Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Resumo

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

Resumo

A estirpe mecânica extracellular é sabida para provocar respostas fenotípicas da pilha e tem a relevância physiological em diversos sistemas do tecido. Para capturar o efeito da tensão de tração extracelular aplicada em populações da pilha in vitro através dos ensaios bioquímicos, um dispositivo foi projetado previamente que pode ser fabricado simplesmente e é pequeno bastante caber dentro das incubadoras da cultura do tecido, assim como na parte superior de estágios do microscópio. Entretanto, o projeto precedente do substrato do polidimetilsiloxano não permitiu a imagem latente subcellular de alta resolução através dos objetivos da óleo-imersão. Este trabalho descreve uma geometria redesenhada do substrato do polidimetilsiloxano e uma configuração de imagem personalizada que, em conjunto, pode facilitar a imagem subcelular de alta resolução de células ao vivo, enquanto estirpe aplicada. Este substrato pode ser usado com o mesmo, dispositivo projetado anteriormente e, portanto, tem as mesmas vantagens como listado acima, além de permitir a imagem óptica de alta resolução. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano pode ser melhorado incorporando uma grade que facilite o seguimento da mesma pilha antes e depois da aplicação da tensão. Os resultados representativos demonstram a imagem latente de alta resolução do tempo-lapso de núcleos cDNAs etiquetados dentro das pilhas tensas capturadas usando o método descrito aqui. Estes dados da dinâmica nuclear dão introspecções no mecanismo por que a tensão elástica aplicada promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte.

Introdução

Células e tecidos no corpo são submetidos a várias pistas mecânicas, incluindo tensões de tração. No entanto, os efeitos dessas pistas sobre a biologia das células neurais ainda não foram estudados extensivamente e compreendidos plenamente. No sistema nervoso central, as fontes de deformação mecânica incluem o crescimento do desenvolvimento^1,2,3,4, processos fisiológicos, como flexão da medula espinhal, sangue e líquido cefalorraquidiano pulsação, e condições patológicas tais como o traumatismo, o inchamento do AXON, scarring glial, ou o crescimento do tumor^5,6,7,8. Vale a pena investigar como a tensão elástica afeta a diferenciação de oligodendrócitos e a subsequente mielinação de axônios, que é um processo crítico no sistema nervoso central de vertebrados. Usando um dispositivo de deformação personalizado e placas de multipoços elastoméricos, trabalhos anteriores^9,10 mostraram que a cepa uniaxial estática pode aumentar a diferenciação de oligodendrocyte através de mudanças globais na expressão ^{gênica 10}. para obter uma maior compreensão dos mecanismos de mecanotransdução de estirpe nestas células, o aparelho experimental anterior deve ser redesenhado como descrito aqui, para permitir a imagem latente de fluorescência de alta resolução da dinâmica nuclear na vida células tensão. Especificamente, uma placa polidimetilsiloxano do único-poço é desenvolvida, e a configuração da imagem latente é redesenhada para permitir a imagem latente do tempo-lapso de pilhas ao vivo a tensão usando uma lente da imersão do óleo 100x. Para eliminar os efeitos ópticos negativos do polidimetilsiloxano na via de luz, as células são imaged não através da placa de polidimetilsiloxano, mas na posição invertida, através do vidro de cobertura cobrindo o compartimento da célula. Usando este projeto novo da imagem latente, as centenas de filmes high-resolution do tempo-lapso são gravadas, de núcleos individuais da pilha dentro das pilhas aderentes intactas, onde a cromatina é etiquetada etiquetando o histona H2B à proteína fluorescente verde. Estes filmes demonstram que a tensão elástica induz mudanças na estrutura e na dinâmica da cromatina que são consistentes com a progressão da diferenciação do oligodendrocyte.

