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Artigo de método

Medição das Taxas Potenciais de Redução de Nitrato Dissimlatório para Amônio Com base em 14NH4+/15NH4+ Análises via Conversão Sequencial para N2O

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DOI:

10.3791/59562

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7 de outubro de 2020

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1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Neste artigo

Resumo

Uma série de métodos para determinar a taxa potencial de DNRA com base em 14NH4+/15NH4+ análises é fornecida em detalhes. NH4+ é convertido em N2O através de várias etapas e analisado usando cromatografia de gás quadrupole-espectrometria de massa.

Resumo

A importância de entender o destino do nitrato (NO3−), que é a espécie N dominante transferida de ecossistemas terrestres para aquáticos, tem aumentado porque as cargas globais de nitrogênio aumentaram drasticamente após a industrialização. A redução do nitrato dissimlatório para o amônio (DNRA) e a denitrificação são processos microbianos que usam o NO3– para respiração. Em comparação com a denitrificação, as determinações quantitativas da atividade DNRA têm sido realizadas apenas em uma medida limitada. Isso levou a uma compreensão insuficiente da importância do DNRA no Nº3– transformações e os fatores reguladores desse processo. O objetivo deste artigo é fornecer um procedimento detalhado para a medição da taxa potencial de DNRA em amostras ambientais. Em suma, a taxa potencial de DNRA pode ser calculada a partir da taxa de acumulação de amônio com rótulo N 15NH (15NH4+) em 15NO3− incubação adicionada. A determinação das concentrações 14NH4+ e 15NH4+ descritas neste artigo é composta pelas etapas a seguir. Primeiro, o NH4+ na amostra é extraído e preso em um filtro de vidro acidificado como sal de amônio. Em segundo lugar, o amônio preso é elucido e oxidado para o Nº3- via oxidação persulfeto. Em terceiro lugar, o NO3− é convertido para N2O através de um N2O reductase denitrifier deficiente. Finalmente, o N2O convertido é analisado usando um sistema de espectrometria de gás quadrúpole previamente desenvolvido. Aplicamos este método aos sedimentos de pântanos salgados e calculamos suas potenciais taxas de DNRA, demonstrando que os procedimentos propostos permitem uma determinação simples e mais rápida em comparação com os métodos descritos anteriormente.

Introdução

A síntese artificial do fertilizante nitrogênio e sua aplicação generalizada têm perturbado muito o ciclo global de nitrogênio. Estima-se que a transferência de nitrogênio reativo de sistemas terrestres para costeiros dobrou desde o pré-industrial1. Uma porção significativa de fertilizantes aplicados a um determinado campo é levada do solo para rios ou águas subterrâneas, principalmente como nº3− 2. Isso pode causar problemas ambientais, como a poluição da água potável, a eutrofização e a formação de hipóxia. NO3− em ambientes hídricos é removido ou retido no ecossistema através de assimilação biológica e vários processos dissimlatórios microbianos. A denitrificação e a anammox são conhecidas por serem os principais processos de remoção microbiana para o NO3−. A denitrificação é a redução microbiana de produtosN− N gasoso (NO, N2O e N2) juntamente com a oxidação de um doador de elétrons, como substâncias orgânicas, reduzindo assim o risco dos problemas acima mencionados. A Anammox também produz N2 a partir de NO2− e NH4+; portanto, remove n inorgânico de um ecossistema. Por outro lado, a DNRA trabalha para reter n em um ecossistema; é geralmente aceito que o DNRA é realizado principalmente por bactérias fermentativas ou quimiotoautotróficas e que reduzem o dissimlatório NO3– à NH 4+4+ biodisponente e menos móvel.

Estudos sobre DNRA têm sido realizados principalmente em ecossistemas marinhos ou estuarinos, como sedimentos oceânicos ou estuarinos e água, solo salgado ou salgado e solo de manguezal. Ecossistemas costeiros ou marinhos são importantes como reservatórios para a remoção do Nº3– dos ecossistemas terrestres, e em estudos anteriores o DNRA tem se mostrado contribuinte em uma gama muito ampla de NO3− remoção (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Além disso, a existência do DNRA tem sido demonstrada em uma ampla gama de ambientes, incluindo ambientes de água doce19,solos de arroz20e solosflorestais 21. Embora esses estudos tenham demonstrado que o DNRA é potencialmente comparável à denitrificação para o NO3− remoção, os estudos que medem a atividade de DNRA ainda são muito limitados em comparação com aqueles que medem a denitrificação.

