cada comprimento de onda de excitação com o clique de um único botão. Existem várias opções de personalização para construir a aquisição exatamente como desejado.
      1. Timepoints (não usados neste exemplo): para estudos sem componente de lapso de tempo, deixe a caixa desmarcada. Se os estudos de lapso de tempo forem desejados, marque esta caixa. Se marcada, insira o número de vezes para executar o restante das configurações de aquisição na caixa número . Defina o tempo entre aquisições sucessivas inserindo a duração na caixa intervalo e escolha a unidade adequada (milissegundos, segundos ou minutos; geralmente segundos).
      2. Múltiplas posições (XY; não utilizadas neste exemplo): para estudos de uma única posição XY, deixe a caixa desmarcada. Se várias posições XY forem desejadas, marque a caixa e clique no botão Editar lista de posição para abrir uma janela separada. Mova o palco para cada local desejado e clique no botão Marcar para salvar essa posição no software. Repita até que todas as posições XY desejadas estejam marcadas. Feche esta janela para continuar.
      3. Z-Stacks (slides; não usado neste exemplo): para estudos de uma única posição Z, deixe a caixa desmarcada. Se forem desejadas várias posições Z, marque a caixa. Mova o palco para a posição Z inicial desejada e clique no botão set ao lado da caixa z-Start . Mova o palco para a posição Z final desejada e clique no botão set ao lado da caixa z-end . Insira o tamanho da etapa desejada (em mícrons) na caixa Z-Step .
      4. Canais: Verifique se a caixa de canais está marcada. Aqui, os canais são os nomes dados aos comprimentos de onda individuais da excitação. Os "canais" disponíveis correspondem aos "grupos" descritos nas etapas 2.1.2 e 2.1.3.
         1. Grupo: clique na lista suspensa para selecionar um grupo do qual escolher os comprimentos de onda de excitação disponíveis (por exemplo, 495 nm dichroic).
         2. Clique na caixa manter obturador aberto para manter o obturador aberto entre aquisições para cada canal. Note que o obturador ainda vai fechar entre sucessivas varreduras espectrais se esta caixa estiver marcada, assumindo que a opção de obturador automático também é selecionada na janela principal.
      5. Clique no botão novo para adicionar canais à lista de aquisições. Tenha em atenção que o botão remover pode ser utilizado para remover quaisquer canais já não desejados e que para cima e para baixo pode ser utilizado para reordenar qualquer canal seleccionado.
         1. Assegure-se de que o uso? CheckBox esteja selecionado para cada comprimento de onda desejado na varredura espectral.
         2. Configuração: clique na lista suspensa em configuração e escolha o primeiro comprimento de onda na faixa espectral desejada (por exemplo, 340 nm).
         3. Exposição: clique duas vezes na caixa exposição e insira o tempo de exposição desejado para o comprimento de onda selecionado (por exemplo, 100 para 100 ms). Consulte a seção 5 ("aquisição de dados") para obter sugestões para selecionar os tempos de exposição apropriados.
         4. Z-offset (não aplicável em uma varredura espectral): Deixe esta caixa em branco (em 0) ao executar uma varredura espectral.
         5. Z-Stack: Assegure-se de que esta caixa esteja marcada para cada comprimento de onda na escala espectral se realizando uma Z-pilha.
         6. Skip fr. (não aplicável em uma varredura espectral): Deixe esta caixa em branco (em 0) ao realizar uma varredura espectral. Note-se que pode ser útil para pular seletivamente quadros no caso em que um ou poucos comprimentos de onda de excitação são significativamente mais poderosos do que outros ou se os comprimentos de onda de excitação individual revelar-se especialmente fototóxico.
         7. Cor: Deixe esta caixa em branco ao realizar uma varredura espectral. Observe que as cores podem ser escolhidas para faixas de comprimento de onda individuais para fins de visualização de dados, mas a cor é inadequada para unmixing espectral subsequente.
         8. Repita estas etapas até que cada comprimento de onda desejado da excitação dentro da escala espectral dada da exploração seja adicionado.
