Proteína celular livre expressão usando o rapidamente crescendo bactéria Vibrio natriegens

Resumo

Sistemas de expressão livre de célula são ferramentas poderosas e custo-eficiente para a síntese de alta produtividade e rastreio de proteínas importantes. Aqui, descrevemos a preparação do sistema de expressão de proteínas sem célula usando Vibrio natriegens para a produção de proteína rápida usando DNA Plasmideo DNA linear e do mRNA.

Resumo

A bactéria Marinha Vibrio natriegens tem atraído considerável atenção como um host microbial emergente para biotecnologia devido a sua taxa de crescimento rápido. Um protocolo geral é descrito para a preparação da V. natriegens extratos bruto célula utilizando equipamentos comuns de laboratório. Este protocolo alto rendimento tem sido especificamente otimizado para a acessibilidade dos utilizadores e custo reduzido. Síntese de proteína sem célula (CFPS) pode ser realizado em reações de lote em pequena escala 10 μL em qualquer formato 96 ou 384 poços e reproducibly produz concentrações de > 260 μg/mL super pasta GFP (sfGFP) 3 h. em geral, extrato de célula bruta preparação e CFPS pode ser alcançado em dias completos de 1−2 por um único usuário. Este protocolo pode ser facilmente integrado em gasodutos de síntese de proteína existentes para facilitar os avanços na bio-produção e aplicações da biologia sintética.

Introdução

Síntese proteica celular-livre é um método versátil e econômico para a expressão de proteínas valiosas ou peptídeos^1,2,3,4. Historicamente, síntese proteica celular-livre foi realizada utilizando sistemas de expressão de Escherichia coli ; no entanto, tem havido um aumento recente no uso de organismos alternativos, não-modelo com propriedades romance como chassi para celular-livre expressão^{5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12}. organismos com perfis metabólicos únicos são principais candidatos como alternativas para sistemas sem célula de e. coli . Por exemplo, a bactéria Marinha que Vibrio natriegens é o crescimento rápido de todos os organismos conhecidos com um observado tempo de menos de 10 min¹³de duplicação. Isto tem atraído V. natriegens considerável atenção como um host microbial emergente para pesquisa e biotecnologia^{14,15,16,17,18}. Dado que a taxa de crescimento rápido de V. natriegens tem sido associada a altas taxas de síntese proteica e eficiência metabólica^19,20,21, aproveitando sua maquinaria celular para celular-free síntese pode expandir significativamente o kit de ferramentas para a produção de proteína rápida e seleção da elevado-produção.

Recentemente, uma célula livre V. natriegens sistema de expressão tem sido demonstrado que é capaz de produzir super pasta GFP (sfGFP) em concentrações de > 260 μg/mL em 3 h com um promotor de T7⁹. O objectivo geral de desenvolver esse método foi fornecer aos usuários com um sistema de expressão de proteínas altamente acessível, eficiente, Reproduzível e alto rendimento de célula livre que pode ser preparado utilizando equipamentos comuns de laboratório em um curto espaço de tempo. Este protocolo utiliza 1L culturas em frascos de agitar, lise celular por sonication pulso e reações em pequena escala em lote em um formato de 96 ou 384 poços para maximizar a paralelização e taxa de transferência de rastreio. Uma expressão de proteína longa e sustentado é possibilitada pela suplementação de ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como uma energia fonte^8,22,23. Ao completar com sucesso este protocolo, um usuário terá a capacidade de expressar uma proteína desejada ou extrair o conjunto de proteínas em um formato livre de célula usando V. natriegens célula bruta.

A partir de um estoque de glicerol, V. natriegens extratos de células bruto são preparados a partir de células colhidas em uma densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) de 1.0. Uma cultura de 1L renderá cerca de 2−3 mL de extracto, que é suficiente para mais de 800 sem célula reações no extrato bruto de célula de 25%. As proteínas podem ser expressas usando o plasmídeo DNA, DNA linear ou do mRNA; no entanto, degradação de modelo de DNA linear por nucleases endógenas permanece uma grande desvantagem ao usar o tipo selvagem V. natriegens célula livre sistema⁹. A partir de culturas de V. natriegens , proteína utilizável para aplicações a jusante pode ser alcançada por um único usuário em dias completos de 1−2.

Protocolo

1. preparação da V. natriegens bruto célula extrai – cultura bacteriana

1. Prepare-se V. natriegens crescimento bacteriano mídia LB-V2 conforme tabela 1. Esterilize os meios de comunicação de crescimento por autoclavagem. Permitir que a mídia atingir a temperatura ambiente (RT). Armazenar a mídia em excesso no RT
   Atenção: Use equipamento de proteção pessoal adequada (PPE) e consultar as instruções específicas de laboratório quando operando uma autoclave.
2. Use um estoque de glicerol de tipo selvagem V. natriegens para inocular 3 mL de mídia LB-V2. Cresce durante a noite a 30 ° C e agitando a 225 rpm.
3. Lavar 1 mL da cultura durante a noite por centrifugação a 10.600 x g em uma centrífuga de bancada de 1 min. Aspire o sobrenadante sem perturbar o sedimento resultante e ressuspender em 1 mL de fresco LB-V2 de mídia.
4. Uma 4L autoclavado perplexo frasco Erlenmeyer com tampa estéril, adicionar 1 L de meio de crescimento fresco LB-V2. Inocule com 1 mL de lavado cultura durante a noite (1:1, 000 de diluição). Cresce a cultura a 30 ° C e agitando a 225 rpm.
   Nota: V. natriegens culturas podem ser escaladas acima ou para baixo, mantendo a proporção de diluição de 1:1,000. Por exemplo, adicione 250 μL da cultura durante a noite lavada a 250 mL de mídia de crescimento fresca LB-V2 2 L confundiu o balão de Erlenmeyer com tampa estéril.
5. Monitore OD₆₀₀ usando um espectrofotômetro a cultura. Quando a cultura atinge OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, cultura de colheita através de centrifugação a 3.500 x g por 20 min a 4 ° C. Coloque a pelota no gelo.
   Nota: V. natriegens cresce rapidamente, portanto, um acompanhamento atento da cultura é necessário. Crescimento para OD₆₀₀ = 1.0 deve tomar aproximadamente 1.5−2 h para a relação de diluição de 1:1,000.
6. Aspire o sobrenadante e armazenar imediatamente a pelota bacteriana resultante a-80 ° C ou proceder directamente à Lise descrita na secção 2 da pilha.
   Nota: Esta etapa é um ponto de parada boa; no entanto, é recomendável que a pelota ser processado imediatamente ou no prazo de 1−2 dias para obter melhores resultados.

