Artigo de método

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

DOI:

10.3791/59452

⸱

10 de julho de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Cardiovascular Diseases, School of Medicine, School of Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Cardiac Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.

Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.

Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.

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Protocolo

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Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23).

1. preparação de meios de cultura e placas de cultura

  1. Preparação média
    1. Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (tabela de materiais 1) e 100 ml de suplemento HPSC 5x; armazenar a mistura a 4 ° c.
    2. Para RPMI 1640/B27 menos insulina (RB-) médio, misture 500 mL de RPMI 1640 e 10 mL de suplemento B27 menos insulina.
    3. Para o meio RPMI 1640/B27 (RB +), misture 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27 e 5 mL de antibiótico de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
    4. Para o meio de purificação16, misture 500 ml de no-glucose rpmi 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico Pen-Strep e 1.000 μl de solução de DL-lactato de sódio (a uma concentração final de 4 mm).
    5. Para solução de neutralização, misture 200 mL de RPMI 1640, 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 2,5 mL de antibiótico Pen-Strep e 50 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
    6. Para o meio de congelação, misture 9 mL de FBS, 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) e 10 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
    7. Para a solução de matriz extracelular (EMS), descongelar a matriz extracelular concentrada (tabela de materiais 1) a 4 ° c até atingir um estado líquido uniformemente consistente. Precool pontas de pipeta e tubos antes de fazer alíquotas de matriz de 350 μL cada um no gelo, e armazenar as alíquotas em-20 ° c. Antes de revestir as chapas, diluir uma alíquota descongelada em 24 mL de meio DMEM/F12 frio-gelado (EMS); Mantenha o EMS em 4 ° c por até 2 semanas.
      Nota: Execute todas as etapas do revestimento no gelo para impedir a solidificação da matriz da membrana do porão.
    8. Para a solução de Tyrode, tome 90% do volume final exigido da água da classe da cultura do tecido, adicione a quantidade apropriada dos seguintes reagentes, e mexa até dissolver. Em seguida, use 1 N NaOH para ajustar o pH para 7,4. Adicione água extra a uma concentração final de 140 mmol/L de cloreto de sódio, 1 mmol/L de cloreto de magnésio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de cloreto de potássio, 10 mmol/L de glicose, e 1,8 mmol/L cloreto de cálcio. Esterilizar por filtração, usando uma membrana de 0,22 μm.
  2. Revestimento da placa da cultura de pilha
    1. Para placas de cultura hiPSC, aplique 1 mL de EMS a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa por pelo menos 1 h a 37 ° c. Aspirar a solução DMEM/F12 antes de semear as células.
    2. Para o revestimento de gelatina, dissolva 0,2 g de pó de gelatina em água de grau de cultura de tecidos para fazer uma solução de 0,2% (w/v). Esterilizar por autoclavagem a 121 ° c, 15 psi por 30 min. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 2 mL da solução e incubar por 1 h a 37 ° c. Antes de de as pilhas, aspirar a solução e permitir que a placa seque por pelo menos 1 h na temperatura ambiente dentro da capa da cultura do tecido.