A imagem latente viva da pilha a tensão aplicada é tecnicamente desafiante e exige um projeto do dispositivo que seja compatível com o sistema do microscópio. O design personalizado descrito aqui apresenta uma alternativa barata para soluções comerciais. Suas dimensões permitem sua instalação nos estágios do microscópio e na imagem latente viva da pilha na definição espacial elevada durante a tensão aplicada. O setup da imagem latente é projetado facilitar a imagem latente viva da pilha usando uma lente da imersão do óleo 100x com a claridade a mais elevada, através do vidro da tampa, não através da camada da placa do polidimetilsiloxano que diminui de outra maneira a qualidade de imagem e é comum em a maioria configurações de imagem tensão. O dispositivo, com uma placa montada que contem pilhas, pode igualmente ser armazenado facilmente na incubadora. Este dispositivo é projetado aplicar a tensão uniaxial aos substratos que facilitam a cultura de pilha aderente e mantêm uma tensão estável e uniforme sobre dias múltiplos. A instalação descrita aqui pode ser usada para a imagem latente de alta resolução de vários tipos aderentes da pilha a tensão, fazendo a aplicável aos estudos do mechanotransdução em muitos campos da mecanobiologia da pilha.

Protocolo

1. projeto do molde do polidimetilsiloxano do único-poço para a imagem latente de alta resolução

Nota: o molde para a fabricação de placas de polidimetilsiloxano é projetado com as seguintes características para permitir a imagem com uma lente de imersão de óleo 100x e um ajuste correto no dispositivo de deformação Custom-Build (Figura 1a, B).

1. Mantenha as dimensões gerais da chapa de tal forma que se encaixe nas braçadeiras do dispositivo de deformação.
   Nota: aqui, são 60 mm x 73 mm.
2. Faça um compartimento da pilha ou bem que seja significativamente menor do que as dimensões laterais da placa inteira, para evitar os efeitos de arco (fora--plano de dobra) que acontecem nas bordas apalpe da placa do polidimetilsiloxano durante a tensão aplicada.
   Nota: aqui, o compartimento foi concebido como um quadrado de 23 mm x 23 mm.
3. Mantenha a profundidade do compartimento de células o mínimo possível (não mais de 80 μm), para permitir o foco com a lente de imersão de óleo 100x através do vidro de cobertura colocado em cima do compartimento, mas torná-lo suficiente para conter mídia e para evitar entrar em contato ou apertando as células.
4. Levante o compartimento de pilha em um quadrado com uma altura de 3 milímetros, para trazer as pilhas mais perto da lente na instalação invertida do microscópio para permitir a focalização fácil.
   Nota: os moldes com as características acima podem ser manufacturados por muitas técnicas que incluem, por exemplo, alumínio moado. Alternativamente, os moldes mestres podem igualmente ser montados usando as folhas acrílicas cortadas com um cortador do laser, o vidro da tampa #0 para o compartimento de pilha, e a colagem super. Este molde mestre é usado para fazer uma impressão do polidimetilsiloxano, que seja usada então para fazer moldes de trabalho usando uma resina da carcaça.

2. fabricação de simples-bem polidimetilsiloxano placas e compartimentos quadrados

1. Misture a base do polidimetilsiloxano e o agente de cura em uma relação de 20:1 (pelo peso) em um copo descartável. Pesar um total de 20 g de polidimetilsiloxano por molde (para fazer uma placa de polidimetilsiloxano) e 150 g de polidimetilsiloxano por 150 mm-em-diâmetro do prato de plástico (para fazer um lote de compartimentos quadrados).
2. Deixe a mistura de polidimetilsiloxano em um degasser a vácuo na barra-0,8 por 30 min (ou até que todas as bolhas sejam removidas).
3. Despeje a mistura de polidimetilsiloxano nos moldes (para chapas) ou em pratos plásticos de 150 mm (para compartimentos quadrados).
4. Remover quaisquer bolhas adicionais nesta fase, quer por sopro de ar (por via oral) ou desgaseificação do polidimetilsiloxano-preenchido moldes/pratos novamente at-0,8 bar vácuo por 30 min.
5. Deixe os moldes/pratos em um forno de 80 ° c em uma tabela nivelando para 2 h.
6. Retire cuidadosamente os moldes/pratos do forno e deixe-os arrefecer até à temperatura ambiente. Retire suavemente o polidimetilsiloxano curado após cortar cuidadosamente as bordas com uma lâmina (Figura 1C).
7. No polidimetilsiloxano de 150 mm de diâmetro, desenhe uma grelha de 2 cm x 2 cm com um marcador. Dentro de cada quadrado, desenhe um quadrado de 1 cm x 1 cm, deixando uma margem de 0,5 cm em todos os lados. Usando uma lâmina, corte cuidadosamente ao longo das linhas para obter compartimentos quadrados (Figura 2a).
8. Limpe as placas de polidimetilsiloxano/compartimentos quadrados incubando-os em 100% de acetona por 4 h, seguido de 100% de etanol por 4 h, seguido de água autoclavada por 4 h.
9. Coloc as placas/compartimentos quadrados no papel do revestimento protetor da película de parafina (não a película de parafina mas o papel) dentro de um prato plástico do diâmetro de 150 milímetros (Figura 2C).
10. Deixe a placa de polidimetilsiloxano no forno a 80 ° c para secar durante 4 h.
11. Sele os 150 pratos do milímetro-diâmetro que contêm placas do polidimetilsiloxano e os quadrados do recipiente com película de parafina, e armazená-los em uma sala fria até o uso mais adicional.