2. preparação do V. natriegens bruto célula extrai – lise celular

1. Preparar o tampão de Lise S30 conforme tabela 1 na estéril deionizada (DI) e ajustar o pH a 7.7 usando ácido acético glacial.
   Atenção: Ácido acético glacial deve ser manipulado com EPI adequado ao ajustar o pH.
2. Legal S30 lise aproximadamente 4 ° c, no frigorífico ou no gelo antes de iniciar o procedimento de lise celular.
   Nota: Para um rápido arrefecimento, lysis buffer pode ser colocado a-20 ° C. Não permita que o buffer congelar.
3. Lugar de pellets de célula no gelo para min 10−20 ou até completamente derretido. Resuspenda todos os pellets da mesma cultura 1L usando 10 mL de tampão de Lise S30 frio e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo de 50 mL. Se pelotas não são congeladas no congelador a-80 ° C no passo 1.6, vá diretamente para a ressuspensão.
   Nota: Aumente o volume de tampão de Lise S30 costumava inicialmente Resuspenda pelotas conforme necessário.
4. Suspensão de centrífuga a 3.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Aspire o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Lave o pellet uma segunda vez usando 10 mL de tampão de Lise S30 frio. Coloque a pelota no gelo.
5. Em uma sala fria, adicione 500 μL de tampão de Lise S30 frio para a pelota no tubo de 50 mL. Usando uma ponta de pipeta de largo diâmetro, resuspenda o pellet e transferir cuidadosamente a suspensão inteira da pelota para um tubo de 2 mL.
   Nota: Se uma grande furo pipeta não estiver disponível, use um par de tesouras para cortar a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para aumentar o furo para transferência da pelota.
   1. Transferir a pelota tanto quanto possível sem aumentar significativamente o volume; no entanto, a pelota deve ser resuspended no líquido suficiente para ser lisados, como indicado por uma suspensão homogênea no tubo de 2 mL. Não encha o tubo de 2 mL. A suspensão não deve exceder 1,5 mL; dividido em vários tubos, se necessário.
6. Manter o centrifugado no gelo e no trabalho em uma sala fria. Encha um copo de 600 mL com gelo e coloque um suporte de tubo 2 mL em cima do gelo.
   Nota: É útil colocar o suporte de tubo perto do lado do copo, para a suspensão da pelota será visível no gelo para monitorar o progresso sonication (ver Figura 1).
7. Vórtice suspenso da pelota no tubo 2 mL brevemente para homogeneizar as células, tubos de filme para remover todas as células na parte inferior da tampa e coloque no suporte do tubo com a tampa aberta. Baixar dica sonicador em suspensão, de modo que é apenas sob a superfície do líquido.
8. Prepare o set-up sonication conforme representado na Figura 2 usando um sonicador e sonda com um diâmetro de ponta de ⅛ polegadas. As seguintes configurações para o controle do sonicador de entrada: 20 kHz de frequência e amplitude de 50%, do pulso no tempo: 10 s, tempo OFF do pulso: 60 s.
9. Execute o protocolo de sonication de pulso para três ciclos. Se o volume total da suspensão da pelota é > 500 μL, execute o protocolo de sonication pulso seis vezes.
   Nota: Geralmente, os pulsos de 3−6 são suficientes para lyse V. natriegens pelotas; pulsos adicionais podem ser necessários dependendo do sonicador. Durante sonication, use a plataforma do botão de ajuste para mover a sonda para cima e para baixo lyse qualquer sedimento que pode se instalaram no fundo do tubo. O tubo pode ser removido do titular e brevemente vortexed para re-homogeneizar a suspensão entre pulsos. Ver discussão abaixo para obter a consistência pretendida de células lisadas.
   Atenção: Utilizar protecção auditiva adequada quando sonicador está ativo.
10. Após sonication, célula bruto centrífuga Extraia a 16.000 x g por 30−45 min a 4 ° C ou até lisado é livre de quaisquer restos celulares, como ilustrado na Figura 3.
11. Em uma sala fria, alíquota 50 μL dos sobrenadantes resultantes para novos tubos de 2 mL, sem perturbar o sedimento.
    Nota: qualquer detrito que é transferido acidentalmente para os novos tubos de 2 mL drasticamente irá reduzir a capacidade do extrato para síntese de proteína elevado rendimento.
    1. Opcionalmente, Reserve 10 μL de célula extrair para quantificação de proteína pós-lise em um separado 2 mL do tubo (ver passo 2.13 abaixo).
12. Flash congelar cru célula extratos, colocando os tubos em um suporte de tubo com uma corda mergulhando anexada como ilustrado na Figura 4. Mergulhe os tubos um Dewar contendo nitrogênio líquido e imediatamente coloque no congelador a-80 ° C até o uso.
    Atenção: Use EPI apropriado para a manipulação de nitrogênio líquido, incluindo o jaleco, óculos de segurança, protetor facial, luvas e avental cryogen.
13. Opcionalmente, quantificar a proteína total da célula lisada usando 10 μL definido passo 2.11.1 além de diluir a amostra 1: 100 em 1x tampão fosfato salino (PBS) e usando qualquer ensaio de quantificação de proteína total padrão tais como o ensaio de Bradford, ácido bicinchoninic ensaio (BCA), etc.

