Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Resumo

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Resumo

A acumulação de evidências sugere que as propriedades moleculares e biológicas diferem nas células de melanoma cultivadas em vasos de cultura de tecido bidimensional tradicionais versus in vivo em pacientes humanos. Isto é devido à seleção de gargalo de populações clonais de células de melanoma que podem crescer de forma robusta in vitro na ausência de condições fisiológicas. Além disso, as respostas à terapia em culturas bidimensionais do tecido no geral não refletem fielmente as respostas à terapia em pacientes com melanoma, com a maioria dos ensaios clínicos não mostrar a eficácia das combinações terapêuticas mostradas para ser eficaz em Vitro. Embora o xenotransplantar de pilhas da melanoma em ratos forneça o contexto in vivo fisiológico ausente dos ensaios bidimensionais da cultura do tecido, as pilhas do melanoma usadas para o Engraftment têm-se submetido já à seleção do gargalo para as pilhas que poderiam crescer condições bidimensionais quando a linha celular foi estabelecida. As alterações irreversíveis que ocorrem como consequência do gargalo incluem mudanças nas propriedades de crescimento e invasão, bem como a perda de subpopulações específicas. Portanto, modelos que melhor recapitulam a condição humana in vivo podem melhor prever estratégias terapêuticas que efetivamente aumentam a sobrevida global de pacientes com melanoma metastático. A técnica paciente-derivada do xenograft (PDX) envolve a implantação direta de pilhas do tumor do paciente humano a um receptor do rato. Desta maneira, as pilhas do tumor são crescidas consistentemente tensões physiological in vivo e nunca submetem-se ao gargalo bidimensional, que preserva as propriedades moleculars e biológicas atuais quando o tumor estava no paciente humano. Notáveis, os modelos PDX derivados de sítios de órgãos de metástases (i.e., cérebro) exibem capacidade metastática semelhante, enquanto os modelos PDX derivados de pacientes com terapia ingênua e pacientes com resistência adquirida à terapia (i.e., terapia com inibidores BRAF/MEK) apresentam sensibilidade semelhante à terapêutica.

Introdução

Os modelos pré-clínicos são críticos para todos os aspectos da pesquisa translacional do câncer, incluindo a caracterização da doença, a descoberta de vulnerabilidades acionáveis exclusivas do câncer versus células normais e o desenvolvimento de terapias eficazes que exploram essas vulnerabilidades para aumentar a sobrevida global dos pacientes. No campo de melanoma, dezenas de milhares de modelos de linha celular têm sido amplamente utilizados para triagem de drogas, com > 4000 contribuíram pelo nosso grupo sozinho (série WMXXX). Estes modelos de linha celular foram derivados de pacientes com melanoma com várias formas de melanoma cutâneo (ou seja, propagação Acral, Uveal e superficial) e genótipos diversos (i.e., BRAF^V600-Mutant e neuroblastoma RAS viral oncogene homólogo [ Nras ^Q61R-mutante]), que abrangem o espectro da doença presente na clínica^1,2.

Inequivocamente, a estratégia de terapia mais bem sucedida e direcionada no campo de melanoma surgiu de 1) a caracterização genômica de tumores de pacientes identificando mutações BRAF em ~ 50% de melanomas³ e de 2) investigação pré-clínica Alavancando modelos de linha celular de melanoma⁴. A combinação do inibidor de BRAF/MEK era a administração do alimento e da droga (FDA)-aprovada em 2014 para o tratamento dos pacientes cujos os melanomas abrigam mutações de BRAF^V600E/K e vangloria-se de uma taxa de resposta de > 75%⁵. Apesar desta eficácia inicial, a resistência levanta-se ràpida em quase cada caso devido aos mecanismos intrínsecos e adquiridos múltiplas da resistência e à heterogeneidade intratumoral. Infelizmente, os modelos de linha celular não recapitulam a heterogeneidade biológica representativa quando cultivadas em cultura bidimensional em vasos plásticos, o que mascara seu potencial clinicamente preditivo quando os investigadores tentam determinar experimentalmente terapêuticas que possam ser eficazes em doentes com uma forma específica ou genótipo de melanoma⁶. Compreender como melhor modelar a heterogeneidade intratumoral paciente permitirá que os investigadores desenvolvam melhores modalidades terapêuticas que podem matar subpopulações terapia-resistentes que conduzem a falha às terapias atuais do padrão--cuidado.