      6. Ordem de aquisição: clique na lista suspensa para escolher em qual ordem as opções acima (2.1.4.1-2.1.4.5) serão executadas. Para varreduras espectrais como a mostrada aqui, a ordem de aquisição é simplesmente Channel. Observe que as opções adicionais aparecem como caixas adicionais são verificadas dentro da ferramenta multi-dimensional Acquisition [pontos de tempo, múltiplas posições (XY) e Z-Stacks (fatias)] e permitem a escolha de qualquer posição ou tempo primeiro, seguido de uma fatia ou Canal.
      7. Autofocus (não usado neste exemplo): se várias posições (XY) estiver selecionada, vários estilos diferentes de autofocusing estão disponíveis. Clique no botão Opções e selecione um método de autofoco na lista suspensa ao lado do botão fechar .
      8. Resumo: revise esta janela para obter um resumo do número de pontos de tempo, posições XY, fatias Z, canais, número total de imagens, memória total, duração da digitalização e ordem de aquisição para garantir que as informações listadas coincida com as configurações de aquisição esperadas.
      9. Salvar imagens: Assegure-se de que esta caixa esteja marcada para salvar os dados coletados por meio da ferramenta multi-dimensional Acquisition.
         1. Clique no... botão ao lado da raiz do diretório para escolher uma raiz de diretório na qual os arquivos serão salvos. Nomeie a raiz do diretório de forma que descreva detalhes relevantes da experiência (por exemplo, células musculares lisas da via aérea GCaMP).
         2. Insira um nome na caixa ao lado de prefixo de nome que descreve a aquisição de imagem atual (por exemplo, FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). É aconselhável criar um prefixo de nome que identifique o campo de visão e o tempo de exposição, bem como outras informações relevantes, como o objeto e o filtro dicróico usado. Observe que a primeira pilha de imagem tirada usando essas configurações será salva com "_ 1" após o prefixo de nome. Qualquer pilha subseqüente tomada com o mesmo diretório raiz e prefixo de nome será salvo com "_ n", no qual "n" é o número de vezes que uma pilha foi tomada com esse nome no diretório.
         3. Clique em separar arquivos de imagem para garantir que a imagem gerada em cada comprimento de onda de excitação seja salva.
      10. Salvar como: clique no botão salvar como... perto do canto superior direito da ferramenta multi-dimensional Acquisition para salvar essas configurações de aquisição para uso futuro fácil. Observe que os prefixos de raiz e nome do diretório também serão salvos.
      11. Adquira: finalmente, clique no adquirir! para começar a adquirir imagens de acordo com as configurações de aquisição escolhidas acima.

3. correção de resposta espectral (opcional):

1. A correção da saída espectral pode ser executada para calibrar a resposta espectral do sistema a um padrão conhecido, tal como uma lâmpada NIST-traceable ou o outro padrão ou instrumento NIST-traceable. Esta etapa é especialmente importante se os resultados são comparados com outros instrumentos de imagem espectral, espectrómetros, ou entre diferentes laboratórios. Este processo foi relatado em detalhe anteriormente^21,23.
   1. Use um espectrómetro calibrado para uma fonte de luz rastreável pelo NIST (como LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) ou outro padrão NIST-traceable para adquirir o poder espectrorradiométrico da iluminação, conforme medido na fase de amostragem. Realize uma correção separada para cada combinação de configuração de fonte de luz, espelho dicróico e objetivo. Use uma esfera de integração acoplada ao espectrómetro para medir exatamente a iluminação do grande-ângulo do objetivo do microscópio.
   2. Use um método de integração, tal como a régua trapezoidal, para integrar os dados spectroradiometric sobre comprimentos de onda iluminados. Uma largura de banda de 40 nm para integração centrada em torno do comprimento de onda Center é suficiente para a maioria dos filtros que têm uma largura de banda nominal entre 14-20 nm de largura total ao meio-máximo (FWHM). O valor integrado representa a intensidade da iluminação espectral em cada faixa do comprimento de onda da excitação.
   3. Plotar a intensidade integrada de cada faixa de comprimento de onda como uma função de comprimento de onda centro de excitação para permitir a visualização do perfil de intensidade de iluminação espectral.
