É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

6.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 de abril de 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

Neste artigo

Resumo

Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.

Resumo

Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.

Introdução

A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica1,2,3,4, comportamento celular5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9, e resistência aos antibióticos10,11. Por causa dos avanços recentes nas técnicas da cultura, a cultura de únicas bactérias pode ser conseguida dentro de um espaço confinado, como em um poço-microplaqueta4, 7,8, gota de gel12,13 , e água-em-óleo (W/s) gota5,11. Para promover a compreensão ou a utilização de únicas pilhas bacterianas, uns desenvolvimentos técnicos mais adicionais de técnicas do cultivation são necessários.

As vesículas que imitam a membrana celular biológica são compartimentos esféricos consistindo de moléculas anfífilas e podem conter vários materiais. As vesículas são classificadas de acordo com o tamanho e incluem pequenas vesículas (SVs, diâmetro < 100 nm), grandes vesículas (LVs, < 1 μm) e vesículas gigantes (GVs, > 1 μm). SVs ou LVs são comumente usados como portadores de drogas por causa de sua afinidade com a membrana celular biológica14. Os GVS também têm sido utilizados como um sistema de reator para a construção de protocélulas15 ou células artificiais16. O encapsulamento de células biológicas em GVS foi relatado17,18, e assim o GVS mostra potencial como um sistema de cultura celular quando combinado com o sistema de reator.

Aqui, juntamente com um vídeo de procedimentos experimentais, descrevemos como os GVs podem ser usados como novos vasos de cultura de células19. GVs contendo bactérias foram feitas pelo método de transferência de gotas20 e, em seguida, foram imobilizados em uma membrana suportada em um vidro de cobertura. Utilizamos este sistema para observar o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVs em tempo real.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas

  1. Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c.
  2. Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios
    1. Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (Figura 1b (i)).
    2. Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para formar um filme lipídico e colocar o filme em um dessecador por 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico (Figura 1b (II)).
      Nota: É necessário evate o solvente orgânico em uma capa das emanações.
    3. Adicionar 200 μL de óleo mineral (0,84 g/mL, tabela de materiais) ao frasco para injetáveis de vidro (Figura 1b (III)).
    4. Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e a proceda num banho Ultrassônico (120 W) durante pelo menos 1 h (Figura 1b (III)). As concentrações finais de POPC e biotina-PEG-DSPE são de 1 mM e 0, 2 mM, respectivamente.
  3. Pré-cultura de células bacterianas
    1. Inocular e. coli em 1x lb médio (1 g de extrato de levedura, 2 g de triptona Bacto, e 2 g de cloreto de sódio em 200 ml de água deionizada) a partir de uma placa lb e incubar a 37 ° c por 12 – 14 h (durante a noite).
    2. Após a incubação, colete 20 μL da solução de cultura e transfira para 1,98 mL de meio fresco de 1x LB e cultive as células novamente por 2 h.
    3. Verifique a densidade óptica em 600 nm (OD600) valor da solução pré-cultura (preparada na etapa 1.3.2). Deve ser utilizada uma solução pré-cultura de OD600 = 1,0 – 1,5.
  4. Preparação das soluções aquosas exteriores e interiores de GVs
    1. Dissolver a glicose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa exterior de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de glicose de estoque (500 mM).
    2. Diluir a solução de glicose de estoque com 1x LB médio a 200 mM (tabela 1).
    3. Dissolver a sacarose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa interna de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de sacarose (500 mM).
    4. Misture a solução pré-cultura (OD600 = 1,0 – 1,5), a solução de sacarose (500 mm) e o meio 1x lb (tabela 1). O valor final do OD600 da solução da cultura deve ser 0.01 – 0,015 e a concentração final da sacarose deve ser 200 milímetros.
      Nota: Tome cuidado para evitar a pressão osmótica. É necessário equilibrar a concentração entre a solução aquosa interna e externa.
  5. Preparação de gotas de água-em-óleo (W/O) contendo células bacterianas
    1. Adicionar 2 μL da solução aquosa interna de GVs (preparada na etapa 1.4.4) a 50 μL da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com POPC e biotina-PEG-DSPE) em um tubo de plástico lidded 0,6 mL (Figura 1b (IV)).
    2. Emulsionar os dois componentes no tubo de plástico tocando o tubo com a mão (Figura 1b (v)).
  6. Formação de GVs contendo células bacterianas
    1. Adicionar 50 μL da solução aquosa exterior de GVs (preparada no passo 1.4.2) num tubo de plástico com tampa de 1,5 mL (Figura 1b (vi)) e suavemente camada 150 μl da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com popc e biotina-Peg-dspe) na superfície do aquoso exterior solução (Figura 1b (VII)). Incubar esta amostra à temperatura ambiente (RT, 25 ° c) durante 10 – 15 min. Verifique se a interface do óleo e das soluções aquosas está plana.
    2. Adicionar 50 μL da solução de gota W/O (preparada no passo 1.5.2) na interface do óleo e solução aquosa utilizando uma pipeta (Figura 1b (VIII)).
    3. Centrifugue o tubo plástico lidded de 1,5 mL (da etapa 1.6.2) por 10 minutos em 1.600 x g em RT em um centrifugador do desktop (Figura 1b (IX)). Após a centrifugação, aspirar o óleo (camada superior) do tubo plástico lidded 1,5-mL usando uma pipeta, e coletar os GVs que contêm pilhas bacterianas (Figura 1b (x)).