A taxa de DNRA foi avaliada utilizando-se 15técnicas de rotulagem N em conjunto com a análise de dados por meio de modelos analíticos ou numéricos. Uma solução analítica para calcular a taxa DNRA baseia-se no aumento do enriquecimento de 15N do pool NH4+ após a adição de 15NO3− como rastreador. 15 N-rotulado NO3− é adicionado a uma amostra e incubado, e a taxa de DNRA pode então ser calculada a partir da concentração e da razão isótopo alterações na NH4+ antes e depois de um determinado período de tempo. Neste artigo, um método para quantificar a concentração NH4+ e a razão isótopos, que são necessários para calcular a taxa de DNRA, é descrito em detalhes. Basicamente, o método aqui relatado é uma combinação de várias técnicas relatadas anteriormente22,23,24,25,26 com modificações adicionadas a alguns procedimentos. O método é composto por uma série de cinco procedimentos componentes: (1) incubação de uma amostra ambiental com a alteração de um rastreador de isótopos estáveis, 15NO3−, (2) extração e recuperação de NH4+ utilizando um "procedimento de difusão" com modificações, (3) oxidação persulfato de NH4+ na amostra, constituído por NH4+ e 15NH4+ derivados de 15NO3− via atividade DNRA, em NO3− e 15NO3−, (4) posterior transformação microbiana de NO3− e 1 5NO3− para N2O isotopomers através do método denitrifier modificado, e (5) quantificação dos isotopolímeros N2O usando cromatografia a gás espectrometria de massa (GC/MS). Na seção seguinte, primeiro, a preparação para procedimentos (2) e (4) é descrita e, posteriormente, todos os cinco procedimentos componentes são descritos detalhadamente.

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Protocolo

1. Preparação de um envelope PTFE para captura quantitativa de NHgasoso 3

  1. Coloque uma peça de 60 mm de fita politetrafluoroetileno (PTFE) (25 mm de largura) em uma pequena folha de papel alumínio (aproximadamente 300 mm x 450 mm de tamanho, limpa com etanol).
  2. Ash um filtro de fibra de vidro (10 mm de diâmetro com um tamanho de poros de 2,7 μm) a 450 °C por 4h em um forno de abafa. Coloque o filtro de fibra de vidro um pouco acima do ponto médio do eixo mais longo da fita(Figura 1a).
  3. Local 20 μL de 0,9-mol/L H2SO4 no centro de um filtro GF/D, e dobre imediatamente a fita PTFE usando duas pinças: pinças de selo de ponta plana e pinças retas. As etapas a seguir, as etapas 1.4-1.7, são mostradas na Figura 1 e devem ser conduzidas rapidamente.
  4. Gire a fita PTFE sobre o filtro GF/D na linha pontilhada mostrada na Figura 1a para formar a forma mostrada na Figura 1b.
  5. Sele ambos os lados dobrando e, em seguida, pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1c). Não pressione muito forte e não arranhe a fita PTFE.
  6. Dobre a extremidade aberta com a pinça e, em seguida, pressione a borda com a pinça(Figura 1d).
  7. Sele a extremidade aberta pressionando firmemente a borda com a pinça(Figura 1e). O filtro GF/D não deve ser pressionado durante este procedimento.

2. Preparando a biomassa de um denitrifier deficiente de óxido nitroso, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, para o método denitrifier