3. functionalization de placas do polidimetilsiloxano

1. Retire a película de parafina, retire a tampa do prato de plástico, e coloque as placas de polidimetilsiloxano e compartimentos quadrados luz ultravioleta por 30 min.
2. Plasma-trate (em 150 W por 5 minutos) as placas do polidimetilsiloxano (com o compartimento de pilha que enfrenta acima) sem os compartimentos quadrados, para fazer a superfície da cultura hidrófilo.
3. Coloque imediatamente os compartimentos quadrados na superfície tratada com plasma (Figura 2b) e pressione manualmente para colocar os dois em conjunto temporariamente.
   Nota: não plasma-trate os compartimentos quadrados, ou então eles vão ficar fortemente para a placa de polidimetilsiloxano e não vai sair facilmente quando eles devem ser descascados durante a imagem.
4. Adicionar 200 μL de 100 mM (3-aminopropilo) trietoxilsilano ao poço durante 2 h para introduzir – NH₂ grupos para a superfície polidimetilsiloxana. Para fazer uma solução de 100 mM, dissolva 234 μL de trietoxilsilano puro (3-aminopropílico) em 10 mL de água. Após uma incubação de 2 h, lave os poços 3x com água desionizada.
5. Pesar 2 MGS do chapéu cabeado molecular bissulfosuccinimidyl suberate e dissolvê-lo em 700 μL de 1 M (4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfônico Acid buffer (pH 8,0) e 2,8 ml de água.
   Nota: isso dará uma solução de 1 mm de bissulfosuccinimidyl suberate em 200 mm (4-(2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfônico Acid buffer. Observe que um buffer de concentração de 50 mM também funciona bem.
   1. Adicionar 135 μL desta solução e 15 μL de 1 mg/mL de fibronectina ao poço em cada placa de polidimetilsiloxano durante 4 h à temperatura ambiente.
6. Lave 3x com solução salina tamponada com fosfato. Adicionar 500 μL de solução salina tamponada com fosfato ao poço. Cubra o prato de 150 mm de diâmetro contendo o polidimetilsiloxano com película de parafina e guarde-o em uma sala fria, até o uso posterior.

4. functionalization de pratos plásticos e frascos

1. Incubar pratos e frascos plásticos com uma solução de 5 μg/mL de poli-D-lisina (PDL, em água estéril) durante 1 h. Adicione 1,5 mL desta solução (ligand) por prato de 35 mm de diâmetro, 3 mL por prato de 60 mm de diâmetro e 10 mL por balão de cultura de 75 cm² .
2. Lave os pratos e frascos 2x com água estéril.
3. Deixe-os secar no armário de biossegurança por 1 h (ou até secar) e guarde-os na sala fria a 4 ° c até o uso posterior.

