Um romance e modelo de rato translacional de concussão combinando força e rotação com Microdiálise cerebral in vivo

Resumo

A alteração do neurotransmissor é um mecanismo de disfunção neural que ocorre após concussão e contribui para as conseqüências de longo prazo, às vezes catastróficas. Este modelo de rato combina microdiálise, permitindo a quantificação do neurotransmissor in vivo, com uma técnica de queda de peso que exerce rápida aceleração e desaceleração da cabeça e tronco, um fator importante do trauma craniocerebral humano.

Resumo

Os sintomas cognitivos e do motor persistentes são conseqüências conhecidas das concussões/ferimento de cérebro traumático suave (mTBIs) que pode ser em parte atribuível à neurotransmissão alterada. Na verdade, estudos de microdiálise cerebral em roedores demonstraram uma liberação excessiva de glutamato extracelular no hipocampo dentro dos primeiros 10 minutos após o trauma. Microdiálise oferece a clara vantagem de in vivo neurotransmissor amostragem contínua, enquanto não ter que sacrificar o animal. Além da técnica supracitada, é necessário um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado que exerce rápida aceleração e desaceleração da cabeça e do tronco, pois tal fator não está disponível em muitos outros modelos animais. O modelo do peso-gota do estado de Wayne imita este componente essencial do traumatismo craniocerebral humano, permitindo a indução de um impacto na cabeça de um roedor desenfreado com um peso de queda. Nosso modelo novo e translacional do rato combina a microdiálise cerebral com o modelo do peso-gota do estado de Wayne para estudar, em ratos adultos levemente anestesiados e uncontido, as mudanças agudas em níveis extracelular do neurotransmissor depois da concussão. Neste protocolo, a sonda de microdiálise foi inserida dentro do hipocampo como região de interesse, e foi deixada inserida no cérebro com impacto. Há uma alta densidade de terminais e receptores no hipocampo, tornando-se uma região relevante para documentar a neurotransmissão alterada após concussão. Quando aplicado aos ratos adultos de Sprague-Dawley, nosso modelo combinado induziu aumentos em concentrações extracelular hippocampal do glutamato dentro dos primeiros 10 minutos, consistentes com a sintomologia previamente relatada do borne-Concussion. Este modelo combinado do peso-gota fornece uma ferramenta de confiança para que os investigadores estudem respostas terapêuticas adiantadas às concussões além do que ferimento de cérebro repetitivo, desde que este protocolo induz um traumatismo suave da fechado-cabeça.

Introdução

O objetivo deste método é fornecer aos pesquisadores uma ferramenta confiável que reproduz fielmente a biomecânica do trauma craniocerebral humano, permitindo a caracterização longitudinal dos efeitos moleculares de concussões/cérebro traumático leve lesão (mTBIs). Este método combina a microdiálise cerebral com o modelo do peso-gota do estado de Wayne para documentar, em ratos adultos levemente anestesiados e uncontido, as mudanças agudas em níveis extracelular do neurotransmissor depois da concussão. Com este método minimamente invasivo, neurotransmissores como glutamato, GABA, taurina, glicina e serina podem ser rapidamente e continuamente quantificados após trauma, in vivo, sem ter que sacrificar o animal.

Concussão/mTBI é uma perturbação fisiopatológica que afetam o funcionamento cerebral causado por um mecanismo de força externa. Concussão/mTBI é a forma mais comum de lesão cerebral traumática, representando 70-90% dos casos¹. A maioria das rupturas funcionais agudas que seguem uma concussão pode ser atribuída a uma lesão cerebral preliminar e secundária^2,3: (1) a lesão cerebral primária é induzida pela rápida aceleração e desaceleração da cabeça e tronco que danifica os tecidos cerebrais por compressão seguida pelo alongamento e cisalhamento dos axônios durante a folga^4,5,6 e (2) a lesão cerebral secundária é a resposta celular indireta ao trauma. Tem lugar horas e dias após a lesão cerebral primária e desempenha um papel importante no motor e comprometimento cognitivo observado ao longo do tempo. Muitos dos sintomas podem ser atribuídos à neurotransmissão alterada, como a liberação excessiva de glutamato extracelular previamente demonstrada nos primeiros 10 minutos apósa lesão^7,8,9. Dada a sua alta densidade de terminais e receptores, o hipocampo é uma estrutura cerebral particularmente vulnerável a esta resposta excitotóxica após lesão. Estando fortemente envolvido na função cognitiva^10,11, estudos em roedores relataram que o dano hipocampal associado à concussão pode levar a prejuízos no condicionamento do medo e na aprendizagem da memória espacial^{12 , 13}. o objetivo preliminar desta metodologia era trabalhar para fora um modelo do rato de Concussion/MTBI, usando o estado de Wayne fechou o procedimento principal do peso-gota para reproduzir fielmente os mecanismos do ferimento de cérebro preliminar, e incorporar o cerebral microdiálise para estudar in vivo, o neurotransmissor extracelular agudo muda devido à lesão cerebral secundária após uma concussão. As concentrações de glutamato extracelular e GABA foram medidas no hipocampo para atuar como resultados representativos do nosso método.