3. preparação dos componentes de reação de célula livre

1. Componentes da reação geral
   1. Prepare acções de trabalho de Mg-glutamato e K-glutamato em tubos de 50 mL com água estéril em concentrações de 100 mM e 2000 mM, respectivamente.
   2. Prepare um estoque de trabalho de 50% (p/v) de polietilenoglicol (PEG)-8000 adicionando-se 100 mL de estéril DI água de um copo de 250 mL. Coloque um pequeno agitador magnético para o copo. Pesar 50 g de PEG-8000 e adicione a 100 ml de água no copo.
   3. Colocar o copo sobre um conjunto de placa de agitação aquecida a 100 ° C e agitar a 250 rpm até que PEG-8000 em solução. Deixe a mistura líquida de PEG-8000 arrefecer antes de transferir para tubos de 50 mL.
2. Mistura de mestre energia solução
   1. Prepare uma solução de 5 M de KOH, acrescentando 140g de pelotas KOH a 500 mL de água estéril.
      Atenção: Preparar esta solução em um capuz químico e usar EPI ao manusear bases fortes. A solução se tornará quente então a tampa do frasco deve ser solta para evitar a acumulação de pressão. Permitir que a solução KOH alcançar RT antes de usar.
   2. Prepare um tampão HEPES-KOH de 1750 mM, acrescentando 20,85 g de HEPES para um frasco de 100 mL. Lentamente, adicione água DI estéril até que o volume atinge 40 mL. Garrafa de vórtice para dissolver o HEPES. Use a solução KOH de 5 M para ajustar o pH a 8.0 e depois trazer o volume de solução a 50 mL.
      Atenção: KOH deve ser manuseado com EPI adequado ao ajustar o pH.
   3. Prepare o restante 10x componentes estoque de energia mestre mistura nas concentrações indicadas na tabela 2 , em água estéril DI e coloque cada estoque no gelo. Descongele os estoques de ATP, GTP, CTP e UTP de 100 mM na RT e lugar no gelo.
      Nota: Um thermomixer definido para 37 ° C e 350 rpm pode ser usado para dissolver os reagentes em solução, se necessário. Não superaquecer ou deixar os reagentes sobre o thermomixer por um período prolongado de tempo.
   4. Em um tubo de 15 mL, adicione cada componente de mestre mistura de solução de energia de acordo com a ordem e o volume especificado na tabela 2. A solução depois de cada componente é adicionado de vórtice. Isso fará com 5 mL de mistura mestre de energia solução de 10x.
   5. Divida a mistura mestre de energia solução de 10x em 200 alíquotas μL em tubos de 2 mL. Flash congelar cada alíquota conforme realizado na etapa 2.12. Imediatamente, coloque-os no congelador a-80 ° C até o uso.
3. Mistura de mestre de aminoácido
   1. Para preparar o fresco 4 x mestre mistura de aminoácidos, começa por descongelar cada aminoácido circulante no RT e em seguida, colocando cada um no gelo. Use um vórtice e/ou thermomixer definir a 37 ° C e 350 rpm para assegurar todas as existências de aminoácidos são totalmente dissolvido.
      Nota: Cisteína não pode dissolver totalmente; Ele pode ser adicionado à mistura mestre aminoácido como uma suspensão. Não superaquecer ou deixar os reagentes sobre o thermomixer por um período prolongado de tempo.
   2. Em um tubo de 15 mL, adicionar os volume adequado de aminoácidos para água DI estéril, para que a concentração final de cada um é de 8 mM na seguinte ordem: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, sua, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR , LEU e CYS. Após a adição de cada aminoácido, vórtice o mestre misturar a solução. Os volumes listados na tabela 2 , perfazem 2,4 mL de mistura de mestre de aminoácido.
   3. Divida o aminoácido mestre mistura de 4x em 200 alíquotas μL em tubos de 2 mL. Flash congelar cada alíquota conforme realizado na etapa 2.12. Coloca imediatamente em um congelador a-80 ° C até o uso.
4. Produção do modelo de DNA de plasmídeo de reação-pronto
   Nota: Expressão de proteínas de célula livre neste sistema foi otimizado usando o vetor de expressão de proteína verde fluorescente (GFP) super pasta T7-pJL1-sfGFP (Tabela de materiais). É recomendável usar este plasmídeo como um controle para eficiência de reação celular-livre e a espinha dorsal de pJL1 para a clonagem e expressão de outras sequências de proteínas. Outros modelos de DNA de plasmídeo podem ser usados; no entanto, é importante notar que a transcrição é controlada por uma sequência de promotor T7 e a presença de T7 RNA polimerase. Um protocolo simples para a produção em larga escala de qualquer modelo de DNA de plasmídeo da transformada e. coli é descrito abaixo.
   1. Purifica o vetor desejado usando um kit de purificação de plasmídeo conforme instruções do fabricante (Tabela de materiais).
      Nota: Concentrando-se o modelo de DNA de plasmídeo tanto quanto possível é recomendado para atender as restrições de volume apertado da reação de célula livre. Em geral, aponta para um estoque de trabalho 750−1500 ng/μL.
5. Produção de reação pronta do mRNA
   Nota: Esta seção é opcional. Expressão da proteína foi testado usando o mRNA gerado a partir da in vitro a transcrição do plasmídeo T7-pJL1-sfGFP pelo listado T7 RNA polimerase (Tabela de materiais).
   1. Prepare-se do mRNA do plasmídeo codificação da proteína de interesse usando os componentes de reação in vitro a transcrição na tabela 3. Incube as reações durante 1 h a 37 ° C em um thermocycler.
      Nota: Recomenda-se realizar a 8−10x destas reações em paralelo para gerar material suficiente.
   2. Todas as reações da transcrição da piscina. Purifica usando um kit de purificação e concentrador de mRNA conforme instruções do fabricante (Tabela de materiais). Eluir do mRNA em água estéril. Loja do mRNA a-80 ° C até o uso.