2. manutenção hiPSC e Ddiferenciação de cardiomiócitos

  1. Cultura os hiPSCs no meio hiPSC (ver passo 1.1.1) com uma mudança média diária até que as células atinjam 80% – 90% de confluência por poço.
    Nota: Para fins de manutenção, os hiPSCs estão geralmente prontos para a passagem a cada 4 dias.
  2. Para a passagem de hiPSCs, aspirar o meio e lavar o poço 1x com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Adicionar 0,5 mL de solução de descolamento de células estaminais (tabela de materiais 1) a cada poço e incubar a 37 ° c durante 5 – 7 min.
    Nota: O tempo de incubação depende da densidade das células e da taxa de dissociação, que pode ser observada um microscópio.
  3. Neutralize a solução de descolamento de células-tronco com 1 mL de meio hiPSC suplementado com 5 μM Y-27632. Colete a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue o tubo durante 5 min a 200 x g, Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e, em seguida, ressuscitem as células em 1 ml de meio hipsc contendo 5 μm Y-27632.
  4. Semente os hiPSCs em um novo EMS-revestido 6-placa bem em uma relação entre 1:6 a 1:18. Mude o meio ao meio do hiPSC sem Y27632 após 24 h.
  5. Para congelar as células, Ressuspender os hiPSCs dissociados em meio de congelamento em uma concentração de 0,5 – 1 milhão/500 μL, colocar a suspensão em cryovials e armazená-los em um freezer de-80 ° c. Transferir os frascos congelados para nitrogênio líquido após 24 h.
  6. Para diferenciar, substitua o meio hiPSC por 2 mL de RB-meio suplementado com 10 μM de inibidor GSK-3β CHIR99021 (CHIR) em 80% – 90% de confluência celular. Substitua o meio por 3 mL de RB-meio após 24 h e incubar por um adicional de 48 h (dia 3).
  7. No dia 3, mude o meio para 3 mL de RB-meio com 10 μM de inibidor de WNT IWR1 para 48 h (dia 5) e, em seguida, substitua o meio com 3 mL de RB-médio e mantenha por 48 h (dia 7).
  8. No dia 7, substitua o meio com 3 mL de meio RB e mude o meio a cada 3 dias daqui para frente. A batida espontânea de hiPSC-CMs deve ser observada entre os dias 7 – 10.

3. hiPSC-CMs purificação e pequena molécula pre-tratamento

Nota: Enzimas de dissociação de células recombinantes altamente purificadas (tabela de materiais 1) foram utilizadas para dissociar o hipsc-CMS.

  1. No dia 21 após a diferenciação hiPSC-CM, aspirar o meio e lavar as células 1x com PBS estéril. Incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação celular por poço por 5 – 7 min a 37 ° c. Pipeta repetidamente a suspensão da pilha usando uma pipeta de 1 mL a fim dissociar completamente as pilhas.
  2. Depois que as células são dissociadas, adicione 1 mL de solução de neutralização a cada poço, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 3 min. descarte o sobrenadante e resuma as células na solução neutralizadora.
  3. Replantar as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 2 milhões células por poço.
  4. Após 24 – 48 h, substitua o meio de cultura por meio de purificação por 3 – 5 dias.
    Nota: A purificação está completa quando mais de 90% das células em cada campo de visão do microscópio estão batendo. Para evitar mais danos aos cardiomiócitos, não prolongue a duração da purificação além de 5 dias. Se a primeira rodada não produzir a pureza necessária, substitua o meio de purificação por meio de RB + por 1 dia e, em seguida, conclua uma segunda rodada de purificação.
  5. Antes da transplantação, a cultura as pilhas no grupo do tratamento para 12 h no meio do RB + suplementou com 10 μM Y-27632. Da mesma forma, realizar o tratamento com Verapamil nas células do meio RB + com 1 μM de Verapamil para 12 h (hiPSC-CMs+ Ver).
  6. Após o tratamento, lave o hiPSC-CMs 1x com PBS e incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por poço para um máximo de 2 min. Pipetar repetidamente a suspensão da célula, utilizando uma pipeta de 1 mL, para separar completamente as células. Neutralize as células com solução neutralizante, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g durante 3 min. ressuscitem as células em PBS em uma concentração de 100.000 células/5 μL em preparação para injeção.

4. infarto do miocárdio e transplante de células

Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos são saco com autoclave e são mantidos na condição asséptica durante cirurgias múltiplas através de um esterilizador quente do grânulo (tabela dos materiais 2).