Paramount para o valor preditivo limitado de modelos de linha celular é como eles são inicialmente estabelecidos. As alterações irreversíveis ocorrem na paisagem clonal do tumor quando uma suspensão da único-pilha do tumor de um paciente é crescida em vasos bidimensionais, plásticos da cultura do tecido, incluindo mudanças no potencial proliferative e invasor, a eliminação de específico subpopulações e a alteração da informação genética⁷. Os xenoenxertos em camundongos desses modelos de linhagem celular de melanoma representam a plataforma in vivo mais utilizada para estudos pré-clínicos; Entretanto, esta estratégia igualmente sofre da recapitulação pobre da heterogeneidade complexa do tumor observada clìnica. Para superar essa lacuna, tem havido um crescente interesse em incorporar modelos pré-clínicos mais sofisticados de melanoma, incluindo o modelo PDX. Os modelos PDX têm sido utilizados há > 30 anos, com estudos seminais em pacientes com câncer de pulmão demonstrando concordância entre a resposta dos pacientes aos agentes citotóxicos e a resposta do modelo PDX derivado do mesmo paciente⁸. Recentemente, houve uma movimentação para utilizar modelos de PDX como a ferramenta da escolha para investigações pré-clínicas na indústria e em centros académicos. Os modelos de PDX, por causa de sua recapitulação superior da heterogeneidade tumoral em pacientes humanos, são mais clinicamente relevantes para o uso em esforços de otimização terapêutica do que os xenoenxertos de linha celular⁹. No melanoma, há uns obstáculos imensos que contundem a gerência terapêutica da doença avançada¹⁰. Modelos PDX clinicamente relevantes têm sido utilizados para modelar a resistência clínica e identificar estratégias terapêuticas com agentes clinicamente disponíveis para o tratamento de tumores resistentes à terapia^11,12. Momentaneamente, o protocolo apresentado aqui para gerar modelos de PDX exige a implantação subcutaneous do tecido fresco dos melanomas preliminares ou metastáticos (coletados pela biópsia ou pela cirurgia) em camundongos do aceno/scid/IL2-receptor nulo (NSG). Diferentes variações na abordagem metodológica são utilizadas por diferentes grupos; Entretanto, um núcleo fundamental existe¹³.

Protocolo

Os seguintes protocolos de animais seguem as diretrizes do Comitê de ética humana do Instituto Wistar e diretrizes de cuidado animal.

1. coleção do tecido do tumor do melanoma

1. Colete o tecido tumoral (denominado passagem 0) de pacientes com melanoma por um dos seguintes métodos de cirurgia ou biópsia.
   1. Para a excisão cirúrgica do tecido, manter um mínimo de 1 g de tecido (resect metástases e lesões primárias) em meios de armazenamento de transporte (RPMI 1640 + 0,1% Fungizone + 0,2% gentamicina) a 4 ° c ou no gelo.
   2. Para o tecido cirúrgico da biópsia, mantenha menos de 1 g de tecido (muitas vezes punção biópsias de metástases subcutâneas [s.c.] e linfonodos [LN] metástases) em meios de armazenamento de transporte a 4 ° c ou no gelo.
   3. Para o tecido da biópsia do núcleo, lave para fora um cilindro (núcleo) do tecido de aproximadamente 10 milímetros x 1 milímetro (frequentemente, biópsias do fígado) em um tubo de 15 mL que contem 5 mL de meios do armazenamento do transporte em 4 ° c ou no gelo.
   4. Para o tecido aspirado fino da agulha (FNAs), mantenha uma quantidade muito pequena de tecido (menos de 1 milímetro no tamanho) tomado diretamente do paciente em uma agulha e em uma seringa em 4 ° c ou no gelo.
2. Entregue o tecido nos meios de armazenamento do transporte em 4 ° c ou no gelo no mesmo dia ou com transporte da noite após a excisão cirúrgica ou a biópsia. Processe o tecido dentro de 1-2 h de entrega.

