Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

Resumo

Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.

Resumo

Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.

Introdução

A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica^1,2,3,4, comportamento celular^{5, 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}, e resistência aos antibióticos^10,

Protocolo

1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas

1. Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c.
2. Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios
   1. Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (Figura 1b (i)).
   2. Evacate o solvente orgânico pelo flux....

Resultados

Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade entre a sacarose (soluçã.......

Discussão

Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transferência de gotas

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bactotriptona	BD Biosciences	211705
Clorofórmio	Wako Pure Chemicals	032-21921
Vidro de cobertura (18 &vezes; 18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	espessura 0.13- 0,17 mm
Vidro de cobertura (30 &vezes; 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	espessura de pedido personalizado	0,25: centrífuga de mesa de 0,35 mm
	Hi-Tech Co.	ATT101	tipo rotor oscilante
Vedação de dupla face (10 &vezes; 10 &vezes; 1 mm)	Nitoms	T4613
Frasco de vidro	AS ONE	6-306-01	Tubo de fermentação Durham
Glicose	Wako Pure Chemicals	049-31165
Microscópio invertido	Olympus	IX-73
Metanol	Wako Pure Chemicals	133-16771
Sistema de estágio de aquecimento microscópico	TOKAI HIT	TP-110R-100
Óleo mineral	Nacalai Tesque	23334-85
Mini-extrusora	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidina	Thermo Fisher Scientific	31000
Lente objetiva	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranas de policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	tamanho dos poros 100 nm
câmera sCMOS	Andor	Zyla 4.2 mais
cloreto de sódio	Wako Pure Chemicals	191-01665
Sacarose	Wako Pure Chemicals	196-00015
Banho ultrassônico	COMO UM	EXTRATO DE LEVEDURA ASU-3D
	BD Biosciences	212750
Tubo de plástico com tampa de 0,6 mL	Watson	130-806C
Tubo de plástico com tampa de 1,5 mL	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotina-PEG-DSPE