  1. Anestesiar camundongos NOD/scid (tabela de materiais 2) com isoflurano inalatório (1,5% – 2%). Monitore os níveis de anestesia pelas respostas dos camundongos a uma pitada de dedo do pé. Coloque o veterinário pomada óptica sobre os olhos para impedi-los de secar durante a cirurgia.
  2. Forneça 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para o manejo da dor antes da cirurgia.
  3. Posicione e prenda o rato em uma posição supina em uma tabela de funcionamento aquecida, remova o cabelo da região ventral da garganta e do tórax esquerdo usando um creme depilatórios, exponha a pele, e desinfecte-o com álcool de 70%.
  4. Corte uma incisão de 0,5 cm no centro do pescoço usando tesouras cirúrgicas, separe a gordura subcutânea com fórceps estéril e exponha a traquéia. Introduzir oralmente a cânula de intubação na traquéia, conectar a cânula a um pequeno ventilador animal e ajustar as configurações de ventilação (ajustar o volume corrente a 100 – 150 μL e a taxa de respiração a 100x – 150x por minuto).
  5. Depois que o mouse se estabiliza, corte uma incisão de 0,5 cm no meio da pele do tórax esquerdo. Use fórceps para separar sem rodeios a camada muscular e fazer uma pequena incisão no quinto espaço intercostal para expor a cavidade torácica. Coloque o retractor na incisão para abrir a cavidade torácica e localize a artéria coronária descendente esquerda (LAD). um microscópio cirúrgico de dissecação, ligadura o Lad com um 8-0 sutura não absorvível.
  6. Imediatamente após a indução da MI, injete 5 μL de hiPSC-CMs-ri, hipsc-CMS+ ri, hipsc-CMS-Ver, hipsc-CMS+ Ver, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local (3 x 105 células/animal, 1 x 105 células/local), um na área do enfarte e dois nas áreas em torno do enfarte.
    Nota: Desde que 5 μL é volume muito pequeno, não é fácil controlar exatamente o volume sugando-o diretamente com uma seringa. A tampa de um prato de Petri estéril pode ser girado sobre, e 5 μL das pilhas podem primeiramente ser depositados na tampa com uma pipeta. Devido à tensão de superfície, não se espalhará mas condensar-se-á em uma massa líquida pequena. Isso pode ser facilmente absorvido e injetado no miocárdio do mouse.
  7. Elimine o ar residual na cavidade torácica enchendo-o acima com a solução salina isotônica morna. Costurar as costelas, os músculos e a pele em sequência com uma sutura 6-0 absorvível. Desligue a injeção da anestesia do isoflurano. Mantenha os animais da cirurgia na almofada de aquecimento e observá-los pròxima Quando recuperarem a consciência cheia. Em seguida, coloque os animais em uma gaiola limpa. Não devolva os animais à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
  8. Após a cirurgia, injete os camundongos intraperitonealmente com buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h durante 3 dias consecutivos e injete-os com ibuprofeno (5 mg/kg) a cada 12 h por um dia. Realize estudos de análise subsequentes em pontos de tempo especificados.
    Nota: Siga as diretrizes do Comitê de cuidados com animais locais para analgesia.

5. registro transiente do cálcio e da contractilidade

  1. Autoclave de 15 mm de diâmetro (tabela de materiais 2) e pinças em uma taça de vidro pequeno a 121 ° c, 15 psi por 15 min. precool as lamínulas e pinças a 4 ° c.
  2. Usando a pinça, coloque a lamínula em uma placa de 12 poços e pipetar 300 μL de matriz extracelular para cada lamínula.
    Nota: Não deixe que a matriz exceda a borda da lamínula para evitar a redução da quantidade de revestimento da matriz. Incubar a placa de 12 poços em uma incubadora da cultura de célula de 37 ° c por 1 h.
  3. Aspirar o meio na placa gelatina-revestida de 6 poços com hiPSC-CMs purificado, lave-a 1x com PBS e, em seguida, digerir com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por 1,5 min. Adicione 1 mL de solução de neutralização, pipetar repetidamente para não mais do que 5x – 10x com uma pipeta de 1 mL e centrifugue a mistura a 200 x g durante 3 min.
  4. Aspirar a matriz extracelular revestida dos lamínulas. Conte o número da célula e ressuscitem as células na solução de neutralização para uma concentração de 40000/300 μL e, em seguida, adicione 300 μL da suspensão da célula em cada lamínula. Cultura da placa em uma incubadora de 37 ° c.
  5. Após 24 h, aspire suavemente a solução neutralizada, adicione 500 μL de meio RB + a cada poço da placa e continue a cultura por 2 dias.
  6. Adicionar Y-27632 (10 μM), ativador Rho quinase (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs, 12 h antes de detecção de transiente e contratilidade de cálcio.
    Nota: Além da detecção de transientes e contratilidade de cálcio das células após 12 h de tratamento químico, a detecção desses parâmetros também foi testada em 12, 24, 48 e 72 h após a retirada química.
  7. Retire a placa, descarte o meio, e lave a placa 1x com PBS. Mude o meio a um DMEM fenol-vermelho-livre que contem 0, 2% (w/v) do poliol do surfactante (tabela dos materiais 1), do indicador do cálcio de 5 μm (tabela dos materiais 1), e do Y-27632 correspondente (10 μm), ra (100 nanômetro), verapamil (1 μm), ou um volume igual de PBS, e incubar a placa por 30 min a 37 ° c.
  8. Descarte o sobrenadante, lave as células 3x com meio DMEM livre de corante e deixe o meio descansar por 30 min para desesterificar o corante de mapeamento.
  9. Coloc o lamela pilha-semeado em uma câmara aberta do banho e insira a câmara em um sistema da microincubação equilibrado a 37 ° c com um controlador de temperatura automático (tabela dos materiais 2), perfuse-o com a solução de Tyrode, e adicione continuamente Inibidor da Rho-quinase (RI), ar ou PBS à solução de perfusão.
  10. Use um microscópio de fluorescência invertido (tabela de materiais 2) e uma cabeça da exploraçãodo laser (tabela dos materiais 2) para gravar o transiente espontâneo do cálcio empregando uma varredura da linha de x-t, usando um laser do argão de 488 nanômetro para a excitação da tintura e um 515 ± 10 nanômetro filtro de barreira para coletar luz de emissão. Registre a contração espontânea de hiPSC-CMs usando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal (tabela de materiais 2).
    Nota: As gravações transientes de cálcio foram processadas e analisadas com o uso do software MATLAB R2016A (tabela de materiais 4). Os ensaios de mudança de contração celular foram realizados utilizando-se o software ImageJ (tabela de materiais 4).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)17 (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram classific como o ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.