2. processamento de tecido tumoral para implante de mouse

1. Excisão cirúrgica ou tratamento cirúrgico do tecido da biópsia
   1. Transfira o tecido para um prato de Petri estéril e separe o tecido tumoral do tecido normal circundante, tanto quanto possível.
   2. Remova o tecido necrótico (geralmente identificado como tecido pálido-esbranquiçado localizado centralmente dentro do tumor) do tumor remanescente, tanto quanto possível.
   3. Use um bisturi para subdividir um fragmento de tumor inicial em partes aproximadamente iguais (~ 3 mm x 3 mm) para implante de mouse cirúrgico (Figura 2).
   4. Opcionalmente, se o tecido tumoral suficiente estiver disponível, encaixe-congele o tecido para ensaios a jusante (sequenciamento de RNA [RNASeq], sequenciamento completo do exoma [WES], etc.).
   5. Faça uma pasta do tumor picando o tecido do tumor usando uma técnica transversal da lâmina com duas lâminas do bisturi. Mince os pedaços de tumor tão finamente quanto possível para formar uma pasta, que está agora pronto para implante de mouse cirúrgico.
   6. Alternativamente, se o tecido do tumor é demasiado duro para a dissociação mecânica, use um procedimento da dissociação da digestão para dar forma ao gel-como a pasta e uma suspensão da único-pilha para a implantação e/ou a injeção.
      1. Mince os pedaços de tumor tão finamente quanto possível para formar chorume.
      2. Coloque a pasta em um tubo de 50 mL com a solução de sal balanceada de Hank frio (HBSS)^-/- (sem CA^{+ +} e mg^{+ +}); Então, centrifugue e pellet em 220 x g por 4 min a 4 ° c.
      3. Ressuscite a pasta em 10 ml de meios de digestão frescos aquecidos (200 u/ml de colagenase IV + 5 mm de CAcl₂ + 50 u/ml de DNase em HBSS^-/-) por 1 g de tecido tumoral.
      4. Coloque o tubo num banho de água de 37 ° c durante 20 min e misture vigorosamente a cada 5 minutos com uma pipeta descartável.
      5. Lave com até 50 mL de HBSS^-/-; em seguida, centrifugue a 220 x g durante 4 min a 4 ° c.
      6. Adicionar 5 mL de TEG pré-aquecido (0, 25% tripsina + 40 μg/mL etileno glicol-bis (éter β-aminoetílico)-N, N, N ', n'-ácido tetraacético [EGTA] + 10 μg/mL de álcool polivinil [PVA]) por 1 g de tecido tumoral, Ressuspender suavemente/agitar, e colocar o tubo a 37 ° c por 2 min sem misturar.
      7. Adicione pelo menos 1 volume igual de meio de coloração a frio (1% de albumina sérica bovina [BSA] + 10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoesulfonic acid [HEPES] + 1x penicilina-estreptomicina em L15 Media) para saciar a tripsina e centrifugar a 220 x g durante 4 C.