Estudos de roedores anteriores combinaram microdiálise e outros modelos de lesão, como a queda de peso do crânio aberto e o impacto cortical controlado, para demonstrar as alterações agudas nos níveis de neurotransmissores extracelulares após uma lesão de gravidade variável graus^14,15,16,17. No entanto, além dos altos graus de variabilidade, o valor translacional de modelos como a queda de peso do crânio aberto e o impacto cortical controlado é dificultado por uma falta inerente de validade ecológica devido a 2 fatores: (1) esses modelos induzem lesões muito mais graves do que as concussões relacionadas com o desporto sofridos em seres humanos, envolvendo a carga cerebral direta e (2) estes modelos necessitam de uma craniectomia ou uma craniotomia, a cabeça do roedor sendo completamente contido em um quadro estereotaxico, impedindo a rápida aceleração e desaceleração da cabeça e tronco, assim reproduzindo mal a biomecânica da concussão.

A microdiálise é um método minimamente invasivo que oferece a clara vantagem de neurotransmissores de amostragem, como glutamato, GABA, taurina, glicina e serina, in vivo e continuamente após trauma, sem ter que sacrificar o animal. Além das vantagens oferecidas pela microdiálise, a Wayne State University desenvolveu um modelo de queda de peso do crânio fechado (em oposição ao crânio aberto de outros modelos), que permite a indução de um mTBI em um roedor levemente anestesiado e desenfreada, permitindo assim a aceleração e a desaceleração rápidas da cabeça e do torso¹⁸. Como mencionado previamente, a aceleração e a retardação da cabeça e do torso são uma característica biomecânica do núcleo de concussões esporte-relacionadas vistas nos seres humanos que os modelos precedentes do mTBI do roedor falharam endereçar. O procedimento do peso-gota pode ser feito muito rapidamente e não exige nenhuma cirurgia prévia ou incisão do escalpe. Após a indução da concussão, os roedores recuperam o reflexo de endireitando quase espontaneamente e não experimentam paralisia, convulsões ou desconforto respiratório após um único impacto. Os bleedings intracranial e as fraturas do crânio são raros, e somente os deficits menores na coordenação motora foram relatados nos roedores. Este modelo de rato é fácil de usar, barato e facilita a quantificação de neurotransmissores liberados na fase aguda após uma concussão sem remover a sonda de microdiálise durante o impacto.

Nosso modelo de ratos combinando microdiálise e concussão é apropriado para pesquisadores que procuram caracterizar longitudinalmente os efeitos moleculares da concussão e podem ser usados em uma ampla variedade de estudos terapêuticos. Na verdade, apesar de vários anos de pesquisa e uma necessidade esmagadora, nenhuma droga para evitar os efeitos a longo prazo de concussões passou a fase de ensaio clínico¹⁹. Uma das razões potenciais para estas falhas poderia ser o uso dos modelos animais que não reproduzem fielmente as forças biomecânicas traumáticas das concussões como experimentadas por seres humanos. O método apresentado aqui encontra a definição de concussões humanas que especifica que a lesão cerebral primária é induzida por um impacto contundente^,bem como rápida aceleração e desaceleração da cabeça e tronco^2,3.