4. executar sem célula proteína Eexpression reações usando V. natriegens bruto extrair

1. Expressão de proteínas sem célula usando plasmídeo ou modelo de DNA linear
   1. Retire 10 x mix de mestre solução energético e 4 x alíquotas de mestre mistura de aminoácidos do freezer-80 ° C, descongelar no RT e colocar no gelo. Retire o T7 RNA polimerase e estoques de inibidor de RNase do freezer-20 ° C e colocar no gelo. Descongele o molde do ADN em RT e lugar no gelo.
   2. Preparar uma mistura de mestre de reação sem célula conforme tabela 4 , adicionando cada componente na seguinte ordem para um tubo de 2 mL no gelo: mestre mistura de aminoácidos, energia solução mestre mix, Mg-glutamato, K-glutamato, modelo de DNA, PEG-8000, T7 RNA polimerase e RNase inibidor de. Agite suavemente o tubo após cada adição à mistura de mestre.
      Nota: Se o modelo linear é para ser usado na expressão de proteínas sem célula, adicione 5−10x rende mais material em comparação com o modelo do plasmídeo obter apreciável de proteína.
   3. Remova V. natriegens bruto lisado celular preparado na etapa 2.12 da freezers-80 ° C e coloque no gelo para min 10−20 até derretido. Adicione o volume apropriado célula bruta extrair para a mistura de reação sem célula mestre conforme tabela 4 e misture suavemente por agredir ou pipetagem para cima e para baixo.
   4. Expressão de proteínas sem célula de ponto de extremidade usando thermocycler
      1. Adicionar 10 μL da mistura mestre reação celular livre no fundo de um prato PCR de 96 ou 384 poços. Entre cada transferência para o prato PCR, misture a mistura de mestre por agredir o tubo delicadamente.
         Nota: Mistura de mestre reação sem célula deve ser bem misturada em todos os momentos para maximizar a reprodutibilidade de reação e expressão de proteínas de célula livre em todas as amostras.
   5. Brevemente, centrifugar a placa a 1.000 x g durante 10 s para qualquer mistura de mestre que pode ficar preso nas laterais dos poços da piscina. Selar os poços com um adesivo da placa para evitar a evaporação e, em seguida, coloque a placa do PCR em um thermocycler definir a 26 ° C com uma tampa aquecida a 105 ° C.
      Nota: A distribuição de calor mesmo e tampa aquecida de um thermocycler melhora rendimento de expressão de proteínas.
   6. Incube as reações sem célula por um período mínimo de 3h. Após a incubação, proteínas expressas podem ser purificadas, quantificadas e utilizadas para processos a jusante.
      Nota: Proteínas expressas podem ser quantificadas diretamente na reação de célula livre usando um método de escolha do usuário. Por exemplo, proteínas fluorescentes podem ser quantificadas utilizando uma curva padrão externa ou radioactividade pode ser medida se usando um radiolabeled do amino-ácido na reação de célula livre. Espectroscopia UV-visível ou ensaios da proteína total geralmente não são recomendados para medir diretamente a produção de proteína em reações sem célula sem uma purificação inicial.
   7. Alternativamente, monitor de cinética de expressão de proteínas sem célula usando um leitor de placa.
      1. Adicionar 10 μL da mistura mestre reação celular livre no fundo de uma placa de ensaio de 384-bem preto com fundo de vidro desobstruído. Manter a placa de ensaio no gelo ou trabalhar em uma sala fria ao adicionar a mistura de mestre para garantir que o perfil completo de cinético é obtido. Selar os poços com um adesivo de prato limpo para evitar a evaporação e em seguida coloque a placa de ensaio em um leitor de placa definir a 26 ° C.
   8. Incube as reações sem célula para 3−6 h enquanto monitora os comprimentos de onda adequados fluorescente de excitação/emissão correspondente à proteína expressa. Por exemplo, monitorar a Ex / Em = 485 nm/528 nm para sfGFP.
2. Expressão de proteínas sem célula usando o mRNA
   1. Degelo do mRNA preparado na fase 3.5.2 a RT e lugar no gelo.
   2. Executar etapa 4.1.1 através de passo 4.1.6 como anteriormente especificado para linear ou modelo de DNA do plasmídeo usando tabela 4 para preparar uma mistura de reação alternativa sem célula mestre do mRNA.

5. calibração de reações V. natriegens célula livre com sfGFP

Nota: Esta seção é opcional. A concentração do íon reação sem célula ideal pode variar ligeiramente para cada preparação do extrato bruto com base nas condições utilizadas para lise celular. Considere a execução opcional sem célula reação íon calibração protocolo descrito abaixo, utilizando o sfGFP se o rendimento da reação é significativamente inferior ao esperado (concentrações < 1,0 μg/mL).

