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Immunology and Infection

Étude de toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de Drosophila

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

Nous décrivons un protocole détaillé pour évaluer les profils toxicologiques des nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO NPs) en particulier, le type de mort cellulaire dans les fibroblastes pulmonaires HUMAINS MRC5 et la formation de ROS dans la mouche des fruits Drosophila.

Abstract

Les nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO NPs) ont un large éventail d'applications, mais le nombre de rapports sur la toxicité associée à ZnO NP a augmenté rapidement ces dernières années. Cependant, les études qui élucident les mécanismes sous-jacents pour la toxicité NP-induite par ZnO sont maigres. Nous avons déterminé les profils de toxicité des nP znO utilisant des modèles expérimentaux in vitro et in vivo. Une diminution significative de la viabilité cellulaire a été observée dans les fibroblastes pulmonaires MRC5 exposés au nP De ZnO, ce qui montre que les NP ZnO exercent des effets cytotoxiques. De même, il est intéressant de noter que l'intestin exposé aux nCp ZnO a montré une augmentation spectaculaire des niveaux d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans la mouche des fruits Drosophila. Des études plus approfondies sont nécessaires pour établir une évaluation des risques pour l'utilisation accrue des nP ZnO par les consommateurs.

Introduction

La nanotechnologie fait référence à l'application de matériaux nanométriques qui sont utilisés dans tous les domaines scientifiques, y compris la médecine, la science des matériaux et la biochimie. Par exemple, les NP ZnO qui sont connus pour leur diffusion ultraviolette, leur détection chimique et leurs propriétés antimicrobiennes, ainsi que pour leur conductivité électrique élevée, sont utilisés dans la production de divers produits de consommation tels que les emballages alimentaires, les cosmétiques, textiles, caoutchoucs, batteries, catalyseur pour le traitement du gaz de queue automobile, et applications biomédicales1,2,3.

Cependant, les applications naissantes des produits à base de NP ZnO, conduisant à une exposition accrue de l'homme aux nP ZnO, ont soulevé des préoccupations sur leurs effets néfastes potentiels sur la santé humaine. Un certain nombre d'études cellulaires in vitro ont démontré que les NP de ZnO peuvent induire le stress oxydatif, la cytotoxicité autophagie-connexe, l'inflammation, et la génotoxicité4,5,6,7,8 . Notamment, la toxicité des NP ZnO est supposée être causée par la dissolution de Zn pour libérer les ions Zn2, ainsi que la réactivité de surface de ZnO, résultant en déséquilibres ioniques et métaboliques cellulaires qui sont liés à l'homéostasie ionique altérée et un inhibition du transport ionique4,7,9,10. Fait important, des études ont montré que la génération d'espèces réactives d'oxygène (ROS) est l'un des mécanismes primaires sous-jacents à la toxicité associée à ZnO NPs. L'activité anti-oxydante insuffisante suivant l'insulte de ROS s'est avérée responsable de l'obtention de la cytotoxicité et des dommages d'ADN9. Les effets toxiques des NP ZnO ont également été signalés chez les modèles animaux, y compris le rongeur1, poisson zèbre11,12, ainsi que l'invertébré Drosophila13.

Drosophila sert de modèle animal alternatif bien établi pour le dépistage de la toxicité des entités chimiques et des nanomatériaux (NM)14,15. Fait important, il existe des niveaux élevés de similitude génétique et physiologique entre l'homme et la drosophile qui justifie l'utilisation de la drosophile comme modèle in vivo pour évaluer les réponses biologiques aux contaminants environnementaux tels que les NM 16. En outre, il y a beaucoup d'avantages d'utiliser Drosophila en raison de sa petite taille, de sa courte durée de vie, de son aptitude génétique et de son entretien facile et rentable. En outre, Drosophila a été largement adopté pour l'étude de la génétique, la biologie moléculaire et développementale, depuis que son génome complet a été entièrement séquencé il ya des années en 2000, ce qui le rend approprié pour une variété de dépistage à haut débit et pour s'attaquer aux questions biologiques non résolues17,18,19,20,21. Ces dernières années, un certain nombre d'études liées à l'immunotoxicité utilisant différents types de NP dans Drosophila ont été rapportés15,22,23,24. Ces nouvelles connaissances fondamentales obtenues à partir des études utilisant Drosophila ont contribué à fournir plus de perspicacité dans notre compréhension de la nanotoxicologie.