   4. Determine a faixa de comprimento de onda com a menor intensidade integrada.
   5. Normalize o perfil de intensidade da iluminação espectral dividindo a intensidade integrada mais baixa pela intensidade integrada de cada faixa de comprimento de onda para gerar um fator de correção dependente do comprimento de onda.

4. preparação da amostra

1. Prepare uma amostra "em branco" (por exemplo, coloque uma lamínula de vidro na câmara celular e adicione 1 mL de tampão). Esse buffer foi descrito anteriormente²⁴.
2. Prepare uma amostra sem rótulo para determinar qualquer autofluorescência de amostra (por exemplo, coloque uma lamínula de vidro contendo células musculares lisas de vias aéreas sem rótulo^25,26 na câmara celular e adicione 1 ml de tampão).
3. Prepare uma amostra separada e com rótulo único para cada rótulo fluorescente usado no experimento da seguinte maneira:
   1. Adicione a etiqueta mitochondrial diluída ao amortecedor para conseguir uma concentração de 100 nanômetro. Adicione este tampão ao lamela que contem pilhas de músculo lisas da via aérea. Incubar por 20 min a 20-25 ° c. Mova a lamínula para a câmara da célula e adicione 1 mL de tampão. Observe que a concentração ideal de rótulo mitocondrial variará por fatores como fabricante, cor associada e especificidade desejada.
   2. Mova uma lamínula contendo células musculares lisas das vias aéreas transfectadas com a sonda GCaMP²⁷ para a câmara celular e adicione 1 ml de tampão.
4. Prepare uma ou mais amostras experimentais contendo uma mistura das etiquetas fluorescentes desejadas.
   1. Adicionar 1 mL de tampão (concentração de 100 nM de rótulo mitocondrial) a uma lamínula contendo células musculares lisas das vias aéreas transfectadas com a sonda GCaMP e incubar por 20 min a 20-25 ° c. Mova a lamínula para a câmara da célula e adicione 1 mL de tampão.

5. aquisição de dados:

1. Verifique se o divisor de refletores dicróico adequado (por exemplo, cubo de filtro dichroic 495 nm), objetivo (por exemplo, objetivo de água 60x) e câmera (câmera scmos) são selecionados.
2. Carregue a amostra no palco.
3. Clique duas vezes na caixa ao lado de Exposure [MS] e digite "100" para definir o tempo de exposição em 100 ms. Observe que o tempo de exposição pode precisar ser aumentado ou diminuído dependendo da intensidade da fluorescência da amostra.
4. Selecione 475 nm no menu suspenso da janela principal do micro-Manager para visualizar a amostra inicial. Observe que 475 nm pode não ser o comprimento de onda ideal para visualização de amostra ou determinar se a sobresaturação ocorrerá em toda a pilha de imagens.
5. Clique em Live para ver o exemplo.
   1. Clique no botão automático da faixa de visualização de intensidade automática ao lado do histograma na parte inferior da janela para trazer os valores mínimos e máximos para intervalos visuais significativos.
6. Use os botões de foco do microscópio para focar na amostra. Muitas vezes é útil encontrar a borda da amostra para ajudar na focagem. O exemplo será focado quando os recursos de aresta na imagem pareceram nítidos. Note que pode ser necessário clicar no botão automático várias vezes durante a focagem para ajudar na visualização da imagem de fluorescência. Além disso, alguns usuários podem achar mais fácil se concentrar na amostra se o microscópio estiver no modo de transmissão.
   1. Se se concentrar no modo de transmissão, para a segurança, primeiro assegure-se de que a fonte luminosa espectral não esteja transmitindo a luz às oculares antes de ajustar o trajeto claro para a imagem latente da transmissão. Observe também que pode haver pequenos desvios entre o foco das imagens de transmissão e fluorescência. Quando o foco aceitável foi conseguido, reconfigure o trajeto claro para a imagem latente espectral da fluorescência.
7. Clique no ACQ multi-D. próximo à parte superior esquerda da janela para abrir a ferramenta multi-dimensional Acquisition (descrita e configurada na seção 2).