5. meio de proliferação e diferenciação para células progenitoras de Oligodendrócito murino

1. Prepare 50 mL de soluções 100x do meio de proliferação e diferenciação, faça alíquotas de 2,5 mL e armazene-as em-80 ° c.
   Nota: a composição do meio de proliferação é 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-transferrina, 5 ng/mL de Selenito de sódio, 1x penicilina-estreptomicina, 10 ng/mL de crescimento derivado e fator de crescimento de 10 ng/mL de fibroblastos no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alta glicose e piruvato. Enquanto a albumina sérica bovina, progesterona, putrescina e Selenito de sódio pode ser constituída e armazenada em 100x, insulina, holo-transferrina, e penicilina-estreptomicina deve ser adicionado fresco ao preparar a solução 1x. Os fatores de crescimento devem ser constituídos a 10 μg/mL e devem ser adicionados frescos às células todos os dias (1 μL/mL de meio). A composição do meio de diferenciação é 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina, 62 ng/mL de progesterona, 16 μg/mL de putrescina, 5 μg/mL de insulina, 50 μg/mL de holo-transferrina, 5 ng/mL Selenito de sódio, 1x penicilina-estreptomicina, 400 ng/mL triiodotironina 400, L-tiroxina, e 0,5% soro fetal bovino em DMEM com alta glicose e piruvato. A triiodotironina e a L-tiroxina podem ser constituídas com outros reagentes e armazenadas a 100x. Insulina, holo-transferrina e penicilina-estreptomicina devem ser adicionadas frescas durante a preparação da solução 1x.
2. Para a preparação de 50 mL de meio de proliferação de 100x, dissolva 510 mg de albumina sérica bovina em 17 mL de meio de Dulbecco, 310 μg de progesterona em 31 μL de etanol, 80 mg de putrescina em 500 μL de meio de Dulbecco, 25 μg de Selenito de sódio em 10 μL de meio de Dulbecco , e DMEM completo até 50 mL
3. Para preparar 50 mL de solução de 100x de meio de diferenciação, adicionalmente dissolver 2 mg de triiodotironina em 40 μL de hidróxido de sódio e 2 mg de L-tiroxina em 40 μL de hidróxido de sódio, em seguida, encher a solução para 50 mL com o meio de Dulbecco. Filtre a solução através de uma unidade de filtro descartável estéril, alíquota, e armazene as alíquotas em-80 ° c.
4. Para a preparação de 250 mL de meio de proliferação/diferenciação 1x, misture 2,5 mL de solução 100x de meio de proliferação/diferenciação com 12,5 mg de holo-transferrina, 125 μL de insulina 10 mg/mL e 2,5 mL de 100x de penicilina-estreptomicina. Encha acima a solução a 250 mL com o meio de Dulbecco e filtre-o através de uma unidade descartável estéril do filtro.
   Nota: os fatores de crescimento devem ser adicionados frescos e diretamente à cultura celular, não a todo o lote de meio reconstituído.

6. cultura celular

1. Comece com células progenitoras oligodendrócyte suspensas em meio de proliferação. Semeie estas células a uma densidade de 35.000 células/cm² para superfícies plásticas revestidas com PDL (pratos ou frascos, ver secção 4). Ajuste o volume do meio de proliferação para 3 mL por 10 cm² da área de superfície do substrato plástico; um volume mais baixo do meio pode conduzir à aglomeração da pilha que levanta-se das forças de tensão de superfície, quando um volume mais elevado de meio nos pratos pode causar o derramamento.
2. Adicione fatores de crescimento (fator de crescimento derivado de plaquetas e fator de crescimento de fibronectina) todos os dias, mantendo sua concentração em 10 ng/mL e mude metade do meio de proliferação em dias alternados.
3. No terceiro dia, retire as células da superfície plástica usando uma solução de descolamento de células suaves (por exemplo, accutase): Retire o meio, lave 1x com solução salina tamponada com fosfato, adicione 1 mL de solução de descolamento por área de 20 cm² , deixe o prato/balão em uma incubadora em 37 ° c por 10 minutos, e bata-a delicadamente até que todas as pilhas se separem (Olhe um microscópio).
4. Pipetar usando uma ponta de 200 μL para quebrar aglomerados em células individuais, transferi-los para um tubo de 50 mL, dilui-los em meio de proliferação, girar a 0,2 x g por 10 min, descartar o sobrenadante e ressuscitar o pellet em meio de proliferação para fazer um volume total de 1 ml. Conte as células usando um citometro.
5. Lave as placas de polidimetilsiloxano fibronectina-functionalized 2x, 15 min por lavagem, com meio de proliferação.
6. Sementes 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano em 700 μL de meio de proliferação.
7. Adicione uma construção do plasmídeo de H2B-GFP para etiquetar o histona H2B com a proteína fluorescente verde.
   Nota: aqui, 1,4 μL de CellLight H2B-GFP BacMam2 transfection Mix foi adicionado a cada placa (2 μL por 50.000 células).
8. Após 24 h, monte as amostras de polidimetilsiloxano com células a serem esticadas no dispositivo de deformação uniaxial (como mostrado na Figura 2D). Mude o meio em todas as amostras para o meio de diferenciação.
9. Para esticar as amostras, medir o comprimento do compartimento de células sem tensão (Figura 3a) e girar o parafuso do micrômetro de estágio para aumentar o comprimento do compartimento da célula pela quantidade desejada (por exemplo, 10%, ver Figura 3B). Deixe as amostras de polidimetilsiloxano estendidas e não esticadas na incubadora a 37 ° c até a imagem.