  1. Reúna um estoque de 20% de glicerol de pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 em 1/4 de força triptona caldo de soja (TSB). Incubar as placas a 25 °C durante 2-3 dias.
  2. Transfira uma colônia de solteiros de P. clororaphis para um pequeno tubo de ensaio contendo 5 mL de meio TSB autoclavado e cultura aerobicamente (sem tremer) por um dia a 25 °C no escuro até obter o crescimento máximo; isso será usado como a précultura.
  3. Transfira 3 mL da pré-cultura para uma garrafa 1-L com rolha de borracha de silício contendo 1 L de TSB modificado autoclavado recém-preparado complementado com 10 mmol/L KNO323. Incubar a garrafa enquanto agita usando um agitador em condições escuras a 25 °C. Depois de cultivar por 8h, substitua a rolha de borracha de silicone por uma tampa de parafuso e feche firmemente. Continue o cultivo em anoxia durante a noite.
  4. Centrifugar a cultura a 18.800 x g por 15 min a 4 °C para obter pelotas de biomassa.
  5. Lave a biomassa embalada três vezes com 30 mL da solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), para eliminar completamente o Nº3−. As condições da centrifugação são as mesmas do passo 2.3.
  6. Após a lavagem, suspenda a biomassa embalada com 30 mL de D-PBS(-). Use 1 mL da suspensão para determinar a densidade celular medindo OD600. Alíquotas pipetas de 1 mL da suspensão restante em criovials estéreis contendo 0,8 mL de 45% de glicerol. Preservar os estoques de glicerol preparados a −80 °C até usar (ver seção 6).

3. Eliminação de oxigênio, nitrito e nitrato do sedimento amostral

  1. Pesar 3,0 g (peso molhado) de sedimento em um frasco de vidro de 20 mL e adicionar 9,0 mL de água superficial para suspendê-lo (25% c/w chorume).
  2. Sele o frasco com uma rolha de borracha butil preta (lavada com água trocada por íons e esterilizada via autoclaving) e uma tampa de alumínio.
  3. Purgue a suspensão e substitua o ar do headspace por Ar (>99,99%) a 0,6 L/min por 20 min usando um coletor.
  4. Substitua o gás ar headspace por ultra-puro (>99,99995%) Ele aspirando por 90 s e cobrando Ele por 30 s. Repita este procedimento quatro vezes. Coloque a pressão do gás na cabeça para 1,5 atm.
  5. Incubar os frascos a 20 °C durante a noite com agitação a 150 rpm em condições escuras usando um agitador de temperatura constante para eliminar o restante do oxigênio, nitrato e nitrito na suspensão de sedimentos e gás headspace.

4. Experiência de curso de tempo para determinar a taxa de DNRA

  1. Substitua o gás do espaço da cabeça por ultra-puro fresco Ele usando o mesmo procedimento que na etapa 3.5, mas sem as quatro repetições.
  2. Adicione substratos rotulados e não rotulados a cada frasco de acordo com a Tabela 1 através da rolha de borracha butil usando uma seringa gastight. Purigue as soluções de substrato previamente preparadas em frascos de vidro de tamanho adequado usando he ultra-puro com a pressão do headspace definida para 1,5 atm para evitar contaminação do ar. Evite a injeção não intencional de qualquer quantidade de ar durante os procedimentos de injeção.
  3. Incubar frascos a 20 °C com agitação a 150 rpm. Adicione os substratos a cada frasco de acordo com a Tabela 1 e incubar por 1h, 3 h e 5h. Após a paralisação da incubação, sujeito a suspensão de sedimentos nos frascos aos seguintes procedimentos: etapas 4.4-4.9.
  4. Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl de cada frasco. Em seguida, adicione KCl (ashed a 450 °C por 4 h) à suspensão de sedimentos até uma concentração final de aproximadamente 2 mol/L para garantir a recuperação de NH4+ do sedimento. Feche os frascos com uma rolha de borracha butyl e um fechamento de alumínio.
  5. Agite o sedimento a 150 rpm por 1h a 4 °C em condições escuras para extrair o NH4+.
  6. Transfira toda a suspensão de sedimentos no frasco para um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL e centrífuga a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
  7. Enxágüe a parede interna de uma seringa descartável de 10 mL recém-aberta e anexe-a a um filtro de membrana de acetato de celulose descartável recém-aberto (tamanho de poros 0,22 μm, 25 mm de diâmetro). Em seguida, enxágue o filtro de membrana com 1 mL de supernasal. Coloque a unidade de filtro de seringa enxaguada em uma garrafa de polipropileno de boca larga (PP) de 20 mL.
  8. Filtre o restante sobrenante através de um filtro de membrana de acetato na garrafa PP de 20 mL. Armazene os extratos a −20 °C até uma análise mais aprofundada.