      8. Ressuscite a amostra em 10 mL de meios de coloração por 1 g de tecido tumoral e filtrá-lo através de um filtro de células de 40 μm para obter uma suspensão de célula única para injeção de mouse (Figura 2).
      9. A pasta restante na parte superior do filtro da pilha pode igualmente ser coletada para a implantação cirúrgica do rato.
2. C processamento do tecido da biópsia do minério
   1. Despeje o tecido do cilindro do núcleo no tubo de transporte de tecido em um prato de Petri de 5 cm.
   2. Remover o excesso de líquido, raspar o tecido para a borda da placa de Petri, finamente picar o tecido tumoral, adicionar ~ 100 – 150 μL de HBSS^-/- em cima do tecido tumoral, e rapidamente desenhar a suspensão de tecido HBSS/tumor na seringa de 1 ml.
   3. Prenda uma agulha de 23 G à seringa de 1 mL, passe a suspensão do tecido HBSS/tumor através da agulha num tubo de rotação de 1,5 mL.
   4. Redesenhe a suspensão do tumor na seringa com a agulha ainda sobre até que possa passar suavemente através da agulha.
   5. Finalmente, extraia a suspensão tumoral de volta para a seringa e retire a agulha de 23 G.
   6. Fixe uma agulha de 27 G e desenhe um volume igual (~ 100 – 150 μL) de matriz extracelular artificial (ver tabela de materiais) na seringa.
   7. Adicione um volume igual de matriz extracelular artificial lentamente no tubo de rotação de 1,5 mL com o tumor/HBSS^-/- suspensão, evitando cuidadosamente a formação de bolhas.
   8. Desenhe uma última vez de volta para a seringa e o tecido do tumor de biópsia do núcleo está agora pronto para injeção de mouse.
3. Processamento de tecido da FNA
   1. Coloque a seringa que contém as amostras da FNA (presas na agulha) no gelo.
   2. Separe a agulha (contendo tecido FNA) da seringa e retire o êmbolo da seringa, adicione ~ 150 – 200 μL de HBSS^-/- para o topo da seringa.
   3. Volte a introduzir o êmbolo na seringa e na agulha (contendo o tecido da FNA) e empurre o HBSS^-/- através da agulha para um tubo de rotação de 1,5 ml. Esta etapa remove o tumor de FNA da agulha.
   4. Repita a etapa 2.3.3 com a suspensão de HBSS^-/-/Fna duas vezes usando a mesma seringa para maximizar a recuperação do tecido do tumor da agulha.
   5. Adicione um volume igual (~ 100 – 150 μL) de matriz extracelular artificial ao tubo de rotação de 1,5 mL contendo a suspensão HBSS/FNA.
   6. Misture adequadamente lentamente a retirada da suspensão da matriz extracelular artificial/HBSS^-/-/Fna de volta para a agulha de 23 G e repetindo duas vezes.
   7. Desenhe a totalidade da matriz extracelular artificial/HBSS^-/-/Fna volume de volta para a seringa, substitua a agulha de 23 g com uma agulha de 27 g, e a amostra de Fna está agora pronta para a injeção do rato.