8. Escolha um intervalo espectral apropriado para aquisição espectral (por exemplo, 360-485 nm para o filtro dichroic 495 nm) clicando no botão Load... no canto superior direito da janela da ferramenta multi-dimensional Acquisition e navegando até as configurações de excitação salvos anteriormente (na etapa 2.1.4.10). Veja a discussão para a informação a respeito das escalas espectrais apropriadas.
9. Adquira um fundo/imagem em branco que não contenha dados de fluorescência a serem usado para a subtração de fundo e ruído. Isso pode ser executado usando um exemplo em branco (etapa 4,1) ou navegando para uma região em branco de uma amostra experimental. Conforme descrito na etapa 5,6, isso é mais facilmente conseguido encontrando a borda da amostra, em seguida, posicionando-a para que a aresta seja centralizada dentro do campo de visão.
   1. Uma vez que as configurações de aquisição são confirmadas e uma região de fundo é visível, clique no botão adquirir! para adquirir uma pilha de imagens espectrais contendo fundo e ruído para usar para subtração mais tarde. Deve notar-se que as amostras são susceptíveis de ter fluorescência mais intensa longe da borda da amostra. Pode ser aconselhável mover-se sobre a amostra para encontrar as regiões "mais brilhantes" e executar várias pilhas de imagens de teste para determinar os tempos de aquisição apropriados e evitar a superexposição.
10. Pegue uma única pilha de imagem em uma região da amostra que parece ter fluorescência intensa para garantir que nenhuma combinação de comprimentos de onda e que os tempos de exposição resultam em superexposição.
11. Use o ImageJ para confirmar que nenhum comprimento de onda contenha pixels superexpostos.
    1. No ImageJ, clique em arquivo ≫ importar ≫ sequência de imagem e navegue até a pasta que contém as imagens espectrais tiradas na etapa 5,10. Isso abrirá uma nova janela. Clique na caixa ao lado do número de imagens e insira o número de comprimentos de onda incluídos na varredura espectral (por exemplo, 26). Deixar a imagem inicial e incrementar como "1". Clique no botão OK para continuar.
    2. Pressione M no teclado para utilizar a função de medida do ImageJ. Assegure-se de que o número listado em máx não seja o limite de detecção superior da câmera (por exemplo, 65.535). Repita para cada imagem na varredura espectral. Observe que o limite de detecção da câmera depende da própria câmera. O limite superior é exibido na parte superior direita do histograma na janela principal do MicroManager. Alternativamente, o limite superior pode ser determinado abrindo uma imagem no ImageJ e navegando até image ≫ ajustar ≫ brilho/contraste. Clique no botão definir na janela pop-up resultante, insira um valor excessivamente grande (por exemplo, 999.999) no espaço em branco ao lado do valor máximo exibidoe clique em OK para continuar. O valor máximo exibido no novo histograma deve ser o limite de detecção superior da câmera.
    3. Se todas as imagens continham o limite superior de detecção da câmera (por exemplo, 65.535), ajuste o tempo de exposição da varredura espectral para garantir que o sinal máximo em toda a faixa espectral não exceda o alcance dinâmico da câmera.
12. Adquira dados de imagens espectrais de amostras não rotuladas para determinar qualquer autofluorescência. Adquira a verificação para as amostras sem rótulo usando uma faixa de comprimento de onda idêntica e as configurações da câmera como o restante do experimento (por exemplo, 360-485 nm em 100 ms por comprimento de onda).
13. Adquira dados de imagens espectrais de amostras com rótulo único para usar como controles espectrais para construir a biblioteca espectral. Realize a verificação para cada etiqueta usando uma faixa de comprimento de onda idêntica, tempo de exposição e configurações da câmera. Note que um tempo de aquisição mais longo pode ser necessário para algumas amostras para permitir a deteção exata do espectro da etiqueta com contribuição mínima do ruído.
14. Realize medições em uma amostra experimental (por exemplo, células musculares lisas das vias aéreas humanas com sonda GCaMP e rótulo mitocondrial).