ROS est un coupable bien connu pour la cytotoxicité et la génotoxicité causées par les nP, en particulier, à base de métal NPs25. Les ROS sont des espèces chimiques contenant de l'oxygène avec des propriétés réactives plus élevées que l'oxygène moléculaire. Les radicaux libres tels que le radical superoxyde (O2-) et même, les molécules non radicales telles que le peroxyde d'hydrogène (H2O2) peuvent agir comme ROS. Dans l'état physiologique normal, ils sont tenus de maintenir l'homéostasie cellulaire26, cependant, ROS excessive en raison de la surproduction ou la dysrégulation du système de défense antioxydant peut causer un stress oxydatif, conduisant à des dommages aux protéines, lipides et acide désoxyribonucléique (ADN)27. Par exemple, à mesure que les niveaux de ROS augmentent et que le niveau de glutathion (GSH) diminue de façon concomitante, la perturbation de la synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP) a lieu et le niveau de déshydrogénase de lactate (LDH) augmente dans le milieu, aboutissant à la mort cellulaire27.

Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer des analyses cellulaires et génétiques utilisant les cellules cultivées de mammifères et Drosophila pour déterminer les effets défavorables potentiels des NPs de ZnO. Un aperçu de la méthode utilisée pour l'étude de toxicité des nP ZnO est montré dans la figure 1.

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Protocol

1. Analyse du tri des cellules activées par fluorescence (FACS) sur les cellules habitées/fixes

  1. Sonicate ZnO NPs en suspension pour 15 min.
  2. Préparer les nP ZnO à diverses concentrations (p. ex. 0, 10, 25, 50 100 et 200 g/mL) en utilisant une solution de stock NP ZnO de mg/mL pour le traitement des cellules cultivées.
  3. Seed MRC5 fibroblastes pulmonaires humains (1 x 105 cellules / puits) sur une plaque de culture de 6 puits par jour à l'avance, puis traiter les cellules avec 2 mL de ZnO NPs (en tripliques) pour 8 h, 16 h, et 24 h.
  4. À chaque moment, recueillir les cellules en centrifuge à 300 x g pendant 5 min.
  5. Laver les granulés cellulaires deux fois avec du phosphate salin tamponné (PBS).
  6. Resuspendre les cellules avec un tampon de liaison 1x, qui est composé de 0,1 M HEPES/hydroxyde de sodium (NaOH), 1,4 M de chlorure de sodium (NaCl), et 25 mM de chlorure de calcium (CaCl2), à une concentration de 1 x 105 cellules par 100 l.
  7. Ajouter 5 ll d'isothiocyanate de fluorécine (FITC) Tache d'annexe V et 5 l de tache d'ADN d'iodide de propidium (PI), et incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante (RT; 25 oC) dans l'obscurité.
  8. Rehaussez les échantillons avec un tampon de liaison de 400 l de 1x avant de trier les cellules par cytométrie d'écoulement. Un minimum de 10 000 cellules est analysé pour chaque échantillon.
  9. Tabulate le graphique à barres en utilisant l'intensité médiane obtenue.

2. Exposition des NP ZnO à Drosophila

  1. Ajouter 1 ml de nanoparticules à différentes concentrations en flacons, suivi de 9 ml d'aliments à mouchepour effectuer une concentration finale de 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ou 0,5 mg/mL De nPs ZnO.
  2. Mélanger les nanoparticules avec les aliments à fond dans les flacons à l'aide de la pipette.
  3. Laisser refroidir les aliments à la mouche contenant des nPs ZnO pendant au moins 2-3 h avant de les utiliser.
  4. Introduire des mouches mâles et femelles adultes dans les flacons pendant 5 jours, et leur permettre de s'accoupler et de pondre des œufs (qui apparaissent sous forme de taches blanches) à la surface de la nourriture.
  5. Enlever les mouches parentales et permettre aux œufs de subir un développement ultérieur, qui se compose de 4 stades de développement différents (stade embryonnaire, larvaire, pupal et adulte).

