Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Resumo

SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.

Resumo

Aqui nós estamos apresentando um método novo estudar a sumoilação das proteínas e sua localização Subcellular em pilhas de mamíferos e em oocytes do nematóide. Este método utiliza um fragmento de proteína de SUMO-aprisionamento modificado recombinante, kmUTAG, derivado do Ulp1 SUMO protease da levedura de brotamento tolerante ao estresse Kluyveromyces marxianus. Nós adaptamos as propriedades do kmutag com a finalidade de estudar a sumoilação em uma variedade de sistemas modelo sem o uso dos anticorpos. Para o estudo de SUMO, KmUTAG tem várias vantagens quando comparada com abordagens baseadas em anticorpos. Este reagente stress-tolerante do SUMO-aprisionamento é produzido recombinantly, reconhece isoformas de SUMO nativos de muitas espécies, e ao contrário dos anticorpos comercialmente disponíveis mostra a afinidade reduzida para o SUMO livre, Unconjugated. Os resultados representativos mostrados aqui incluem a localização de conjugados de sumo em pilhas da cultura de mamíferos do tecido e em oocytes do nematóide.

Introdução

A finalidade deste método é facilitar o estudo e a análise de proteínas SUMO-conjugadas usando a proteína recombinante de SUMO-trapping UTAG ( etiquetado domínio deULP). Como detalhado abaixo, UTAG pode ser usado no lugar de outros reagentes e aproximações para purify, detecta, e visualiza proteínas SUMO-modificadas. Dependendo das condições de crescimento, as células podem conter centenas ou milhares de proteínas que são modificadas com cadeias sumô ou SUMO (para revisão ver Kerscher et al. 2006 e kerscher 2016²). Isto representa uma dificuldade considerável para as análises funcionais de proteínas de sumo-modificadas específicas, especialmente porque somente uma fração de um alvo particular da sumoilação é modificada realmente³. Além de seus papéis em processos celulares essenciais, tais como regulação transcricional, homeostase protéica, a resposta ao estresse celular, e remodelação da cromatina durante a mitose e meiose; tornou-se agora suficientemente desobstruído que o sumo, as proteínas sumo-modificadas, e os componentes do caminho do sumo igualmente têm o potencial como biomarcadores para patologias tais como o cancro e desordens neurodegenerativas^{4,5,6 ,7}. Isso ressalta a necessidade de ferramentas robustas, confiáveis e prontamente disponíveis e abordagens inovadoras para a detecção e análise funcional de proteínas SUMO-modificadas em uma variedade de células e amostras.

Em muitos sistemas, os anticorpos de sumo-específicos são os reagentes da escolha para a deteção, a isolação e as análises funcionais deproteínas sumo-modificadas^8,9. Entretanto, alguns anticorpos sumô-específicos comercialmente disponíveis são caros, limitados em quantidade ou disponibilidade, propensos a expor afinidades e reatividade cruzada de forma descontroladamente variável e, em alguns casos, falta de reprodutibilidade¹⁰. Uma abordagem alternativa é a expressão do epítopo mapeado-Tagged sumo em células transformadas e organismos, mas ligando epítopo Tags para sumo pode artificialmente diminuir a sua conjugação de alvos de proteínas¹¹. Adicionalmente, os epítopos não são úteis quando as células ou tecidos não transformados são avaliados.

Ulp1 é uma protease de SUMO conservada de S. cerevisiae que processa o precursor de sumo e desumoylates proteínas CONJUGADAS com sumo-¹². Nós desenvolvemos o reagente de utag baseado na observação serendipitous que uma mutação da cisteína catalítica (C580S) em Ulp1's sumo que processa ULP domínio (UD) não somente impede a segmentação de sumô mas igualmente prende proteínas sumo-conjugadas com a elevação avidez¹². Para simplificar, nós nos referimos a este fragmento carboxy-terminal SUMO-aprisionamento Ulp1 (C580S) como UTAG (abreviada para UD TAG). UTAG é uma proteína de aprisionamento de Pan-SUMO recombinante que representa uma alternativa útil aos anticorpos anti-SUMO utilizados para o isolamento e detecção de proteínas SUMO-modificadas. Importante, ele especificamente reconhece nativamente dobrado, conjugada sumo e não apenas um ou vários epítopos no sumo. Para melhorar a estabilidade da proteína e a força obrigatória de SUMO de UTAG, nós geramos uma variação de UTAG do fermento stress-tolerante Kluyveromyces marxianus (quilômetro). A KmUTAG liga firmemente os conjugados sumô com a afinidade nanomolares¹³. Adicionalmente, kmUTAG é resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes redutores (5 mM TCEP-tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina), desnaturantes (até 2 M de ureia), agentes oxidantes (0,6% de peróxido de hidrogênio) e detergentes não iônicos. Esta tolerância ao stress é benéfica durante a condição de purificação dura e tempos de incubação prolongados, assegurando a sua estabilidade e atividade de captura de sumô. Não surpreendentemente, no entanto, a atividade do KmUTAG SUMO-trapping é incompatível com reagentes modificadores da cisteína, detergentes iônicos e extratos proteicos totalmente desnaturados. A afinidade e as propriedades notáveis de KmUTAG indicam que este reagente pode se tornar parte do repertório padrão para o estudo de proteínas sumoylated em espécies múltiplas.