    1. Coloque um slide ou uma lamínula contendo a amostra experimental no microscópio.
    2. Selecione um campo de visão com células de tecidos apropriadamente rotuladas.
    3. Adquira os dados da imagem espectral usando as configurações de aquisição desejadas, conforme descrito acima.

6. análise de imagem

1. Corrija as imagens para uma resposta espectral plana.
   1. Subtrair o espectro de fundo obtido na seção 5,9 e multiplicar pelo coeficiente de correção determinado na seção 3.1.5. Isso pode ser feito com um script MATLAB simples ou uma rotina ImageJ. Um código MATLAB de subtração/correção (usado neste exemplo) está disponível no site da University of South Alabama BioImaging Resources.
      1. Carregue o código de subtração/correção no MATLAB.
      2. Na guia EDITOR, clique em executar. Isso abrirá uma nova janela contendo um botão de correção BSQ . Clique no botão correção de BSQ para abrir outra janela que contenha opções para o diretório de trabalho, arquivo de fundo, arquivo de fator de correção e pasta TIFF não corrigida.
         1. Use o Browse... botão ao lado de diretório de trabalho para escolher o caminho do arquivo onde as janelas subseqüentes serão abertas. Navegue até a pasta que contém o espectro de plano de fundo salvo (no formato. dat).
         2. Use o Browse... botão ao lado de arquivo de fundo (. dat) para abrir o diretório escolhido na etapa 6.1.1.2.1 e escolher o arquivo de fundo desejado (no formato. dat). Clique no botão abrir para continuar.
         3. Use o botão Browse... ao lado de fator de correção (. dat) para escolher um fator de correção. O diretório para o fator de correção assume como padrão o local do código MATLAB pai. Se necessário, navegue até a subpasta que contém o arquivo de fator de correção (no formato. dat). Realce o arquivo de fator de correção adequado e clique no botão abrir para continuar.
         4. Use o botão Browse... ao lado da pasta TIFF não corrigida para abrir o diretório escolhido na etapa 6.1.1.2.1 e escolha a pasta para a subtração de fundo e correção de imagem (esta é geralmente a pasta Pos0 que contém imediatamente o RAW imagens espectrais). Clique no botão abrir para continuar.
         5. Clique no botão clique para correção espectral . Após a conclusão do processamento, uma janela será aberta com a mensagem "BSQ Correction Complete". Clique no botão OK para continuar. As imagens de correção são armazenadas em uma nova pasta com o nome da pasta de imagens espectrais RAW original e um adicional "_ corrigido" (por exemplo, Pos0_Corrected).
2. Gere a biblioteca espectral. Vários pacotes de software podem ser usados para extrair dados espectrais de imagens, incluindo o ImageJ. Para obter melhores resultados, normalizar cada EndMember para a faixa de comprimento de onda de maior intensidade, determinando qual faixa de comprimento de onda tem o valor mais intenso e dividindo a medição em cada faixa de comprimento de onda por esse valor máximo. Também deve ser notado que os controles de rótulo único gerados dentro de amostras autofluorescentes precisarão de modificações adicionais^{28,29,30,31,32}. Consulte a etapa 6.2.4 e discussão para obter detalhes.
   1. No ImageJ, clique em arquivo ≫ importar ≫ sequência de imagens. Isso abrirá uma nova janela. Navegue até a pasta que contém as imagens espectrais corrigidas. Clique duas vezes em qualquer arquivo de imagem na pasta para abrir uma nova janela. Clique na caixa ao lado do número de imagens e insira o número de comprimentos de onda incluídos na varredura espectral (por exemplo, 26). Deixe a imagem inicial e incrementar como "1". Clique no botão OK para continuar.
   2. Na janela principal do ImageJ, clique no ícone de seleções de polígono e, em seguida, use o ponteiro do mouse clicando na imagem para criar um polígono ao redor de uma região que contenha dados de fluorescência. Note que pode haver pouco ou nenhum dados de fluorescência no comprimento de onda inicial. Navegue até outra imagem de comprimento de onda e/ou use a ferramenta de brilho/contraste (imagem ≫ ajustar ≫ brilho/contraste ≫ auto) para visualizar melhor as regiões que contêm dados de fluorescência de interesse.