3. Dissection de la mouche

  1. Recueillir les larves d'instar tardives de 3rd dans la paroi des flacons pour les analyses. Les œufs fraîchement pondus se développent normalement en larves de3e étoiles après 72-120 h à RT.
  2. Nettoyer le plat de dissection et remplir le puits avec le milieu de dissection/PBS.
  3. Disséquer les larves (fin 3e instar) sous le stéréomicroscope, à l'aide d'une paire de forceps.
  4. Utilisez la pointe des forceps pour faire un petit trou et ouvrir la couche de cuticule des larves. Retirez soigneusement l'intestin et placez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant le milieu Drosophila de Schneider, avant l'étape de fixation en utilisant 1 ml de paraformaldéhyde (PF) de 4 %.
  5. 3.5Fixer l'intestin en PF pendant 10 min à RT, pour des expériences ultérieures, telles que l'immunostaining.

4. Détection DE ROS utilisant le Dihydroethidium (DHE) Staining

  1. Traiter les larves avec diverses concentrations de NP ZnO comme décrit à l'étape 2.1.
  2. Après la dissection de l'intestin de 3rd larves instar comme décrit sous la section 3, incuber l'intestin dans le milieu drosophila de Schneider à RT avant la coloration des tissus est effectuée. Dissoudre 1 l de colorant DHE (à partir de la concentration de stock de 30 mM) dans 1 ml du milieu de Schneider, ce qui fait une concentration de travail finale de 10-30 M de teinture DHE.
  3. Incuber l'intestin pendant 5 min à RT dans l'obscurité, puis laver trois fois en utilisant le milieu de Schneider pour chaque 5 min.
  4. Fixez l'intestin avec 4% PF (étape facultative) et montez l'intestin sur des lames de verre, avec le milieu de montage anti-fade contenant 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Capturez des images sous un microscope confocal.

5. Mesurer la fluorescence à l'aide du logiciel ImageJ

  1. Importer les images de fluorescence capturées acquises à l'aide de la microscopie par fluorescence ou de la microscopie à balayage au laser confocal dans le logiciel ImageJ.
  2. Cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez Mesures de set.
  3. Sélectionnez la mesure de sortie telle que l'intensité intégrée de la zone et la valeur grise moyenne.
  4. Cliquez sur Mesure.
  5. Sélectionnez une région sans fluorescence pour définir l'arrière-plan.
  6. Exportez les données dans la feuille de calcul Excel et déterminez la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF), en utilisant le calcul indiqué ci-dessous.
    CTCF - Densité intégrée - (Zone de la cellule sélectionnée X Fluorescence moyenne des lectures de fond)
  7. Construire un graphique à barres et effectuer une analyse statistique.

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Representative Results

Les cellules NP-exposées ont été traitées avec le kit de réactif de coloration de cellules, suivi s'est triant de cellules utilisant la cytométrie de flux. Les cellules traitées par ZnO NP (en bas, panneau droit) présentent un pourcentage plus élevé de cellules apoptotiques précoces (R3)/tardives (R6) que de cellules témoins (R5, panneau inférieur, gauche). La mort des cellules nécrotiques est indiquée par R4 (en haut, panneau droit) (Figure 2). Les résultats de l'analyse FITC/Annexin V sur les fibroblastes MRC-5 traités par ZnO NP sont présentés à la figure 2.

Pour les expériences Drosophila, des nP ZnO sonicated à diverses concentrations ont été ajoutés pour voler la nourriture dans des tubes de 10 ml et puis mélangés bien à l'aide d'un contrôleur de pipette (figure 3). Les larves inétoiles tardives recueillies à partir de flacons ont été disséquées sous le stéréomicroscope. Les larves ont d'abord été lavées pour enlever les restes de nourriture restante(figure 4). La couche externe de cuticule a été déchirée pour exposer des organes internes. L'intestin a été identifié par l'aspect long et semi-transparent caractéristique (alors que d'autres organes semblent opaques et jaunâtres légers sous le microscope) (Figure 5). L'intestin a été soigneusement enlevé, sans se casser, et transféré dans un nouveau tube de microcentrifuge contenant fixatif sur la glace (Figure 6).