1. Prepare o Mg^{2 +} e soluções de calibração de íon K⁺ conforme especificado no quadro 5 em água DI estéril da Mg-glutamato de 100 mM e 2.000 mM K-glutamato estoques preparados na etapa 3.1.1. Coloque gelo até ser necessário soluções de calibração.
2. Seguir o mapa de calibração na tabela 6, pipete 1 μL do glutamato-Mg e 2 μL das soluções de calibração de íon K-glutamato para os poços apropriados em uma placa de 384-PCR.
   1. A ordem das operações desta etapa é a seguinte: solução de calibração de íon pipeta o Mg-glutamato na parte inferior de cada bem seguido da solução de calibração de íon K-glutamato para o lado do bem sem tocar o líquido já presente nos poços.
   2. Sele os poços, colocando um adesivo em cima da placa para evitar a evaporação, enquanto se prepara a mistura mestre reação sem célula de calibração. Bata levemente a placa de 384 para misturar as soluções de calibração de K e Mg --glutamato.
      Nota: Uma pipeta repetidora é altamente recomendada para concluir esta etapa reproducibly e rapidamente.
3. Prepare a mistura de mestre de reação sem célula de calibração conforme especificado na tabela 5 usando o modelo de DNA de plasmídeo T7-pJL1-sfGFP em um tubo de 2 mL. Adicione cada componente na seguinte ordem para a mistura de mestre: mestre mistura de aminoácidos, mistura de mestre solução energia, modelo DNA T7-pJL1-sfGFP, PEG-8000, T7 RNA polimerase e inibidor de RNase. Agite suavemente o tubo para misturar após cada adição do componente.
   Nota: Não adicione Mg^{2 +} ou K⁺ para a calibração de célula livre mistura de mestre.
4. Remova o adesivo da placa. Cuidadosamente adicionar 7 μL da mistura mestre calibração reação celular-livre para os lados dos poços sem tocar a solução de calibração de íon mista já presente nos poços. Reseal dos poços com o adesivo e bata levemente a placa PCR 384-bem para misturar a mistura sem célula mestre com a solução de calibração de íon.
   Nota: Uma pipeta repetidora é altamente recomendada para concluir esta etapa reproducibly e rapidamente.
5. Brevemente, centrifugar a placa 1.000 x g durante 10 s para piscina qualquer líquido misturado que pode ficar preso nas laterais dos poços. Coloque a placa de 384 em um thermocycler definir a 26 ° C com uma tampa aquecida a 105 ° C.
6. Incube as reações sem célula para 3h. Após a incubação, transferir o conteúdo de cada poço a uma placa de ensaio de 384-bem preto com fundo de vidro com uma pipeta multicanal e lê a fluorescência de sfGFP no Ex / Em = 485 nm/528 nm, utilizando um leitor para determinar a combinação de concentração de iões que produz a maior quantidade de proteína.

Resultados

O protocolo descrito para a produção de proteínas usando V. natriegens sistema de célula livre expressão pode ser executado em dias de 1−2 por um único usuário, a partir da inoculação da cultura para proteína disponível para aplicações a jusante. Preparação de extratos de células bruto e mestre mistura ações compõem uma parcela significativa deste tempo; no entanto, uma vez preparados, em massa a maioria dos reagentes podem ser armazenado a longo prazo (tabela 7) e usado quando necessário, encurtando o tempo necessário para completar o protocolo.

O sistema de expressão descrito é melhor usado com modelo de DNA de plasmídeo ou mRNA gerados por reações in vitro a transcrição. Enquanto o DNA linear também pode ser utilizado como modelo para a produção de proteína, que produz significativamente menor quantidade de proteína. Por exemplo, em condições óptimas reacções a 26 °C, uma reação única 10 μL de célula livre pode produzir 260 > μg/mL de sfGFP em 3 horas usando 0,3 pmol de modelo de DNA de plasmídeo ou um comparável > 125 μg/mL de sfGFP usando 14 pmol de transcrição do mRNA (Figura 5A B). No entanto, 0.3 pmol de DNA linear irá produzir significativamente menos proteína (< 20 μg/mL). Para cada tipo de modelo, a maioria das proteínas será produzida dentro 1−1.5 h; no entanto, é recomendável que a reação é executada por um período mínimo de 3 horas. Concentrações de reação sem célula de sfGFP foram determinadas através de regressão linear usando uma curva padrão de sfGFP purificado, medição de fluorescência no Ex / Em = 485 nm nm/528.

O rendimento da produção de proteínas é significativamente afectado pela concentração de íons de potássio e magnésio (⁺ de K e Mg^{2 +}, respectivamente). Sob condições otimizadas, verificou-se que o ideal Mg^{2 +} e as concentrações de íons K⁺ será de 3,5 mM e 80 mM, respectivamente (figura 6A, B). Desvios em relação as concentrações de íon ideal podem resultar em uma diminuição da capacidade para o sistema de célula livre expressão para produzir a proteína com rendimentos apreciáveis. Calibração adicional pode ser necessária se o rendimento da reação é significativamente inferior ao esperado. Um protocolo opcional para a calibração do íon é descrito na seção 5. Isto permite alguma flexibilidade no compensando a variabilidade de extrato bruto de célula decorrentes de condições e equipamentos de lise de célula individual.

Figura 1: uma close-up vista do porta-copo e tubo na plataforma sonication. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: instalação de equipamento Sonication para a preparação da célula bruta extrair. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: vista para o sedimento após sonication e centrifugação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Flash congelamento dip para armazenamento de extrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados da representante por V. natriegens o síntese de proteínas sem célula usando tipos diferentes de modelo. Ensaio de ponto de extremidade (A) de produção de sfGFP usando concentrações equimolar de plasmídeo e modelo linear de DNA (0,3 pmol), bem como concentrações crescentes do mRNA. SfGFP sem célula concentração foi determinada utilizando uma curva padrão de sfGFP purificado mensurada pelo Ex / Em = 485 nm/528 nm após 180 minutos de incubação a 26 ° C, em condições de reação óptima em 10 volumes μL. (B) ensaio cinético de sfGFP produção usando concentrações equimolar de plasmídeo e modelo linear de DNA, bem como concentrações crescentes do mRNA. sfGFP medidas foram feitas a cada 3 minutos em Ex / EM = 485 nm nm/528 mais de 180 minutos de tempo de incubação total em condições de reação óptima em 10 volumes μL. Para o ponto de extremidade e ensaios cinéticos, amostras estavam em branco corrigido utilizando reações sem célula suplementadas com todos os componentes, exceto modelo. A média e desvios-padrão são mostrados (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: representante resultados para calibração de concentração iónica. (A) V. natriegens sem célula reações foram complementadas com concentrações crescentes de Mg^{2 +} e incubadas a 26 ° C para 180 minutos em 10 reações μL. A concentração total de K⁺ foi 160 mM para todas as concentrações de Mg^{2 +} . SfGFP sem célula concentração foi determinada utilizando uma curva padrão de sfGFP purificado mensurada pelo Ex / Em = 485 nm nm/528. (B) V. natriegens sem célula reações foram complementadas com concentrações crescentes de K⁺ e incubadas a 26 ° C para 180 min em 10 reações μL. A concentração total de Mg^{2 +} foi de 3,5 mM para todas as concentrações de K⁺ . Para ambas as calibrações, amostras estavam em branco corrigido utilizando reações sem célula suplementadas com todos os componentes, exceto modelo. A média e desvios-padrão são mostrados (n = 3). Esta figura foi modificada de Wiegand et al.⁹. Reimpresso com permissão da Wiegand, D.J., Lee, H.H Ostrov, s., da igreja, G.M., estabelecendo uma célula livre Vibrio natriegens sistema de expressão. Biologia sintética de ACS. 7 (10), 2475−2479 (2018). Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1	Preparação de meios de crescimento bacteriano LB-V2
Componente de	Quantidade (g)	Concentração final (mM)	Volume final (L)
Caldo LB (Miller)	25		1
NaCl	11,69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
Tabela 1	Preparação de S30A lise
Componente de	Quantidade (g)	Concentração final (mM)	Volume final (L)
Solução de tris (pH 8.0) - 1M (mL) *	25	50	0,5
Mg-glutamato	2,72	14
K-glutamato	6.10	60
Ditiotreitol (DTT) - 1M (mL) *	1	2