7. imagem latente

1. Ligue o microscópio. Ajuste a temperatura da incubadora do microscópio a 37 ° c.
2. Traga o objetivo a ser usado (100x imersão a óleo) para a posição central como a torre objetiva não será acessível mais tarde. Desaperte o objetivo e aparafuse-o com um anel objetivo (figura 4a) para que o objetivo possa ser trazido mais perto das células. Se um objetivo de petróleo está sendo usado aqui, adicione uma gota de óleo nesta etapa.
3. Sintetizar de antemão (através de impressão 3D ou usinagem) um suporte de plástico ou metal que tem duas características importantes — uma janela angular e uma etapa (Figura 4B).
   Nota: a janela suporta uma espessura #0 lamínula de vidro que irá segurar o meio enquanto o dispositivo de deformação está em um estado invertido. O corte angular nas bordas da janela (Figura 4D) permite que o objetivo chegue mais perto da lamínula de vidro. A etapa no suporte permite-nos de trazer o polidimetilsiloxano esticado mais para baixo, mais perto do objetivo.
4. Coloque uma lamínula de vidro (espessura #0, com dimensões de 25 mm x 25 mm ou 35 mm de diâmetro) na superfície superior do suporte, espalhando graxa de vácuo na periferia da janela (Figura 4C), e tape a janela plástica no estágio do microscópio ( Figura 4D e Figura 5a).
5. Aparafuse um estágio de tradução zno estágio do microscópio e mova-o para a posição zsuperior (Figura 5a).
6. Remova 500 μL do meio da placa de polidimetilsiloxano esticada a ser imaged e adicione este meio na lamínula de vidro na janela plástica branca.
7. Retire cuidadosamente o compartimento quadrado da placa de polidimetilsiloxano com pinças estéreis.
8. Segure o dispositivo de deformação em uma posição vertical (células voltadas para cima) acima da janela de plástico branco e inverta cuidadosamente o dispositivo de deformação de modo a deixar qualquer meio extra cair diretamente no meio da lamínula de vidro (Figura 5b) (células voltadas para baixo).
9. Coloque a parte inferior do dispositivo de deformação no estágio de tradução zcom a fita dupla face (Figura 5C, D).
10. Ao olhar através da ocular o brightfield, lentamente traga o dispositivo da tensão para baixo (Figura 5E) (abaixando o estágio da z-tradução) e mova o objetivo até o foco nas pilhas.
    1. Execute esta etapa extremamente lentamente, passo a passo. Se o dispositivo da tensão pressiona demasiado na lamínula, as pilhas podem começ comprimidas (fazendo com que morra) e se o objetivo pressiona demasiado na lamínula, o lamela pode quebrar (causando o meio para vazar e derramar no objetivo).
11. Escaneie a placa do polidimetilsiloxano em x-e em y-sentidos para encontrar uma pilha que tenha um núcleo fluorescente (sob o epifluorescência com 488 nanômetro da excitação do comprimento de onda) e a morfologia apropriada da pilha (sob o brightfield).
12. Se o deslocamento lateral do estágio do microscópio não afeta a focagem vertical muito, selecione várias regiões de interesses usando um recurso multiponto no software. Às vezes, o foco é muito sensível a qualquer deslocamento lateral do palco. Em tais casos, a imagem de uma célula de cada vez. Marque as posições x, ye zpara cada célula de interesse.
13. Grave imagens de campo largo (ou de furo aberto) do núcleo com 488 nm de excitação de comprimento de onda e da célula com excitação de campo brightfield em intervalos de 30 s por quadro para uma duração total de pelo menos 30 min.