Aqui nós fornecemos um método simples para detectar proteínas sumo-modificadas em pilhas de mamíferos e nematóides usando uma proteína de fusão fluorescente mcherry-kmutag de recombinação (kmutag-FL).

Protocolo

1. detecção de SUMO em células de cultura de tecido fixo usando proteína recombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping

1. Cresça as pilhas da cultura do tecido da escolha na tampa redonda de 22 milímetros desliza em placas do TC de 6 poços até 70%-80% confluent. Realize as etapas 1.2 – 1.8 na placa de 6 poços.
2. Lave brevemente as células com 1 mL de DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)
3. Para fixação, prepare uma solução fresca de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) (diluída em DPBS). Para corrigir células, adicione 2 mL 4% PFA em DPBS a cada poço. Incubar as células por 20 min em temperatura ambiente. Nota: todas as etapas que usam PFA devem ser executadas em uma capa de segurança do laboratório e o PFA deve ser descartado corretamente.
4. Lave as células fixas 3x em 1 mL DPBS enquanto nutating a placa, 5 min cada lavagem.
5. Para permeabilizar as células, incubar por 15 min com 0,1% Triton X-100 em DPBS
6. Lave as células 3x em 1 mL DPBS enquanto nutating a placa, 5 min cada lavagem
7. Incubar as células com 500 μL de 0,1 M de Glycine-HCl (pH 2,0) por 10 s, em seguida, neutralizar o pH imediatamente com 500 μL de 10x sumo protease buffer (SPB).
8. Lave as células 3x em 1 mL DPBS enquanto a placa de nutating, 5 min cada lavagem
9. Retire as lamínulas do poço e coloque-as numa câmara de humidade. Em seguida, proceder com incubações na lamínula da seguinte forma:
   1. Para a coloração UTAG-FL apenas: misturar 1 μg UTAG-FL com 100 μL de 1x SPB contendo 5 mM de TCEP num tubo, pipetar a mistura para as células da lamínula e incubar à temperatura ambiente durante 1 h na câmara de humidade.
   2. Opcionalmente, para o UTAG-FL e a co-mancha do anticorpo anti SUMO1, prossiga com o seguinte:
      1. Misture em um tubo 1 μg UTAG-FL e 0,5 μL SUMO2/3 8A2 (obtidos para estudos de desenvolvimento hybridoma Bank⁹) com 100 μl de tampão de bloqueio, pipetar a mistura na lamínula e incubar na temperatura ambiente durante 1 h.
      2. Lave as células na lamínula 3 vezes com 200 μL DPBS, 5 min cada lavagem.
      3. Misture em um tubo 0,5 μL anti-rato Alexa fluor 488 anticorpo conjugado com 100 μL tampão de bloqueio, pipetar a mistura na lamínula e incubar na temperatura ambiente durante 1 h.
10. Para lavar as lamelas, pipetar 200 μL DPBS em cada lamínula e deixar no lugar durante 10 min. Repita a lavagem mais 2 vezes.
11. Retire a lamínula da última lavagem e inverta-a numa lâmina de microscopia pré-limpa com uma gota de suporte de montagem (ver tabela de materiais).
12. Armazene durante a noite em um congelador de-20 ° c antes de ver o microscópio. Visualize usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e Alexa fluor 488 (se for realizada a cocoloração opcional SUMO2/3).