2. preparação de um sistema de observação GV (sistema de cultura de células bacterianas)

  1. Preparação de pequenas vesículas (SVs) para constructi ng a membrana de BICAMADA suportada
    1. Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (usando a mesma composição lipídica usada para a preparação de GV na etapa 1,1).
    2. Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para dar forma a um filme do lipido e coloc esta amostra em um exsicador para 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico.
    3. Adicionar 200 μL de glicose de 200 mM em meio de 1x LB (a solução aquosa externa de GVs) ao frasco de vidro.
    4. Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e proceda-lo em um banho ultra-sônico (120 W) para pelo menos 1 h.
    5. Prepare SVs pelo método de extrusão21 usando uma mini-extrusora e membrana de policarbonato com 100 nm tamanho dos poros.
  2. Preparação de uma câmara artesanal
    1. Perfure um furo de 7 mm com um perfurador oco em um selo de dupla face (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Cole o selo de dupla face com o furo em um vidro de cobertura (30 mm x 40 mm, espessura 0,25 – 0,35 mm).
  3. Preparação de uma membrana de BICAMADA suportada no vidro de cobertura no orifício da câmara
    1. Adicionar 30 μL da solução SV ao orifício da câmara (preparado na secção 2,2) e incubar na RT durante 30 min.
    2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
  4. Imobilização de GVs no membrana de BICAMADA suportada no vidro da tampa no furo da câmara
    1. Introduzir 10 μL de neutravidina com a solução aquosa exterior de GVs (1 mg/mL) no orifício e incubar na RT durante 15 min.
    2. Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.
    3. Adicionar todas as soluções contendo GVs (preparadas na etapa 1.6.3) no orifício da câmara e selar com um vidro de cobertura (18 mm x 18 mm, espessura 0,13 – 0,17 mm) (Figura 2b).
  5. Observação microscópica do crescimento de células bacterianas dentro de GVs
    1. Defina um sistema de estágio de aquecimento microscópico com um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de abertura numérica de 40x/0,6 (NA) com uma longa distância de trabalho (Figura 2b).
    2. Coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento microscópico (Figura 2b). Incubar os GVs contendo células bacterianas na câmara a uma condição estática de 6 h a 37 ° c.
    3. Capture e registre imagens do microscópio do crescimento bacteriano da pilha dentro de GVs cada 30 minutos usando uma câmera complementar científica do semicondutor do óxido metálico (sCMOS).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade entre a sacarose (soluçã...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transferência de gotas

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma iniciativa líder para excelentes pesquisadores jovens (líder, n º 16812285) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão, um subsídio de ajuda para a pesquisa de jovens cientistas (no. 18K18157, 16K21034) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) a m. s., e Grant-in-Aid de MEXT a K.K. (no. 17H06417, 17H06413).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BactotriptonaBD Biosciences211705
ClorofórmioWako Pure Chemicals032-21921
Vidro de cobertura (18 &vezes; 18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181espessura 0.13- 0,17 mm
Vidro de cobertura (30 &vezes; 40 mm)Matsunami Glass Ind.espessura de pedido personalizado0,25: centrífuga de mesa de 0,35 mm
Hi-Tech Co.ATT101tipo rotor oscilante
Vedação de dupla face (10 &vezes; 10 &vezes; 1 mm)NitomsT4613
Frasco de vidroAS ONE6-306-01Tubo de fermentação Durham
GlicoseWako Pure Chemicals049-31165
Microscópio invertidoOlympusIX-73
MetanolWako Pure Chemicals133-16771
Sistema de estágio de aquecimento microscópicoTOKAI HITTP-110R-100
Óleo mineralNacalai Tesque23334-85
Mini-extrusoraAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinaThermo Fisher Scientific31000
Lente objetivaOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranas de policarbonatoAvanti Polar Lipids610005tamanho dos poros 100 nm
câmera sCMOSAndorZyla 4.2 mais
cloreto de sódioWako Pure Chemicals191-01665
SacaroseWako Pure Chemicals196-00015
Banho ultrassônicoCOMO UMEXTRATO DE LEVEDURA ASU-3D
BD Biosciences212750
Tubo de plástico com tampa de 0,6 mLWatson130-806C
Tubo de plástico com tampa de 1,5 mLSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolinaAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)-2000]Avanti Polar Lipids880129PBiotina-PEG-DSPE

Referências

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Escherichia coliM todo de Transfer ncia de Got culasMembrana SuportadaImagem por MicroscopiaForma o de Ves culasEncapsulamento CelularCrescimento em Tempo Real
Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.