3. implante e injeção de tumores em camundongos

1. Implante da excisão cirúrgica ou do tecido cirúrgico da biópsia
   Nota: Assegure-se de que todos os instrumentos cirúrgicos sejam estéreis por autoclavagem ou pelo uso de instrumentos descartáveis pré-esterilizados.
   1. Raspar o cabelo da parte inferior das costas do NSG 6-8 semana ratos machos ou fêmeas deixando uma área de aproximadamente 1,5 cm x 3 cm sem pêlos. Anestesie os camundongos usando isoflurano, e confirme apertando suavemente o pé como um teste de responsividade. Use a pomada veterinária em seus olhos para evitar a secura.
   2. Coloc ratos individuais em uma almofada de calor no cone do nariz da máquina da anestesia, esfregue a área raspada com Chlorhexidine. Em seguida, apagar com 70% etanol e deixe evaporar.
   3. Prepare pedaços ou divida o chorume do tumor em um prato de Petri em montes individuais para a implantação cirúrgica (isto é, em três montes iguais se para ser implantado em 3 ratos).
   4. Usando a lâmina de bisturi, faça uma incisão de aproximadamente 5 mm de comprimento no centro da parte de trás do mouse, pegue um par de fórceps e levante a pele no lado da incisão oposta ao operador.
   5. Tome a tesoura na outra mão e separe a pele da camada do músculo cortando delicadamente a membrana fascial com os cortes pequenos da tesoura, criando desse modo um "bolso" para o tecido do tumor.
   6. Pegue um pedaço de tumor ou um monte individual de tecido de chorume de tumor com a lâmina de bisturi e Coloque suavemente o tecido no bolso criado.
   7. Administrar 100 μL de matriz extracelular artificial no monte de tecido tumoral no bolso.
   8. Usando dois pares de fórceps, puxe acima a incisão em ambas as extremidades de modo que as bordas da ferida se aproximem junto, e feche a ferida aplicando um ou dois grampos da ferida.
   9. Subcutânea injetar 1-5 mg/kg de Meloxicam como um analgésico em camundongos após a cirurgia.
   10. Tire o mouse do cone do nariz e coloque-o de volta em sua gaiola original, observe o mouse enquanto acorda. Não volte a uma gaiola até que esteja totalmente recuperado.
   11. Remova os grampos da ferida após aproximadamente 7 dias. Se a cicatrização não estiver completa após 7 dias, deixe o clipe da ferida em um ou dois dias adicionais.
       Nota: se usando uma única suspensão da pilha da excisão cirúrgica ou do processamento cirúrgico do tecido da biópsia, misturará com a matriz extracelular artificial (na relação 1:1) para a injeção dos ratos.
2. Injeção de FNA ou tecido de biópsia de núcleo
   1. Coloque um mouse NSG em um rack de grade de aço, segure o mouse firmemente pela cauda, e puxe suavemente o mouse para trás. Ele vai agarrar a grade com as pernas dianteiras firmemente. Alternativamente, contenha um rato na mão não dominante e deixe a área do flanco visível.
   2. Desinfecte a pele do flanco com cotonetes de preparação de álcool, lentamente e firmemente injetar o conteúdo da seringa a pele do mouse.
   3. Retire a agulha e coloque o mouse de volta em sua gaiola.

4. Monitore o crescimento do tumor

1. Monitore camundongos uma vez por semana para verificar tumores palpáveis.
2. Uma vez que os tumores estão em um tamanho mensurável (aproximadamente 50 milímetros³), use um compasso de calibre para gravar dimensões do tumor. Use a seguinte fórmula para calcular volumes tumorais: (largura x largura x comprimento)/2.
3. Tumor de colheita uma vez que o volume do tumor atinge cerca de 1,5 cm³ (aproximadamente 4 – 10 semanas). O tumor é chamado agora passagem do rato 1 (MP1).

5. tumor de colheita para tecido bancário, reimplante e experimento/caracterização

1. Euthanize o rato em uma câmara do co₂ , verific sinais vitais para confirmar a morte, e submergir então o rato em uma solução de Virkon para esterilizar a pele por 30 s no bio-armário.
2. Use tesoura curvada e fórceps cirúrgico para levantar a pele adjacente ao tumor e fazer um corte horizontal.
3. Use uma técnica de separação sem corte para mobilizar a pele em ambos os lados do tumor e sobre o tumor, expondo o tumor.
4. Use uma tesoura ou uma lâmina de bisturi para separar o tumor da fáscia.
5. Resect o tumor e transfira o tumor a um prato de Petri estéril, corte o tumor em partes pequenas e remova o tecido Necrotic do tumor.
6. Tecido tumoral de banco para futura implantação.
   1. Leve 2-3 pequenas peças tumorais menores que ~ 10 mm x 10 mm e as mince em pedaços menores que ~ 1 mm x 1 mm.
   2. Transfira todo o tecido picado para um frasco criogênico de 2 mL, adicione 1 mL de meio de congelação (10% DMSO + 90% FBS).
   3. Misture bem e coloque frascos criogênicos em um recipiente de congelamento de células à base de isopropanol pré-resfriado em gelo seco.
   4. Armazene o recipiente em-80 ° c congelador durante a noite e transfira então frascos criogênicos ao armazenamento do nitrogênio líquido (LN₂).
7. Snap-Freeze tecido para ensaios a jusante (RNASeq, WES, etc.).
   1. Coloc partes do tecido do tumor (~ 3 milímetros x 3 milímetros) em um frasco criogênico e põr o frasco criogênico no LN₂ imediatamente. Armazene frascos para injetáveis em-80 ° c freezer.