Tabela 1: reagentes para a preparação de 1 litro de mídia de crescimento bacteriano LB-V2 e 0,5 L de tampão de lise celular S30A. Clique aqui para baixar este arquivo no Excel. 

	Preparação de 10 x energia solução Master Mix
Componente de	Concentração de ações (mM)	Concentração final (mM)	Quantidade (µ l)	Volume final (µ l)
PH de HEPES-KOH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750,00
GTP	100	15	750,00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA de Escherichia coli ERM 600 (mg/mL) *	100	2	100,00
Hidrato de coenzima A	200	2.6	65,00
NAD	200	3.3	82,50
Acampamento	650	7.5	57.69
Ácido folínico	100	0.7	35,00
Espermina	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750,00
Água desionizada estéril			49,99
	Preparação de 4x do aminoácido Master Mix
Componente de	Concentração de ações (mM)	Concentração final (mM)	Quantidade (µ l)	Volume final (µ l)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ASP	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
SEU	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
CONHECI	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PRO	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
THR	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137,1
CYS	168	8	114.3
Água desionizada estéril			91,4

Tabela 2: Reagentes para a preparação de 5 mL de solução de energia de 10x master mix e 2,4 mL de 4 x mestre mistura ácido aminado.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

	T7 RNA polimerase em reações de transcrição de Vitro
Componente de	Estoque (mM)	Concentração final (mM)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 50 x quantidade (µ l)
10 x RNAPol reação Buffer			1.00	50
ATP	100	0,5	0,10	5
GTP	100	0,5	0,10	5
CTP	100	0,5	0,10	5
UTP	100	0,5	0,10	5
Molde de ADN (ng / µ l) *	1000	500	0,50	25
T7 RNA polimerase	200	2.6	2,00	100
Inibidor de RNase, murino	200	3.3	0,50	25
Água desionizada estéril			15.60	780
Reação Volume (µ l):	20

Tabela 3: componentes de transcrição In vitro para a geração de mRNA.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

	Sem célula reação Master Mix
Componente de	Concentração de ações (mM)	Concentração final (mM)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 50 x quantidade (µ l)
Extrato (%) *		25	2,50	125,00
Mg-glutamato	100	3.5	0.35	17,50
K-glutamato	2000	80	0,40	20,00
4 x aminoácido Master Mix	8.0	2	2,50	125,00
10 x energia solução Master Mix			1.00	50,00
Plasmídeo (ng / µ l) *	1000	500	0,50	25,00
50% PEG-8000 (%) *	50	2	0,40	20,00
T7 RNA polimerase			1.00	50,00
Inibidor de RNase, murino			0,10	5,00
Água desionizada estéril			1.25	62,50
Reação Volume (µ l):	10
	Alternativa sem célula reação Master Mix do mRNA
Componente de	Concentração de ações (mM)	Concentração final (mM)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 50 x quantidade (µ l)
Extrato (%) *		25	2,50	125,00
Mg-glutamato	100	3.5	0.35	17,50
K-glutamato	2000	80	0,40	20,00
4 x aminoácido Master Mix	8.0	2	2,50	125,00
10 x energia solução Master Mix			1.00	50,00
do mRNA (ng / µ l) *	2000	4000	2,00	100,00
50% PEG-8000 (%) *	50	2	0,40	20,00
Inibidor de RNase, murino			0,10	5,00
Água desionizada estéril			0.75	37.50
Reação Volume (µ l):	10

Tabela 4: Componentes de otimizado V. natriegens sem célula mestre mistura de reação para o molde do ADN e do mRNA.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

Mg 2 + Calibração		Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 100 x quantidade (µ l)	Reações de 100 x quantidade (µ l)
Final (mM)	Estoque	100 mM Mg-Glu	diH 2 0	100 mM Mg-Glu	Desionizada H2O
2.5	0	0,00	1.00	0	100
3.5	1	0,10	0.90	10	90
4.5	2	0.20	0,80	20	80
5.5	3	0,30	0.70	30	70
Reação Volume (µ l):	10
K + Calibração		Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 100 x quantidade (µ l)	Reações de 100 x quantidade (µ l)
Final (mM)	Estoque	2000 mM K-Glu	diH 2 0	2000 mM K-Glu	Desionizada H2O
40	30	0.15	1.85	12	148
80	70	0.35	1,65	28	132
160	150	0.75	1.25	60	100
320	310	1,55	0.45	124	36
Reação Volume (µ l):	10
	Íon calibração sem célula reação Master Mix
Componente de	Concentração de ações (mM)	Concentração final (mM)	Reação de 1 x quantidade (µ l)	Reações de 50 x quantidade (µ l)
Extrato (%) *		25	2,50	125,00
Mg-glutamato	Variável	Variável	1.00	50,00
K-glutamato	Variável	Variável	2,00	100,00
4 x aminoácido Master Mix	8.0	2	2,50	125,00
10 x energia solução Master Mix			1.00	50,00
Plasmídeo (ng / µ l) *	1000	250	0.25	12,50
50% PEG-8000 (%) *	50	2	0,40	20,00
T7 RNA polimerase			1.00	50,00
Inibidor de RNase, murino			0,10	5,00
Água desionizada estéril			0,00	0,00
Reação Volume (µ l):	10