Pour la quantitation de l'intensité de la fluorescence comme l'intensité de la sonde DHE dans l'intestin, les images ont été exportées en format JPEG ou TIFF et ouvertes avec le logiciel ImageJ. La partie de l'intestin pour l'analyse a été sélectionnée et identifiée, par exemple, la région de l'intestin moyen ou de l'intestin postérieur, et l'intensité de fluorescence de la région d'intérêt (ROI) a été mesurée. Pour comparer les intensités relatives des différents groupes expérimentaux, nous avons utilisé la même méthode quantitative de microscopie confocale décrite dans la section précédente. Pour la comparaison des intensités de fluorescence, le paramètre a été défini en utilisant le contrôle négatif non traité. Les calculs de l'intensité du signal sur la base des intensités d'étalonnage du contrôle non traité ont permis une comparaison directe entre les différents groupes expérimentaux. La figure 7 montre l'intensité moyenne du signal DHE dans l'intestin larvaire3e instar exposé à des nP ZnO à différentes concentrations. L'intestin des larves traitées avec 0,5 mg/mL de traitement ZnO NP a montré l'intensité de fluorescence la plus élevée.

Les différences d'intensité relative entre tous les groupes expérimentaux ont été davantage compilées, et une analyse statistique a été effectuée, fournissant des résultats qualitatifs et quantitatifs (figure 8).

Figure 1
Figure 1 : Aperçu de la méthode utilisée pour l'étude de toxicité des nP ZnO. Pour le travail in vitro, les cellules NP-traitées de ZnO ont été souillées avant l'analyse de cytométrie de flux. Pour le travail in vivo, l'intestin a été disséqué à partir de 3rd larves instar, suivie par la coloration avec la teinture DHE et l'acquisition d'image. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Parcelle de points de cellules séparées en différentes populations en fonction de leur coloration FITC et PE. Les pictogrammes montrent les résultats de l'analyse FITC/Annexin V avec 24 h de traitement de ZnO-NPs sur MRC-5. Une analyse statistique des cellules à différents stades peut alors être effectuée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Préparation d'un milieu d'aliments à mouche contenant du NP ZnO. (A) Les ingrédients pour la nourriture de mouche sont ajoutés à l'eau, laissés gonfler, et bouillis pendant 5 min. (B) Après refroidissement vers le bas à 50 oC avec l'agitation, Nipagin a été ajouté et mélangé complètement. (C) Préparer un mix maître pour les nanoparticules (volume total ne dépassant pas 10% du volume alimentaire final). (D) Le milieu est ensuite aliquoted, mélangé avec des NPs de ZnO à diverses concentrations et a permis de refroidir complètement avant le stockage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Toute la procédure de dissection intestinale. (A) Transférer 3larves instar sur un disque de dissection. (B) Utilisez des forceps pour tenir délicatement une larve, et (C) laver le reste de nourriture à l'aide de salin. (D) Déchirer doucement la cuticule sans toucher l'intestin et les autres organes internes. (E) Placez l'intestin dans la saline pour la procédure ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : L'anatomie du tube digestif/intestin. L'intestin extrait de la larve Drosophila est divisé en trois domaines distincts d'origine développementale différente, à savoir le gut, le midgut et l'arrière-gut. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Coloration du tissu intestinal avec dHE. (A) Préparer un mélange maître contenant le milieu de croissance et le DHE (une concentration finale de 30 M). (B) Ajouter le mélange maître dans le puits d'un disque de dissection. (C) Transférer le tissu intestinal disséqué dans le puits contenant le mélange maître DHE. (D) Incuber à RT pendant 5 min et protéger le tissu de la lumière; laver 3x en PBS/saline pendant 5min. (E) Fixer en 4% PF pendant 10 min; laver le tissu trois fois avec PBS (facultatif). (F) Transférer délicatement l'intestin sur une lame de verre, poser à plat sans avoir de tissu plié et monter avec le milieu de montage avant de couvrir avec du verre de couverture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7