6. ensaios de terapia PDX

Nota: tomará duas fases da expansão para crescer bastante tecido do tumor para gerar o número necessário de ratos do rolamento de PDX para o teste da terapia.

1. Pegare um CryoVial que contem o tecido bancados de PDX de ln₂, e coloc o CryoVial em um banho de água de 37 ° c até que os meios de congelação que contêm o tecido do tumor estejam começando apenas derreter.
2. Esvazie o conteúdo do CryoVial em HBSS pré-aquecido^-/- em um tubo de 50 ml, e lave o tecido.
3. Tecido da pelota por centrifugação por 5 min a 1.200 rpm.
4. Remova HBSS^-/- da amostra do tumor pela aspiração do vácuo com um Pipet de Pasteur.
5. Deslize o tecido PDX do tubo de 50 mL para um prato de Petri de 5 cm ou 10 cm e coloque no gelo molhado.
6. Siga o protocolo de implante acima para implantar o tecido bancados de um frasco criogênico em 5 camundongos NSG para a primeira rodada de expansão do tumor PDX.
7. Uma vez que os tumores alcangam ~ 600 – 800 milímetros³, colhem 1-2 tumores para começ uma única suspensão da pilha com o protocolo acima para o processamento do tecido do tumor: dissociação mecânico, procedimento da dissociação da digestão do colagenase.
8. Células da pelota e ressuscitar em 6 ml de HBSS^-/-/matriz extracelular artificial (proporção 1:1), injeção subcutânea ~ 50 camundongos NSG, com 100 μl de mistura celular por camundongo para a segunda rodada de expansão do tumor PDX.
9. Medir o tamanho do tumor com pinças quinzenal.
10. Aguarde um tamanho de tumor de ~ 100 mm³ em 3-5 semanas, Randomize camundongos em grupos, e iniciar o tratamento.
11. Quando o tamanho do tumor atinge o volume máximo aprovado pelo IACUC, interrompa o tratamento.
12. Siga o protocolo acima do tumor da colheita para coletar partes congeladas estalar do tumor, partes do tumor para blocos da parafina.

Resultados

Tecido tumoral para modelos de melanoma PDX pode vir de uma variedade de diferentes fontes e também pode ser processado por a dinâmica de crescimento de modelos individuais e o uso desejado do tecido PDX. A prioridade ao estabelecer um modelo PDX é ter material suficiente para o banco para uso futuro e DNA para caracterização (Figura 1).

Uma vez que o material suficiente é banked, o tecido do tumor pode ser expandido em um de três métodos principais para crescer b...

Discussão

Nós descrevemos nisto a geração de modelos de PDX do melanoma com o tecido paciente derivado dos tumores preliminares e metastáticos, das biópsias do núcleo, e dos FNAs. Quando engrafados diretamente em camundongos NSG, os tumores apresentam propriedades morfológicas, genômica e biológica semelhantes àquelas observadas no paciente. No caso em que apenas uma pequena quantidade de tecido está disponível para os investigadores, como muitas vezes ocorre com FNAs, a técnica PDX permite a expansão do tecido tumoral para DNA, R...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (sem Ca++ ou Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Tripsina	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL alíquotas armazenadas em – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Clorexidina	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Colagenase IV (2.000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	compõe em HBSS-/- a partir do estoque de pó de colagenase IV (Worthington #4189, u/mg indicado no frasco e varia de acordo com cada lote); congelar 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (etilenoglicol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N' Ácido N'-tetracético)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurano	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Mídia L15 de Leibovitz	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Matriz extracelular artificial
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisição # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, como analgésico
NOD/SCID/IL2-receptor nulo (NSG) Camundongos	The Wistar Institute, criação		de
PVA (álcool polivinílico)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Médio (Mod.) 1X com L-Glutamina	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Bisturi	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Clipes de ferida	MikRon	Cat #427631