5. Captura de NH4+ em 2M H2SO4 absorvido ao filtro GF/D no envelope PTFE e a oxidação persulfato de NH4+ a NO3−

  1. Prepare soluções padrão de 14NH4Cl com gradientes de concentração de 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L e 500 μmol/L. Para a análise da razão de 15N, fixar a concentração total de NH4+ a 200 μmol/L e preparar as relações de isótopos de 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, e 10:90 com soluções padrão puras 14NH4Cl e 15NH4Cl.
  2. Transfira 30 mg de MgO (cinzas a 450 °C por 4 h) para um frasco de vidro de 20 mL e coloque o envelope PTFE no frasco.
  3. Transfira 5 mL de uma amostra ou padrão para o frasco contendo o MgO e o envelope PTFE, e feche imediatamente com uma rolha de borracha de butyl cinza. Vedação com uma tampa de alumínio. Se a concentração de NH4+ for esperada para exceder 500 μmol/L, diluir a amostra para abaixo de 500 μmol/L.
  4. Agite os frascos a 150 rpm por 3h a 4 °C em condições escuras.
  5. Remova a tampa de alumínio e a rolha de borracha butyl. Tire o envelope PTFE do frasco usando pinças pontiagudas, enxágue completamente o envelope e a pinça com água trocada por íons, limpe-os com um papel de limpeza e, em seguida, coloque o envelope em um papel de limpeza fresco.
  6. Abra o envelope PTFE com um par de pinças (o uso da pinça de ponta plana e ponta é recomendado) na ordem exata de ordem inversa do dobrável realizado nas etapas 1.4-1.7.
  7. Segure a área periférica do filtro GF/D, onde o H2SO4 deve ser desvendado, com a pinça de ponta plana, e transfira-a para um tubo de ensaio de tampa de parafuso de 11 mL com uma tampa forrada com PTFE. Enxágüe as pinças com água trocada por íons e limpe-as com papel de limpeza.
  8. Repita as etapas 5.5-5.7 para os envelopes restantes.
  9. Adicione 1 mL de água trocada de íons a cada um dos tubos de ensaio, feche a tampa do parafuso e mantenha-a sem tremer por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente para elutar completamente o NH4+ do filtro GF/D. Durante esta etapa, realize a etapa seguinte (etapa 5.10) em paralelo.
  10. Prepare o reagente persulfate-oxidante (POR)25,26.
    1. Como não pode ser armazenado, prepare a quantidade exata de POR necessária para o tratamento de um único dia de amostras.
    2. Para preparar o POR para tratar 50 amostras, despeje 100 mL de água trocada por íons em uma garrafa de tampa de parafuso de 200 mL e adicione 1,52 g de NaOH (grau de análise composto de nitrogênio), 3 g de ácido bórico e 5 g de K2S2O8 (grau de análise de nitrogênio e fósforo) nessa ordem. Imediatamente após adicionar cada reagente, agite a solução até que ela seja completamente dissolvida.
    3. Se necessário, mergulhe a garrafa em água morna para ajudar na dissolução dos produtos químicos; no entanto, deve-se prestar atenção em relação à contaminação do Nº3– porque a água da torneira normalmente contém o Nº3−.
  11. Após a etapa 5.8, abra a tampa do parafuso, adicione 2 mL do reagente POR ao tubo de ensaio e feche o tubo firmemente com uma tampa de parafuso para evitar qualquer perda ou contaminação durante as etapas seguintes.
  12. Coloque os tubos de ensaio em um rack, enrole-os em papel alumínio de duas camadas e autoclave-os por 1h a 121 °C. Mantenha os tubos em posição vertical durante esta etapa e evite mudanças rápidas de temperatura após o término do autoclaving.

