Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

Siming Liu; Mikako Harata; Joseph  A. Promes; Anthony  J. Burand; James  A. Ankrum; Yumi Imai

doi:10.3791/59578

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Artigo de método

Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

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DOI:

10.3791/59578

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14 de maio de 2019

Siming Liu¹^,² , Mikako Harata¹^,² , Joseph A. Promes¹^,² , Anthony J. Burand²^,³ , James A. Ankrum²^,³ , Yumi Imai¹^,²

¹Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, ³Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para criar pseudoislets humanos modificados gene das pilhas de ilhotas humanas dispersas que são transados pelo Lentivirus que carreg o RNA curto do hairpin (shRNA) é apresentado. Este protocolo utiliza prontamente-as embarcações disponíveis da enzima e da cultura, podem ser executadas facilmente, e produzem os pseudoislets humanos genetically modificados apropriados para estudos funcionais e morfológicos.

Resumo

Várias ferramentas genéticas estão disponíveis para modular genes em Ilhéus pancreáticos de roedores para dissecar a função de genes de ilhotas para pesquisa de diabetes. No entanto, os dados obtidos a partir de ilhotas de roedores muitas vezes não são totalmente reproduzidos ou aplicáveis às ilhotas humanas devido a diferenças bem conhecidas na estrutura e função da ilhós entre as espécies. Atualmente, as técnicas que estão disponíveis para manipular a expressão gênica de ilhotas humanas são muito limitadas. A introdução de transgene em ilhotas intactas por adenovirus, plasmídeo, e oligonucleotídeos muitas vezes sofre de baixa eficiência e alta toxicidade. A baixa eficiência é especial problemática em estudos do downregulation do gene em ilhotas intactas, que exigem a eficiência elevada. Soube-se que as pilhas enzymaticamente-dispersadas do Islet reagregam na cultura que dá forma aos esferoides denominados pseudoislets. O Reaggregation tamanho-controlado de pilhas humanas da ilhotas cria os pseudoislets que mantêm a primeira secreção dinâmica da insulina da fase após a cultura prolongada e fornecem uma janela para introduzir eficientemente o RNA curto lentivirais do hairpin (shRNA) com baixa toxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a criação de pseudoislets humanos após o transdução lentivirais usando duas placas de comercialmente disponíveis é descrito. O protocolo pode ser facilmente realizado e permite a downregulation eficiente dos genes e a avaliação do dinamismo da secreção de insulina usando células de Illet humanas. Assim, os pseudoislets humanos com modulação mediada lentivirais do gene fornecem um modelo poderoso e versátil para avaliar a função do gene dentro das pilhas humanas da ilhotas.

Introdução

A perda da massa beta funcional da pilha é a patologia central para o tipo-1 e o tipo-2 diabetes¹. Enquanto as células beta são os produtores de insulina em ilhotas pancreáticas, a comunicação entre as células beta e as células não beta desempenha um papel crítico na regulação da secreção de insulina². Além disso, a disregulação da secreção de glucagon contribui para a hiperglicemia no diabetes³. Assim, há um forte interesse em modular a expressão gênica de células dentro de ilhotas pancreáticas para abordar o mecanismo por trás do desenvolvimento da disfunção de ilhotas no diabetes. Uma variedade....