   3. Com o polígono desenhado, gere o perfil do eixo Z clicando em imagem ≫ Stacks ≫ traçar o perfil do eixo z. Isso abrirá uma nova janela. Clique em salvar para salvar os dados espectrais como um arquivo. csv.
   4. Realize uma subtração para garantir uma biblioteca espectral adequada com rótulos puros desprovidos de contaminação por autofluorescência. Use a seguinte equação²⁹ para isolar um espectro puro da mistura de um único rótulo e fluorescência:
      1
      Onde: s_puro é o espectro puro da etiqueta, s_misturado é o espectro medido da amostra contaminada com autofluorescência, s _autofl é o espectro de autofluorescência medido, "a" é um escalar multiplicador do espectro de autofluorescência (entre 0 e 1; por exemplo, 0,4), e "offset" é um offset (geralmente 0). Varie o termo "a" até que um valor próximo de zero seja atingido para a contribuição aparente da autofluorescência. Informações adicionais podem ser encontradas em várias publicações^{28, 29,30,31,32}.
3. Desmisture os dados da imagem espectral. A etapa de separação gerará uma imagem da abundância para cada etiqueta fluorescente, onde a abundância é a quantidade de sinal relativo da fluorescência na imagem da etiqueta respectiva. Vários algoritmos de separação estão disponíveis para uso com ImageJ^33,34,35. Além disso, um código MATLAB de separação espectral (usado neste exemplo) está disponível no site da University of South Alabama BioImaging Resources. Uma visão geral mais abrangente de separação espectral está disponível³⁶.
   1. Carregue o código de separação espectral no MATLAB.
   2. Edite os arquivos de comprimento de onda. Mat e library. Mat para corresponder às condições experimentais (por exemplo, "comprimento de onda" como 360-485 em incrementos de cinco).
      Nota: os valores correspondentes para esses comprimentos de onda devem ser carregados em "biblioteca" para cada rótulo fluorescente (e autofluorescência). Endmember_Name deve listar os rótulos na mesma ordem que os valores de coluna de "biblioteca". Observe que o arquivo library. Mat deve conter as variáveis "library" e "Endmember_Name".
   3. Na guia EDITOR, clique em executar. Isso abrirá uma nova janela permitindo que o usuário escolha um diretório. Navegue até a pasta que contém as imagens espectrais para ser Unmixed. Uma vez selecionado, isso abrirá uma nova janela.
   4. Nos espaços em branco resultantes, insira o nome da imagem (por exemplo, HASMC com GCaMP e mito FOV1), número de faixas de comprimento de onda (por exemplo, 26), número de pontos temporais (por exemplo, 1) e se uma medida FRET é desejada (por exemplo, n) em seus respectivos espaços em branco. Se "n" for selecionado para FRET, deixe ambos os espaços em branco do membro final vazios. Pressione OK para continuar, que abrirá uma nova janela.
   5. Naviagate para a pasta que contém o arquivo de comprimento de onda. Mat. Uma vez selecionado, clique em abrir para continuar, que abrirá uma nova janela.
   6. Navegue até a pasta que contém o arquivo library. Mat. Uma vez selecionado, clique em abrir para continuar, que salvará as imagens não misturadas em uma nova pasta "Unmixed" dentro do diretório que contém as imagens espectrais.
4. Inspecione as imagens espectrais não misturadas para a qualidade.
   1. Abra cada imagem não misturada para inspecionar visualmente a distribuição de componentes puros.
      1. Compare a magnitude da imagem de erro com as imagens não misturadas (semelhante à etapa 5,11, isso pode ser feito através da função Measure do ImageJ). Se a magnitude da imagem de erro for semelhante em magnitude às imagens de abundância não misturadas, é provável que existam sinais nos dados de imagem espectral que não são contabilizados com precisão pela biblioteca espectral e pelo processo de separação espectral linear.
