Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Resumo

Os modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) mais robustamente recapitular características moleculares e biológicas da melanoma e são mais preditivos da resposta da terapia comparada aos ensaios cultura-baseados tradicionais do tecido plástico. Aqui nós descrevemos nosso protocolo de funcionamento padrão para o estabelecimento de modelos novos de PDX e a caracterização/experimentação de modelos existentes de PDX.

Resumo

A acumulação de evidências sugere que as propriedades moleculares e biológicas diferem nas células de melanoma cultivadas em vasos de cultura de tecido bidimensional tradicionais versus in vivo em pacientes humanos. Isto é devido à seleção de gargalo de populações clonais de células de melanoma que podem crescer de forma robusta in vitro na ausência de condições fisiológicas. Além disso, as respostas à terapia em culturas bidimensionais do tecido no geral não refletem fielmente as respostas à terapia em pacientes com melanoma, com a maioria dos ensaios clínicos não mostrar a eficácia das combinações terapêuticas mostradas para ser eficaz em Vitro. Embora o xenotransplantar de pilhas da melanoma em ratos forneça o contexto in vivo fisiológico ausente dos ensaios bidimensionais da cultura do tecido, as pilhas do melanoma usadas para o Engraftment têm-se submetido já à seleção do gargalo para as pilhas que poderiam crescer condições bidimensionais quando a linha celular foi estabelecida. As alterações irreversíveis que ocorrem como consequência do gargalo incluem mudanças nas propriedades de crescimento e invasão, bem como a perda de subpopulações específicas. Portanto, modelos que melhor recapitulam a condição humana in vivo podem melhor prever estratégias terapêuticas que efetivamente aumentam a sobrevida global de pacientes com melanoma metastático. A técnica paciente-derivada do xenograft (PDX) envolve a implantação direta de pilhas do tumor do paciente humano a um receptor do rato. Desta maneira, as pilhas do tumor são crescidas consistentemente tensões physiological in vivo e nunca submetem-se ao gargalo bidimensional, que preserva as propriedades moleculars e biológicas atuais quando o tumor estava no paciente humano. Notáveis, os modelos PDX derivados de sítios de órgãos de metástases (i.e., cérebro) exibem capacidade metastática semelhante, enquanto os modelos PDX derivados de pacientes com terapia ingênua e pacientes com resistência adquirida à terapia (i.e., terapia com inibidores BRAF/MEK) apresentam sensibilidade semelhante à terapêutica.

Introdução

Os modelos pré-clínicos são críticos para todos os aspectos da pesquisa translacional do câncer, incluindo a caracterização da doença, a descoberta de vulnerabilidades acionáveis exclusivas do câncer versus células normais e o desenvolvimento de terapias eficazes que exploram essas vulnerabilidades para aumentar a sobrevida global dos pacientes. No campo de melanoma, dezenas de milhares de modelos de linha celular têm sido amplamente utilizados para triagem de drogas, com > 4000 contribuíram pelo nosso grupo sozinho (série WMXXX). Estes modelos de linha celular foram derivados de pacientes com melanoma com várias formas de melanoma cutâneo (ou seja, propagação Acral, ....

Protocolo

Os seguintes protocolos de animais seguem as diretrizes do Comitê de ética humana do Instituto Wistar e diretrizes de cuidado animal.

1. coleção do tecido do tumor do melanoma

1. Colete o tecido tumoral (denominado passagem 0) de pacientes com melanoma por um dos seguintes métodos de cirurgia ou biópsia.
   1. Para a excisão cirúrgica do tecido, manter um mínimo de 1 g de tecido (resect metástases e lesões primárias) em meios de armazenamento de transporte (RPMI 1640 + 0,1% Fungizone + 0,2% gentamicina) a 4 ° c ou no gelo.
   2. Para o tecido cirúrgico da biópsia, mantenha menos de 1 g de tecido (muitas vezes punção biópsias d....

Resultados

Tecido tumoral para modelos de melanoma PDX pode vir de uma variedade de diferentes fontes e também pode ser processado por a dinâmica de crescimento de modelos individuais e o uso desejado do tecido PDX. A prioridade ao estabelecer um modelo PDX é ter material suficiente para o banco para uso futuro e DNA para caracterização (Figura 1).

Uma vez que o material suficiente é banked, o tecido do tumor pode ser expandido em um de três métodos principais para crescer b.......

Discussão

Nós descrevemos nisto a geração de modelos de PDX do melanoma com o tecido paciente derivado dos tumores preliminares e metastáticos, das biópsias do núcleo, e dos FNAs. Quando engrafados diretamente em camundongos NSG, os tumores apresentam propriedades morfológicas, genômica e biológica semelhantes àquelas observadas no paciente. No caso em que apenas uma pequena quantidade de tecido está disponível para os investigadores, como muitas vezes ocorre com FNAs, a técnica PDX permite a expansão do tecido tumoral para DNA, R.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (sem Ca++ ou Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Tripsina	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL alíquotas armazenadas em – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Clorexidina	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Colagenase IV (2.000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	compõe em HBSS-/- a partir do estoque de pó de colagenase IV (Worthington #4189, u/mg indicado no frasco e varia de acordo com cada lote); congelar 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (etilenoglicol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N' Ácido N'-tetracético)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurano	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Mídia L15 de Leibovitz	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Matriz extracelular artificial
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisição # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, como analgésico
NOD/SCID/IL2-receptor nulo (NSG) Camundongos	The Wistar Institute, criação		de
PVA (álcool polivinílico)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Médio (Mod.) 1X com L-Glutamina	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Bisturi	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Clipes de ferida	MikRon	Cat #427631

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