Figure 7 : Les nP de ZnO induisaient le ROS dans l'intestin des larves de Drosophila. (a) Tache de DHE dans l'intestin de contrôle montre le niveau basal de ROS. (b et c) Les cellules intestinales traitées montrent une augmentation graduelle de l'intensité de la DHE d'une manière dépendante de la dose.  Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Quantitation des images fluorescentes à l'aide d'ImageJ. (A) Importer les images capturées. (B) Cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez les mesures de l'ensemble. (C) Sélectionnez l'intensité intégrée de la zone et la valeur grise moyenne. Sélectionnez une région sans fluorescence pour définir l'arrière-plan. (D) Exporter les données dans Excel et calculer le CTCF pour une analyse statistique ultérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Afin d'évaluer si ZnO NP peut induire l'apoptose dans les fibroblastes DE MRC5, nous utilisons la cytométrie de flux pour distinguer les cellules de la mort nécrotique ou apoptotique de cellules. Dans les cellules vivantes normales, la phosphatidylserine (PS) est localisée à la membrane cellulaire. En cas d'apoptose, PS est translogué dans le dépliant extracellulaire de la membrane plasmatique, permettant la liaison de l'annexe V étiquetée avec de la fluorescéine (FITC Annexin V)29. D'autre part, l'iodure de propidium rouge-fluorescent (PI), un colorant de liaison d'acide nucléique, est imperméable aux cellules vivantes et aux cellules apoptotic mais tache les cellules mortes30. Cela nous permet d'identifier les cellules mortes (rouge et vert), les cellules apoptotiques (fluorescence verte) et les cellules vivantes (peu ou pas de fluorescence), à l'aide d'un cytomètre d'écoulement avec la ligne de 488 nm d'un laser argon-ion pour l'excitation.

Pour la coloration DHE de l'intestin Drosophila, il est important de reconstituer le colorant avec DMSO juste avant de commencer l'expérience, comme le stockage prolongé peut conduire à une auto-oxydation du colorant qui transforme le colorant en couleur foncée / violacée31, 32. En outre, les solutions d'actions reconstituées ont également tendance à expirer assez rapidement, de sorte qu'il faut prêter attention à la «date d'expiration». Alternativement, des sondes fluorogéniques telles que la version verte de la sonde phototable, qui a la capacité supplémentaire d'être multiplexée avec des taches, et produit des signaux beaucoup plus clairs que DHE, pourrait être utilisé. L'intestin disséqué a été transféré au milieu de Schneider contenant le colorant à la concentration désirée sans qu'aucun fixatif n'ait été ajouté. Il s'agit de permettre l'incorporation du colorant dans les cellules vivantes, et donc la coloration est effectuée dans le milieu de la culture, pour permettre une meilleure respiration des cellules.

En ce qui concerne la quantitation de la coloration DHE, pour commencer, éviter la saturation des pixels dans les cellules contrôlées non traitées. Le logiciel d'imagerie a été utilisé pour déterminer le temps d'exposition en signalant visuellement les pixels saturés. L'échantillon non traité a été utilisé pour définir le temps d'exposition et maintenir les mêmes paramètres lors de la capture d'images pour la comparaison de l'intensité entre les différents groupes de traitement qui est important pour la quantification de l'intensité de l'image de fluorescence plus tard. Il est essentiel d'acquérir toutes les images (échantillons contrôlés et traités) en utilisant le même système et les mêmes paramètres/paramètres d'acquisition, et l'arrière-plan doit être normalisé pour toutes les images (de sorte qu'il y ait cohérence pour la soustraction de fond)33.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

L'étude a été appuyée par le numéro de subvention R706-000-043-490. L'étude ne représente pas le point de vue du promoteur de la subvention.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

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