Tabela 5: Íon concentração calibração mestre misturas.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

Mapa de calibração CF Ion		40 mM K+			80 mM K+			160 mM K+			320 mM K+
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
2,5 mM Mg2 +	A
3.5 mM Mg2 +	B
4.5 mM Mg2 +	C
5.5 mM Mg2 +	D

Tabela 6: Mapa de calibração de Ion.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

	Condições de armazenamento e vida de prateleira dos componentes CF
Componente de	Local de armazenamento	Vida de prateleira
Mídia de crescimento estéril LB-V2	4 ° C	3-6 meses
V. natriegens bruto Cell Extraia	-80 ° C	1-3 semanas
100 mM Mg-glutamato	Temperatura ambiente	6 meses
2000 mM K-glutamato	Temperatura ambiente	6 meses
50% PEG-8000	Temperatura ambiente	6 meses
10 x energia solução Master Mix	-80 ° C	3-6 meses
4 x aminoácido Master Mix	-80 ° C	3-6 meses
Modelo de DNA do plasmídeo/Linear	-20 ° C	6-12 meses
mRNA modelo	-80 ° C	3-4 semanas

Tabela 7: Condições de armazenamento sem célula e vida de prateleira.    Por favor clique aqui para baixar este arquivo no Excel.

Discussão

Este protocolo foi otimizado para o selvagem-tipo V. natriegens e meios de crescimento bacteriano compostos por LB suplementado com sais V2 (Tabela de materiais). Outras cepas de V. natriegens podem ser cultivadas da mesma forma para gerar extratos bruto célula para célula livre reações; no entanto, seu uso requer otimização adicional do presente protocolo. Além disso, este sistema de expressão de proteínas sem célula foi otimizado usando ácido 3-phosphoglyceric (3-PGA) como fonte de regeneração de energia primária. Outras fontes de regeneração de energia podem ser utilizados; no entanto, a otimização dos reagentes e calibração provavelmente será necessária para obter alto rendimento proteína expressão^10,11.

Especial atenção aos vários passos críticos neste protocolo irá garantir produtividade máxima extrato de alto rendimento sem célula de produção de proteína. Primeiro, extrato bruto celular deve ser preparado de V. natriegens célula culturas colhidas numa fase meados-exponencial de crescimento; rendimento de proteína é máximo quando as culturas alcançam uma OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2. Enquanto a produção de proteína sem célula é possível a partir de células colhidas em uma variedade de densidades ópticas, anteriormente encontramos que as células colhidas em um estado exponencial de crescimento produzem significativamente mais proteína⁹. Os efeitos observados no desempenho do extrato bruto de célula de densidade óptica são consistentes com aquelas relatadas para outros sistemas de expressão livre de células derivados de células cultivadas em condições de cultura do lote¹. Porque V. natriegens cresce a uma taxa rápida, é fundamental acompanhar de perto as densidades ópticas culturas. Em geral, espera-se que V. natriegens culturas reproducibly devem alcançar uma OD₆₀₀ de 1.0 dentro 1−1.5 h usando este protocolo; no entanto, as condições de crescimento individual como o uso de confundiam versus não-perplexo frascos, que afeta a aeração, ou air contra incubação de água, que afeta a taxa e a estabilidade da temperatura de incubação, podem alterar o tempo de crescimento. Além disso, geralmente recomenda-se cultura de pelo menos 250 mL de V. natriegens num balão de 1L perplexo para garantir um pellet de células grandes na colheita de fácil manipulação e transferência. Isso melhora consideravelmente o sucesso da preparação do extrato bruto de celular, bem como aumenta o volume total do extrato produzido a partir de uma pelota. Ao usar a preparação de escala menor, as condições de cultura e reagentes podem ser ajustados adequadamente. Para a fermentação em larga escala, ainda mais otimização das condições de cultura pode ser necessária. Finalmente, para garantir o rendimento de alta proteína, é fundamental que a célula pelotas são processadas imediatamente após a colheita, ou no prazo de 1−2 dias de armazenamento a-80 ° C.

A Lise adequada do centrifugado pelo sonication pulso é crítico para o sucesso da expressão da proteína sem célula e muitas vezes é o aspecto mais difícil do presente protocolo para novos usuários. Normalmente, uma pelota bem lisada produzirá um volume significativo de extrato líquido livre de detritos. O extrato deve ser ligeiramente viscoso, mas pode facilmente ser pipetado quando alíquotas em armazenamento tubos antes de flash congelamento em nitrogênio líquido. Figura 3 mostra uma representação de um pellet bem lisado (Figura 3A) em comparação com uma pelota mal lisada (Figura 3B) após a etapa de centrifugação de lise de post. Uma indicação importante de lise celular completa é uma célula bruta extrair proteína total concentração > 20 mg / mL, conforme determinado por um ensaio de proteínas totais (etapa 2.13). Sonication excesso ou aquecimento excessivo do extrato bruto de célula irá danificar a maquinaria celular, que não pode ser determinada sem executar uma reação celular livre. Assim, é altamente benéfico testar a eficiência do extrato com uma reação de controle antes de dedicar um tempo significativo e esforço para aplicações de expressão de proteínas a jusante. Enquanto otimização adicional pode ser necessária para equipamentos diferentes sonication, as etapas de pulso sonication descritas foram altamente reprodutíveis em nossas mãos.

