Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.
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Artigo de método
Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.
Introdução
As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocon....
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Protocolo
1. Ensaio de atividade de citrato de citrato colorimtricpara D. melanogaster16
- Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras de triplicado para cada genótipo.
- Prepare 500 μL de tampão de extração de gelo-frio contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.
- Anestesia adulto voa com CO2 em uma almofada de anestesia e isolar os tecidos desejados. Para isolar os thoraxes adultos da mosca, por exemplo, repara os thoraxes da mosca por um par de fórceps, e isola então os abdômens da mosca cortando ao longo da b....
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Resultados
A Figura 1 apresenta um exemplo das curvas cinéticas para a absorção de OD em 412 nm ao longo do tempo obtida usando o ensaio colorítrico da atividade synthase citrato para medir as homogeneas do tecido drosophila thorax de diferentes genótipos. É sabido que o PGC-1α é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Pgc-1α é funcionalmente conservado entre Drosophila e os seres humanos. Drosophila Drosophila RNF34 (dRNF34) é uma liga.......
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Discussão
Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w1118
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Divulgações
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanossulfônico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Base TRIZMA) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Ácido ditio-bis-nitrobenzóico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pilão de pellets | Sangon | F619072 | |
| Motor de pilão de pellets | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Leitor de placas | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit de ensaio | Beyotime | P0010S | |
| Tesoura | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referências
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
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Reimpressões e permissões