As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de dissociação ce...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
Accutase (solução de descolamento de células-tronco)STEMCELL Technologies#07920
B27 menos insulinaFisher ScientificA1895601
B27 SuplementoFisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM (1x), glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenolThermofisher20163029
Soro fetal bovinoAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (indicador de cálcio)Invitrogen/ThermofisherF14201
RPMI sem glicose 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel (matriz extracelular)Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR (meio de células-tronco pluripotentes humanas)STEMCELL Technologies85850
Antibiótico Pen-strepFisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127 (poliol surfactante)Sigma-AldrichP2443
Rho ativador IICitoesqueletoCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
DL-lactato de sódioSigma-AldrichL4263
TrypLE (enzimas de dissociação celular)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Equipamentos e Suprimentos
IVIS Lumina III Bioluminescence InstrumentsPerkinElmerCLS136334
15 mm CoverslipsWarnerCS-15R15
CentrífugaEppendorf5415R
Microscópio ConfocalOlympusIX81
CryostatThermo ScientificNX50
Controlador de Temperatura Automático Duplo WarnerInstrumentsTC-344B
Fonte de Alimentação de EletroforeseBIO-RAD1645050
Microscópio de FluorescênciaOlympusCâmera de alta velocidade IX83
pco1200 s
Cabeça de varredura a laserOlympusFV-1000
Câmara de banho aberta de baixo perfil (monta no sistema de microincubação acima)Warner InstrumentsRC-42LP
Sistema de MicroincubaçãoWarner InstrumentsDH-40iL
Minivent Mouse VentiladorHarvard Aparelho845
camundongos NOD/SCIDJackson Laboratory001303
Géis de proteína pré-moldadosBIO-RAD4561033
Pacotes de transferência de PVDFBIO-RAD SistemaTrans-Blot 1704156
BIO-RADTrans-Blot Turbo
Esterilizador de esferas quentesFerramentas de ciência fina18000-45
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo
Nucleolina anti-humana (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Troponina cardíaca TR& D SystemsMAB1874
Troponina Cardíaca CAbcamab137130
Troponina Cardíaca IAbcamab47003
Cy5-burro anti-ratoJackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-burro anti-coelhoJackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-burro anti-ratoJackson IntegrinaAbcam ab91605 do laboratório 715-095-150
Abcamab22555
1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-caderinaAbcamab18203
Cadeia Leve de Fosfo-Miosina 2Tecnologia de Sinalização de Células3671s
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g
cardíaca humana Abcam ab91605 da troponina cardíaca humana de ImmunoResearch;

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
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