Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.
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Artigo de método
Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.
Introdução
As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocondrial pode afetar qualquer órgão do corpo em qualquer idade e é uma das principais causas metabólicas, relacionadas ao envelhecimento6, e doenças neurodegenerativas7. Mitocôndrias intactas estão mecanicamente relacionadas à função mitocondrial. Assim, quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial8. A sintetização de citrato, uma enzima limitante da taxa na primeira etapa do ciclo do ácido tricarboxílico9,é localizada na matriz mitocondrial dentro das células eucarióticas e, portanto, pode ser usada como um marcador quantitativo para a presença de massa mitocondrial intacta9,10. A atividade de sintese de citrato também pode ser usada como um fator de normalização para proteínas mitocondriais intactas11,12.
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster,é um excelente sistema modelo para estudar a função mitocondrial, como muitas moléculas e vias que desempenham papéis fundamentais na mitocôndria são evolutivamente conservados de Drosophila para os seres humanos13,14,15. Aqui, apresentamos um protocolo para um método rápido e simples para a medição da atividade de sinteta de citrato por um ensaio colorimétrico no tecido Drosophila homogeneia16 em um formato de placa de 96 poços. No ensaio de atividade de citrato synthase, citrato synthase no tecido Drosophila homogeneizar catalisa a reação de oxaloacetate com coenzima acetil A (acetil CoA) para formar o citrato CoA-SH e H+. O CoA-SH reage posteriormente com 5,5'-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para gerar um produto colorido, 2-nitro-5-thiobenzoato (TNB), que pode ser facilmente medido espectrofotomicamente a 412 nm. A atividade de sintetizador de citrato pode ser refletida pela taxa de produção de cores.
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Protocolo
1. Ensaio de atividade de citrato de citrato colorimtricpara D. melanogaster16
- Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras de triplicado para cada genótipo.
- Prepare 500 μL de tampão de extração de gelo-frio contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.
- Anestesia adulto voa com CO2 em uma almofada de anestesia e isolar os tecidos desejados. Para isolar os thoraxes adultos da mosca, por exemplo, repara os thoraxes da mosca por um par de fórceps, e isola então os abdômens da mosca cortando ao longo da beira do tórax e do abdômen usando um par de tesouras. Recolher os thoraxes voar para o ensaio de atividade synthase citrato muscular.
NOTA: Determine o peso fresco do tecido nesta etapa se usá-lo para normalizar a atividade do synthase da citrata. - Transfira 10 thoraxes de mosca adulto para 100 μL de tampão de extração de gelo-frio imediatamente e homogeneize com um pilão no gelo. Para manter as amostras geladas, homogeneize as amostras para 5-10 s no gelo, em seguida, ter as amostras sentar no gelo por 5 s, e repita até que todos os tecidos do tubo são homogeneizados completamente.
NOTA: Fita do tubo, verifique as homogeneizações para se certificar de que não há coágulos nas homogeneizações e que os tecidos no tubo são homogeneizados completamente. Todos os tratamentos de amostra devem ser realizados no gelo. - Tome 10 μL de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de conteúdo proteico. Mantenha as amostras para medição de proteínano gelo.
NOTA: As amostras de proteína podem ser congeladas e armazenadas a -80 °C para análise posterior. As concentrações de proteínas servem como parâmetro interno para a normalização das atividades de sintetização de citrato. - Adicione 400 μL de tampão de extração de gelo-frio para cada amostra restante para fazer um volume total de 500 μL. Misture bem por tubulação suavemente para cima e para baixo, pelo menos, 5x, evitando a formação de bolhas. Para cada reação, adicione 1 μL de lysate celular diluída a 150 μL da solução de reação recém-preparada (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetil CoA, 1 m oxaloáptico ácido). Misture bem e imediatamente por tubulação suave, evitando a formação de bolhas. Medir a absorção em 412 nm cada 10-30 s para 4 min em 25 °C usando um leitor de placa capaz de medir a absorção em 412 nm em intervalos mínimos de 10 s.
NOTA: Mude a ponta antes de pipetting um reagent diferente e evite dar forma a bolhas nos poços. A mistura incompleta dos reagentes pode causar variações nas medidas. O ensaio de atividade de sintetização de citrato deve ser feito à temperatura ambiente imediatamente após as amostras serem coletadas, pois este ensaio é usado para quantificar a massa mitocondrial intacta. O buffer de reação deve ser preparado imediatamente antes do uso e não deve ser armazenado. - Dados do enredo como absorção de densidade óptica (OD) (abs) (eixo Y) versus tempo (em minutos) (Eixo X). Em seguida, calcule a inclinação para a parte linear da curva, onde a taxa de reação é
Divida o valor pela concentração de proteína da amostra para normalizar a atividade de sintese de citrato. A atividade de sintese de citrato é calculada como
NOTA: A concentração da proteína da amostra pode ser medida por um jogo do ensaio da concentração da proteína.
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Resultados
A Figura 1 apresenta um exemplo das curvas cinéticas para a absorção de OD em 412 nm ao longo do tempo obtida usando o ensaio colorítrico da atividade synthase citrato para medir as homogeneas do tecido drosophila thorax de diferentes genótipos. É sabido que o PGC-1α é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Pgc-1α é funcionalmente conservado entre Drosophila e os seres humanos. Drosophila Drosophila RNF34 (dRNF34) é uma liga...
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Discussão
Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w1118
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Divulgações
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanossulfônico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Base TRIZMA) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Ácido ditio-bis-nitrobenzóico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pilão de pellets | Sangon | F619072 | |
| Motor de pilão de pellets | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Leitor de placas | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit de ensaio | Beyotime | P0010S | |
| Tesoura | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referências
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Reimpressões e permissões