6. Determinando o NO3− convertido a partir de NH4+ pelo método denitrifier usando quadrupole GC/MS

  1. Misture 100 mL de tampão fosfato estéril de 40 mmol/L (pH 7,2) e 100 mL de glicose estéril de 30 mmol/L asepticamente (fosfato de 20 mmol/L e glicose de 15 mmol/L; final).
  2. Adicione um volume de 1/7,2 volume de estoque de glicerol de C. clororaphis a 200 mL da solução de glicose tamponada com fosfato em um frasco de Erlenmeyer de 300 mL, e purga com um He ultra-puro (>99,995%) fluxo por 1 h.
  3. Dispense 2,0 mL da suspensão denitrifier em cada frasco de 5 mL. Tampe os frascos com uma rolha de borracha de butyl cinza e um fechamento de alumínio.
  4. Substitua o ar da cabeça por he ultra-puro, aspirando por 3 minutos e carregando o He por 1 min. Coloque a pressão positiva do gás do headspace para 1,3 atm para evitar contaminação de ar não intencional.
  5. Injete 1 mL de uma amostra ou padrão através da rolha de borracha butil usando uma seringa descartável de 1 mL. Note a quantidade exata da amostra injetada.
  6. Incubar os frascos durante a noite a 25 °C em condições escuras.
  7. Injete 0,3 mL de 6-mol/LL NaOH para parar a denitrificação e absorver o CO2do headspace, o que de outra forma perturbará seriamente a análise N2O por GC/MS porque o CO2 e o N2O têm o mesmo peso molecular.
  8. Determine as quantidades de 44N2O, 45N2O e 46N2O no gás headspace usando quadrupole GC/MS com uma porta de injeção modificada25. As condições de funcionamento utilizadas para a análise GC/MS estão mostradas na Tabela 2.

7. Análise de dados

  1. Derivar a curva de calibração para o NH4+ concentração da relação linear entre a concentração conhecida de 14NH4+ e as intensidades de sinal medidos do total produzido 44N2O + 45N2O + 46N2O. Derivar a curva de calibração para o teor de 15N da relação linear entre o átomo conhecido% (ou seja,. 15N/14N+15N) e o átomo calculado% usando uma equação previamente fornecida27. Calcule a concentração de 15NH4+ multiplicando o total de NH4+ pela razão de 15N de NH4+.
  2. Calcule a taxa potencial de DNRA usando equações fornecidas em outros lugares28,,29,30.

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Resultados

Os resultados representativos apresentados neste artigo foram derivados de 15experimentos de rastreamento n de sedimentos de pântanos salgados. O pântano de sal amostrado foi recentemente criado após o Grande Terremoto do Japão Oriental de 2011 na área de Moune da cidade de Kesen-numa, na província de Miyagi, japão. Em setembro de 2017, sedimentos superficiais (0-3 cm) foram coletados em dois locais nas zonas subtidal e intertidais. Primeiro, logo após a coleta, o sedimento foi...

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Discussão

A razão de concentração e isótopo de NH4+ para a análise DNRA foi quantificada utilizando vários métodos. As concentrações e as relações de isótopos de NH4+ são geralmente medidas separadamente. A concentração NH4+ é tipicamente medida usando métodos colorimétricos, incluindo um autoanalyzer4,10,15,16,

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Naoto Tanaka por ajudar na coleta de dados e desenvolver o protocolo. A coleta de amostras foi apoiada pelo JSPS KAKENHI Grant Número 17K15286.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
Garrafa de PP de 20 mLSANPLATEC61-3210-18de boca larga
Maruemu1307-13No. 20, com orifício
ÁcidobóricoWako021-02195
CentrífugaHITACHIHimac CR21G II
Pressão de Gás Desoxigenado & Substitua o injetorSANSIN INDUSTRIALIP-12
Filtro de membrana de acetato de celulose descartávelADVANTEC25CS020ASTamanho do poro 0,22 µ m, 25 mm de diâmetro
Seringa descartávelTermoSS-10SZde 10 mL
TermoSS-01T1 mL
Dulbecco' s Fosfato Tampolado com Solução Salina (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Seringa à prova de gásVICI Valco Instruments4075-15010Série A-2, 100 µ L
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm de diâmetro
Frasco de vidroMaruemu0501-0620 mL
Rolha de borracha butílica cinzaMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Reagente Garantido
K2S2O8Wako169-11891 Grau deanálise de nitrogênio e fósforo
KClWako163-03545Reagente garantido
KNO3Wako160-04035Reagente garantido
NaOHWako191-08625 Grau deanálise de compostos de nitrogênio
NH4ClWako017-02995Reagente Garantido
Tubo de centrífuga de plásticoASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Liofilizado, a cepa tipo de Pseudomonas aureofaciens
Fita de vedação PTFESigma-AldrichZ22188025 mm de largura
Agitador alternativoTAITEC0000207-000NR-10
Tubo de ensaio com tampa de roscaIWAKI84-025211 mL
Tampa revestida com PTFE para tubo de ensaioIWAKI84-0262
Caldo de soja trípticoDifco Laboratories211825
Tampa de alumínio Seringa descartável

Referências

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