      2. Compare a imagem de erro com as imagens não misturadas para ver se existem estruturas residuais não identificadas.

Resultados

Várias etapas importantes deste protocolo são necessárias para garantir a coleta de dados que são precisos e desprovidos de imagens e artefatos espectrais. Pular essas etapas pode resultar em dados que parecem significativos, mas não podem ser verificados ou reproduzidos com qualquer outro sistema de imagens espectrais, anulando assim efetivamente quaisquer conclusões feitas com esses dados. O chefe entre estas etapas importantes é a correção de saída espectral adequada (seção 3). O fator...

Discussão

O uso ideal de uma configuração de imagem hiperespectral de excitação-digitalização começa com a construção do caminho de luz. Em particular, a escolha da fonte luminosa, dos filtros (ajustáveis e dichroic), do método do interruptor do filtro, e da câmera determina a escala espectral disponível, a velocidade possível da varredura, a sensibilidade do detector, e a amostragem espacial. As lâmpadas de arco de mercúrio oferecem muitos picos de comprimento de onda de excitação, mas não fornecem uma saída espectral plana e exi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células de músculo liso das vias aéreas	Disease Research Interchange (NDRI)	Isolado de tecidos pulmonares humanos obtidos de NDRI	Células altamente autofluorescentes e sensíveis ao cálcio
Obturador automatizado	Thorlabs Inc.	SHB1	Obturador controlável remotamente para minimizar o fotobranqueamento
Estágio Automatizado	Prévio Científico	H177P1T4	Estágio controlável remotamente para campo de visão múltiplo automatizado ou coleta de imagens costuradas.
Controlador de Platina Automatizado (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	Para interface de platina automatizada com computador e joystick
Tampão	Fabricado internamente		145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glicose, 1 mM MgCl2 e 1mM CaCl2, em pH 7,3
Câmara Celular	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Suporte de lamínula composto de aço inoxidável cirúrgico e um O-ring de borracha para vedar o meio e evitar a contaminação da amostra e/ou objetiva
Filtros de excitação	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Faixa de comprimento de onda central (340-378 nm), Largura de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refração (1,88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Faixa de comprimento de onda central (360-400 nm), Largura de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refração (1,8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Faixa de comprimento de onda central (400-448,8 nm), Largura de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refração (1,8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Faixa de comprimento de onda central (448,8-501,5 nm), Largura de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refração (1,84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Faixa de comprimento de onda central (501,5-561 nm), Largura de banda (Mínimo 14 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refração (1,83)
Filtro de fluorescência Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separa a excitação e a luz de emissão a 495 nm (>98% de reflexão entre 350-488 nm, >93% de transmissão entre 502-950 nm), Índice efetivo do filtro (1,78)
Filtro de fluorescência Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Permite a passagem de luz por mais de 496 nm (>93% de transmissão média entre 503,2-1100 nm), Índice de refração (1,86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmídeo #22692	Um indicador de cálcio geneticamente codificado baseado em GCaMP2 de comprimento de onda único
Integrando a Esfera	Ocean Optics	FOIS-1	Usado para medição precisa da iluminação de grande angular
Microscópio de Fluorescência Invertida	Nikon Instruments	TE2000	Os microscópios invertidos permitem a excitação direta da amostra sem a necessidade de penetrar em camadas de mídia e/ou tecido.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Etiquetas mitocôndrias
Lâmpada de calibração rastreável	NIST Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	Uma lâmpada com um espectro conhecido para uso como padrão
Fluoresceína rastreável NIST	ThermoFisher Scientific	F36915	Para verificar a resposta espectral apropriada do sistema
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Rótulas de núcleos celulares
Objetiva (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Útil para grandes campos de visão
Objetiva (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Mais frequentemente utilizado para amostras de tecido
Objetiva (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Mais frequentemente usado para amostras de células
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	Para adquirir imagens digitais de alta sensibilidade
Espectrômetro	Ocean	Optics QE65000	Usado para medir a saída espectral do sistema espectral de varredura de excitação
Trocador de filtro sintonizável	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Unidade motorizada para ajuste automatizado do filtro de excitação/ fonte
luminosa do titã 300HP	de arco de xénon	Fonte luminosa de Sunoptic Technologies com saída espectral relativamente uniforme