8. análise de dados

1. Flutuações nucleares
   1. Abra a sequência de imagens do núcleo (Figura 6a) em um software de análise de imagem e limite as imagens de lapso de tempo do núcleo (por exemplo, use o comando Threshold no ImageJ ou o comando GRAYTHRESH no software MATLAB).
   2. Obtenha a área do núcleo (em pixels) em função do tempo, plote-a em um software de plotagem de dados (Figura 6B) e ajuste um polinômio de terceira ordem aos dados (Figura 6C) (por exemplo, use a análise | Fitting | Comando Polynomial Fit no Origin ou no comando polyfit no software MATLAB).
   3. Subtrair o valor do polinômio ajustado da área real (em pixels) para cada ponto de tempo. Esta área corrigida é conhecida como a área residual.
      Nota: este processo remove qualquer tendência crescente ou decrescente nos dados provenientes de erros instrumentais e é chamado detrending.
      1. Calcule a percentagem de área residual dividindo a área residual em cada ponto de tempo com o valor do polinômio ajustado nesse ponto de tempo (Figura 6D).
   4. Calcule o desvio padrão da série temporal da área residual. Este desvio padrão denota a amplitude das flutuações nucleares.
2. Plotagem de dados e análise estatística
   1. Calcule a amplitude das flutuações nucleares como uma média de pelo menos 20 núcleos por condição.
   2. Realizar um teste estatístico de análise de variância unidirecional com correção de Bonferroni para determinar se há uma diferença significativa na amplitude das flutuações em função das condições de interesse (por exemplo, com e sem cepa aplicada).

Resultados

Os trabalhos recentes que visam investigar o efeito da tensão elástica em oligodendrócitos¹⁰ mostraram que uma tensão elástica uniaxial de 10% promove a diferenciação de pilhas do progenitor do oligodendrocyte por mudanças globais na expressão de Gene. O mecanismo por trás dessas alterações na expressão gênica pode ser sondados por meio da imagem de parâmetros subcelulares, como a estrutura do citoesqueleto, localização do fator de transcrição, dinâmica nuclear e o...

Discussão

Um dispositivo foi projetado previamente¹ para a aplicação da tensão de tração extracelular em pilhas aderentes. O projeto do substrato do polidimetilsiloxano em que o trabalho era suficiente para ensaios bioquímicos, assim como a imagem latente de baixa resolução de pilhas esticadas. Neste trabalho, o substrato foi redesenhado, e uma nova configuração de imagem que facilita a imagem de célula viva subcelular de alta resolução foi introduzida. As vantagens deste sistema são numerosas: pode ser con...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células primárias			Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isoladas de ratos neonatais foram fornecidas pelo laboratório do Dr. S. Y. Chew na Universidade Tecnológica de Nanyang
Media
DMEM de alta glicose	Gibco	11996-065-500ml
Pen/Strep	Gibco	15070-063-100ml
FGF	Prospec	CYT-608-50ug
PDGF	Prospec	CYT-776-10ug
Media Componentes conservados em estoque
BSA	Sigma	A9418-10G
Sigma		P8783-1G
Putrescine	Sigma	P5780-5G
Selenito de sódio	Sigma	S5261-10G
Tri-iodotironina	Sigma	T6397-100MG
Tiroxina	Sigma	T1775-100MG
Holo-Transferrina	Sigma	T0665-500MG
Insulina	Sigma	I9278
Molde e placa
PDMS PDMS - Dow Corning Sylgard 184	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Molde - Plástico Líquido	Liso Smooth On	Smooth Cast 310 - Tamanho
Revestimentos
de Substrato poli-D-lisina Sigma		P6407-5MG
Fibronectina	Sigma	F1141-2MG
forte>Coloração de histonas
Sondas moleculares	CellLigt H2B-GFP BacMam	C10594
Funcionalização de superfície
APTES	Sigma	A3648-100ml
BS3	Covachem	13306-100mg
Tampão HEPES pH 8,0	Alfa Aesar	J63578-AK-250ml
Descolamento celular
Accutase	Invitrogen	A1110501-100ml