Aqui nós apresentamos um protocolo prontamente aplicável para avaliar a estabilidade do armazenamento de vesicles extracelular, um grupo de nanopartículas naturais produzidas pelas pilhas. As vesículas são carregadas com glucuronidase como uma enzima modelo e armazenadas diferentes condições. Após o armazenamento, os seus parâmetros físico-químicos e a atividade da enzima encapsulada são avaliados.
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Artigo de método
Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
As vesículas extracelulares (EVs) são alvos promissores na pesquisa atual, usadas como drogas, portadores de drogas e biomarcadores. Para seu desenvolvimento clínico, não somente sua atividade farmacêutica é importante mas também sua produção precisa de ser avaliada. Neste contexto, a pesquisa concentra-se no isolamento de EVs, sua caracterização e seu armazenamento. O presente manuscrito tem como objetivo fornecer um procedimento facile para a avaliação do efeito de diferentes condições de armazenamento em EVs, sem manipulação genética ou ensaios funcionais específicos. Isto torna possível obter rapidamente uma primeira impressão da estabilidade de EVs uma condição de armazenamento dada, e os EVs derivados das fontes diferentes da pilha podem ser comparados facilmente. A medida de estabilidade baseia-se nos parâmetros físico-químicos dos EVs (tamanho, concentração de partículas e morfologia) e na preservação da atividade de sua carga. O último é avaliado pelo encapsulamento saponina-negociado do beta-glucuronidase da enzima nos EVs. Glucuronidase atua como um substituto e permite uma quantificação fácil através da clivagem de uma molécula de repórter fluorescente. O presente protocolo poderia ser uma ferramenta para os pesquisadores na busca de condições de armazenamento que otimamente reter Propriedades EV para avançar a pesquisa EV para aplicação clínica.
Introdução
Os EVs são nanopartículas ligadas à membrana produzidas por quase todos os tipos de células. Para as células de mamíferos, os EVS podem ser subdivididos em dois grupos principais com distintas viasdeprodução1,2. As vesículas da membrana, com uma escala do tamanho de aproximadamente 100-1000 nanômetro, são produzidas pelo brotamento direto da membrana de pilha. Os exosomas, de tamanho 30-200 nm, são derivados de corpos multivesiculares formados por brotamento interno em endosomas que posteriormente se fundem com a membrana celular para liberar vários exosomas de uma só vez. A principal função dessas vesículas é....
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Protocolo
1. cultura celular e produção de meio celular-condicionado
- Geralmente, cultivar as células as condições individuais necessárias para a respectiva linha celular.
- Cultivar as células para 24-72 h em condições livres de soro ou em meio contendo soro bovino fetal empobrecido EV (FBS).
Nota: se for utilizado FBS empobrecido EV, empregar um método comprovado para esgotar eficientemente o soro, para evitar a contaminação com soro-derivado de bovinos EVs26. - Colete o meio dos frascos. Centrifugador em 300 x g por 10 min para pellet as células. Colete com cuidado o meio celular-condicionado (CCM), sem perturbar a....
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Resultados
A Figura 1 exibe as características de armazenamento de EVS isoladas de HUVECs. Os EVs foram isolados por UC, a glucuronidase foi encapsulada e, após a SEC, os EVs purificados foram avaliados por suas propriedades físico-químicas por NTA. Uma amostra dos vesículas foi submetida subseqüentemente à purificação AF4 e a atividade do glucuronidase foi medida.
As vesículas foram então armazenadas por 7 d a 4 ° c ou-80 ° c e a 4 ° c em forma liofilizada, no último caso com a adição d.......
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Discussão
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente para estudar a estabilidade dos EVs diferentes condições de armazenagem. Com a combinação de glucuronidase encapsulado como um leitura funcional e a avaliação dos parâmetros físico-químicas dos EVS, o protocolo permite uma avaliação de estabilidade de armazenamento direta de EVS e a comparação de EVS da pilha diferente Linhas. SEM e TEM como métodos complementares permitem uma introspecção em mudanças dos EVs no nível da único-partícula. Os resultados aqui apresentad.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O programa de pesquisa Júnior NanoMatFutur do Ministério Federal da educação e pesquisa, Alemanha (Grant Number 13XP5029A) apoiou este trabalho. Maximilian Richter foi apoiado por Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundação alemã de bolsas acadêmicas) através de uma bolsa de doutorado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2 dimiristol-sn glicero-3-fosfo-colina (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² frascos de cultura de células | Corning | 431082 | Usado com 25 ml de membrana de |
| celulose regenerada média de 30 | kDa Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µ m espaçador | Wyatt Technology Europe | ||
| Coletor de frações automatizado | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Clorofórmio | Fisher scientific | C / 4966/17 | |
| Forno de coluna | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trealose di-hidratada | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Detector de Dispersão de Luz Multi-ângulo | Filtro de membrana Durapore da Wyatt Technology Europe | ||
| , PVDF, 0,1 µ m, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Usado para a preparação de buffers para AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Crescimento de células endoteliais meio basal, usado para a cultura livre de soro de células HUVEC |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Meio de crescimento de células endoteliais, usado para a cultura normal de células HUVEC |
| Seladores de placas ELISA | R & D Systems | DY992 | usado para vedação de placas de 96 poços para o ensaio de glucuronidase |
| Etanol | Fisher scientific E | / 0665DF / 17 | |
| Conjunto de extrusora com suporte / bloco de aquecimento | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Suporte de filtro | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | usado para preparação de lipossomas |
| Fluoresceína di-β-D-glucoronídeo | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Usado para peletizar células a 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Usado para peletizar detritos maiores a 3000 g | |
| de células HUVEC | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Liofilizador ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polipropileno | VWR international | 525-0255 | os tubos usados para todo o manuseio de EV, considerados mais favoráveis do que produtos comparáveis de outros fornecedores em relação à recuperação de partículas |
| Nanosight LM14 equipado com um laser verde | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software versão 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch membranas de policarbonato | Whatman/GE Healthcare | 110406 | usado para preparação de lipossomas |
| PEEK Suporte de filtro em linha | Wyatt Technology Europe | ||
| Hidrato de ácido fosfotúngstico | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Frascos de policarbonato para ultracentrifugação | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Microscopia eletrônica de varredura Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM cobre grades com filme de carbono | Plano | S160-4 | |
| Pequeno AF4 canal | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Microscopia eletrônica de transmissão JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Tipo 45 Ti rotor de ultracentrifugação | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Amostrador automático Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Bomba isocrática Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Desgaseificador a vácuo online Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| Detector UV | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µ Filtro de celulose mista de tamanho de poro | M Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Usado para a filtragem de todos os tampões usados com os EVs e em SEC |
Referências
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug t....
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Reimpressões e permissões
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