O uso do modelo de DNA linear derivado do PCR amplificação, síntese de enzima de restrição ou síntese comercial gene pode aumentar significativamente a capacidade para a produção de proteína de alta produtividade e rápido na célula livre expressão sistemas²⁴. Enquanto a produção de proteína de modelo linear amplificada de PCR tem sido demonstrada, o rendimento destas reações são aproximadamente 13.5-fold inferior em comparação com reações utilizando plasmídeo modelo ADN às relações equimolar⁹. Isto é principalmente devido à instabilidade do modelo de DNA linear que é provável degradado por nucleases endógenas presentes no V. natriegens extrato bruto de célula. Enquanto do fago lambda que proteína GamS foi anteriormente usado para proteger o DNA Linear modelo de^24,25, verificou-se ser incompatível com V. natriegens extrai⁹. Além disso, enquanto aumentando a concentração de modelo linear de DNA pode permitir um maior rendimento de proteína, sua rápida degradação no extrato bruto celular ainda será um grande problema.

Uma solução para superar a degradação de modelo de DNA linear pode ser suplementar sem célula reações com gerados a partir de in vitro a transcrição de DNA linear do mRNA. Por outro lado, o uso de um inibidor de RNase oferece proteção significativa contra a degradação de transcrição do mRNA e proteína apreciável rendimentos podem ser obtidos no formato sem célula reação 10 μL (Figura 5AB). Clonagem de DNA linear em um modelo circular através da ligadura TA, clonagem de TOPO, montagem de Golden Gate ou outros métodos de recombinação podem ser utilizados para contornar a degradação de modelo. No entanto, novas abordagens para a inibição da atividade da nuclease será necessárias eficiente na expressão de proteínas utilizando modelo linear de DNA.

Até à data, foram propostas várias abordagens diferentes para preparação do extrato bruto de proteína celular livre expressão^9,10,11,26. No desenvolvimento deste protocolo, procuramos maximizar a acessibilidade dos utilizadores, reduzir o custo geral e minimizar etapas demoradas. Por exemplo, um rendimento de alta proteína é conseguido usando um processo de centrifugação-sonication duas etapas simples e não requer Homogeneizadores de célula, passos longos diálise ou reação de escoamento. É simples para executar em um curto período de tempo e não exige elevado nível de conhecimentos de laboratório. Assim, pode ajudar a facilitar a célula-livre expressão como um padrão para translação pesquisa acadêmica e projeto de processo industrial.

Este protocolo expande o toolkit, disponível para a investigação e a utilidade do V. natriegens, um organismo não-modelo com propriedades biológicas únicas. Maior rendimento de proteína pode ser conseguido empregando reações sem célula semi ou totalmente-contínua, para permitir a regeneração de energia, segundo de aminoácidos e a remoção de resíduos de produtos^3,5,27. Além disso, a engenharia do selvagem-tipo V. natriegens para produzir tensões de DNAse - ou RNAse-deficiente, remoção de vias metabólicas deletérias e concorrentes e expressão de tRNAs adicional podem aumentar consideravelmente a produção de proteínas em Este sistema^28,,²⁹. Como podemos desvendar a biologia subjacente a seu rápido crescimento, desenvolvimento de sistemas V. natriegens célula sem acelerar bioproduction recursos e permitir a expressão robusta de peptídeos terapêuticos e pequenas moléculas sintéticas materiais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 15 mL	Corning	352196
Tubos de 2 mL	Eppendorf	22363352
Placas de ensaio pretas de 384 poços	Corning	3544
Placas de PCR de 384 poços	Eppendorf	951020702
Tubos de 50 mL	Placas de PCR de	352070
Eppendorf		30129300
Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico sal de sódio monohidratado	Sigma	A6885
Adenosina 5'-trifosfato - 100 mM	NEB	N0450L
Termociclador de 384 poços Veriti da Applied Biosystems	de Ensaio 4388444		ThermoFisher
	BioRad MSB1001
β-Nicotinamida adenina hidrato de dinucleotídeo (NAD)	Sigma/Roche	10127965001
Coenzima A hidrato	Sigma	C4283
Citidina 5'-trifosfato - 100 mM	NEB	N0450L
D-(-)-3-Sal dissódico do ácido fosfoglicérico (3-PGA)	Sigma	P8877
Frasco Dewar - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
Solução de DL-Ditiotreitol - 1 M	Sigma	42816
Ácido folínico sal de cálcio hidratado	Sigma	47612
Ácido acético glacial	Sigma	A6283
Guanosina 5'-trifosfato - 100 mM	NEB	N0450L
HEPES	Sigma	H3375
Sal de hemimagnésio de ácido L-glutâmico tetrahidratado	Sigma	49605
Sal de potássio de ácido L-glutâmico monohidratado	Sigma	G1149
LB Caldo (Miller)	Sigma	L3522
Cloreto de magnésio (MgCl < sub > <2 / sub >)	Sigma	M8266
Plasmídeo pJL1-sfGFP	Addgene	69496
Plasmídeo Plus Maxi< / em> kit	Qiagen	12963
Poli(etilenoglicol) (PEG)-8000	Sigma	89510
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma	P9333
Pellets de hidróxido de potássio	Sigma/Roche	1050121000
Q125 Sonicator e sonda CL-18 com ponta de polegada	Qsonica	4422
RNA Clean and Concentrator Kit	Zymo	R1013
Inibidor de RNase, Amostrador de Aminoácidos Murino	NEB	M0314
RTS	Biotechrabbit	BR1401801
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma	S7653
Espermidina	Sigma	S0266
T7 RNA Polimerase	NEB	M0251
Solução Tris (pH 8,0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
tRNA de E. coli MRE 600	Sigma/Roche	10109541001
uridina 5'-trifosfato - 100 mM	NEB	N0450L
Vibrio natriegens (tipo selvagem) Liofilizado Stock	ATCC	14048