2. detecção de SUMO em gônadas de nematódeo fixas usando UTAG-FL

1. Transferir hermafroditas adultas para uma gota de 8 μL de tampão de ovo¹⁴ em um slide com carga de adição que foi revestido com poli-L-lisina. Solte as gônadas dos vermes usando 27,5 agulhas G. Proceder com rotulagem de anticorpos ou rotulagem UTAG-FL.
2. Para amostras de rotulagem de anticorpos, proceda do seguinte modo:
   1. Congelar-crack amostras em nitrogênio líquido e, em seguida, fixar durante a noite em-20 ° c metanol em um frasco de Coplin.
   2. Também em frascos de Coplin, lave as lâminas por 3 vezes em 1X PBS, em seguida, bloquear por 20 min em PBS contendo 0,5% BSA e 0,1% Tween 20.
   3. Adicionar 30 μL de anticorpo anti-SUMO 6F2 (1:10) a cada lâmina que cubra os espécimes. Incubar durante a noite em uma câmara de humidade a 4 ° c.
      Nota: o SUMO 6F2 foi obtido a partir do estudo do desenvolvimento hybridoma Bank¹⁵.
   4. Em frascos de Coplin, lave as lâminas durante 2 min em 1X PBS, depois cubra e incubar espécimes com 30 μL de anticorpo secundário de cabra-anti-rato DyLight 488 (1:200) durante 1,5 horas numa câmara de humidade à temperatura ambiente.
   5. Em frascos de Coplin, lave as lâminas por 2 min em 1X PBS, faça um mergulho rápido em dH₂0 e, em seguida, monte os slides com suporte de montagem (veja a tabela de materiais).
3. Para a etiquetagem KmUTAG-FL, proceda com o seguinte:
   1. Para fixar as células, adicionar 1 volume de 8% PF para amostras para uma concentração final de 4% PF. fixar por 10 min em uma câmara de humidade e, em seguida, saciar a reação Transferindo slides para um frasco de Coplin contendo 1X PBS com 0,1 M de glicina por pelo menos 5 min.
   2. Em frascos de Coplin, lave as células por 5 min em 1X PBS, em seguida, permeabilizar as amostras em 1X PBS contendo 0,1% Triton-X por 10 min.
   3. Lave em um frasco de Coplin por pelo menos 5 min em 1X PBS, em seguida, adicione 200 μL de 0,1 M Glycine-HCl (pH = 2,0) para as amostras no slide por 10 segundos. Adicione imediatamente 200 μL de 10x SPB para neutralizar o pH.
   4. Lave o slide em 1X PBS em um frasco de Coplin por 5 min.
   5. Retire a corrediça da lavagem e pipetar 100 μL de 1x SPB + 5mM TCEP contendo 2 μg de UTAG-FL para os nematódeos nas lâminas, e incubar na câmara de humidade durante 1 h sem balançar.
   6. Retorne o slide para o frasco de Coplin e lave por 15 min em 1X PBS
   7. Retire o slide da lavagem, use uma limpeza de laboratório para secar ao redor da amostra e, em seguida, monte as lâminas com 5 μL de suporte de montagem (ver tabela de materiais). Armazene os slides a 4 ° c. Visualize usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL) e DyLight 488 (SUMO2/3).

Resultados

KmUTAG-FL é um recombinante, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteína. Para a produção de kmUTAG-FL, clonamos um mCherry-kmUTAG otimizado para o Codon no plasmídeo de superexpressão bacteriana pSPOT1 (Figura 1). Após a indução, a proteína kmUTAG-FL foi purificada em armadilha Spot, eluída e congelada até uso posterior. Para garantir a atividade de armadilhagem de sumô de KmUTAG-FL, confirmamos a ligação a grânulos conjugados com SUMO1 e precipitação de uma prote...

Discussão

Aqui apresentamos o uso de kmUTAG-FL, uma proteína recombinante, para estudos funcionais de SUMO em células de mamíferos fixas e gônadas de nematódeos dissecados. O KmUTAG-FL é um reagente específico de Pan-SUMO, tolerante ao stress, que reconhece e intercepta proteínas conjugadas de SUMO nativas e cadeias de SUMO. Desde que a estrutura terciária de sumô é altamente conservada é muito provável que as variações de sumô do modelo adicional e dos sistemas do não-modelo possam ser analisadas com o reagente de kmUTAG-FL. Como...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% de solução aquosa de paraformaldeído (formaldeído)	Microscopia Eletrônica Sciences	30525-89-4
Placas de Cultura de Células de 6 Poços	Genesee Scientific/Olympus Plastics	25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-545-003	Usado como um anticorpo secundário para o anticorpo monoclonal de camundongo
DPBS, sem cálcio, não magnésio	Fisher Scientific	Gibco 14190144
Dylight 488 conjugado AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	115-485-146	Usado como um anticorpo secundário para anticorpo monoclonal de camundongo
Fisherbrand Coverglass para óculos de cobertura de crescimento	Fisherbrand	12545101
FLUORO-GEL II com	DAPI Electron Microscopy Sciences	50-246-93)	Montagem de mídia na etapa 1.11
FLUORO-GEL com DABCO	Electron Microscopy Sciences	17985-02	Com DAPI adicionado a 1 µ g/mL; mídia de montagem na etapa 2.2.5
Glycine-HCl	Fisher BioReagents	BP3815
Glycine-HCl	ACROS Organics	6000-43-7
KmUTAG-fl	Kerafast		KmUTAG estão disponíveis em Kerafast.com
Tampão de bloqueio Oneblock Western-CL	Prometheus	20-313
PBS, solução salina tamponada com fosfato, solução 10X	Fisher BioReagentes	BP3994
PNT2 linha celular	Sigma-Aldrich	95012613	Epitélio prostático normal imortalizado com SV40.
pSPOT1	(ChromoTek GmbH)	ev-1	https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2	DSHB	SUMO 6F2	SUMO 6F2 foi depositado no DSHB por Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
Tampão protease SUMO [10x]			500 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2% NP-40, 1,5 M NaCl
SUMO-2 Anticorpo 8A2	DSHB	SUMO-2 8A2	O SUMO-2 8A2 foi depositado no DSHB por Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL	GoldBio	51805-45-9	Usado como agente redutor na concentração de 5mM
Triton X-100	Fisher BioReagents	9002-93-1	Usado para permeablização a 0,1% em DPBS/PBS (para vermes)

Os reagentes