Além disso, o nosso modelo combinado é adequado para os investigadores que estudam os efeitos da lesão cerebral traumática ligeira repetida (rmTBI), uma vez que uma das suas características-chave que o diferencia de outros modelos animais de concussão é que torna possível induzir repetidas, lesões leves no mesmo caso¹⁸. Nos seres humanos, o rmtbi está associado a sintomas pós-traumáticos mais severos, tempos de recuperação mais longos e prejuízos motores e cognitivos agravados que tendem a se espalhar ao longo do tempo^20,21. Outros modelos animais relevantes também tornaram possível compreender melhor a fisiopatologia pós-traumática do rmtbi^{22,23,24,25,26,27} . A vulnerabilidade cerebral aumentada foi demonstrada nos roedores após um mínimo de 5 mTBI em intervalos de 24 h. A neuroinflamação aumenta com o número de mTBI experientes e marcadores de neurodegeneração aparecem²⁸. O MTBI repetido impediria a transição do microglia de um modo pró-inflamatório a uma modalidade normal da recuperação, tendo por resultado a atividade excitotóxica prolongada e a ativação de mecanismos neurodegenerativas ²⁹. Com o nosso modelo, os ratos podem ser expostos a 1 impacto por dia durante o período de 1 semana para um total de 5 exposições. Dada a simplicidade deste modelo animal, poderia facilitar a caracterização dos efeitos cumulativos da liberação indiscriminada aguda do neurotransmissor que levanta-se imediatamente depois de um mTBI.

Este modelo também permite que os animais sejam prontamente expostos a 2 impactos por dia, tornando possível estudar condições ainda mais severas, como quando um atleta recebe outro impacto traumático dentro de um curto espaço de tempo desde o primeiro golpe³⁰. Como demonstrado em um estudo anterior³¹, o sincronismo de um segundo golpe na cabeça pode afetar dramaticamente os danos vasculares e axonais. Quanto mais perto o segundo golpe é para o primeiro golpe, mais prejudicando as conseqüências. Este modelo é apropriado para investigar como esta circunstância particular afeta a liberação extracelular do neurotransmissor.

Neste método, o hipocampo foi utilizado como região de interesse devido à sua relevância na pesquisa de concussão, mas as amostras de microdiálise também podem ser coletadas de outras regiões de interesse. Entretanto, toda a outra região do cérebro tem que ser considerada por conta do espaço deixado pelo local do impacto da cânula do guia, incluindo o cimento dental que cerca o, pode tomar acima de uma quantidade considerável de espaço na cabeça do rato. Além disso, os parâmetros de microdiálise apresentados neste método, como o corte de peso molecular da membrana e o comprimento ativo, os intervalos de tempo de amostragem e a vazão podem ser ajustados de acordo com o tipo de molécula estudada. A coleção eficiente de citocinas pró-inflamatórias envolvidas em concussões, por exemplo, exigiria uma membrana com um tamanho de poros muito maior.

Protocolo

O protocolo animal para este projeto obteve a aprovação do Comitê de cuidado animal do Hopital du Sacre-Cœur de Montreal em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense de cuidados com animais.

Nota: um esquema esquemático do protocolo de pesquisa é apresentado na Figura 1.

1. preparação animal

1. Encomendar ratos Sprague-Dawley de um fornecedor de animais de laboratório padrão a ser entregue entre 43 e 50 dias de idade e a um peso entre 151 e 200 g.
2. Casa todos os ratos individualmente em um ciclo de 12:12 h luz: escuridão, a 24-26 ° c com acesso ad libitum à água e alimentos.
3. Durante as 2 semanas antes de iniciar o protocolo, lidar com os ratos por 5 min em uma base diária para facilitar a sua habituação em contato com pesquisadores. Os ratos devem ter idade de cerca de 10 semanas de idade e seu peso deve ser entre 295 e 351 g no momento da concussão ou indução de lesão Sham.

2. cirurgia de implante de cânula guia de microdiálise

1. Realize a cirurgia condições estéreis. Use luvas estéreis, uma capota de cabelo e uma máscara cirúrgica durante todo o procedimento. Autoclave e esterilizar todos os materiais e instrumentos cirúrgicos de antemão. Limpe e desinfete a área de funcionamento e o instrumento Stereotaxic completamente com uma solução do ethanol (70%).
2. Anestesie os animais injetando um coquetel de cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitonealmente. Profundidade anestésica dos jumentos testando o reflexo a uma pitada do dedo do pé.
3. Retire a pele da cabeça do animal usando tosquiadeiras elétricas. Limpe a cabeça raspada usando uma solução de álcool isopropílico a 2% e gluconato de clorexidina a 2% (3 vezes). Aplique a pomada do olho de lubrificação durante a anestesia para impedir a secura.
4. Drape-fora do campo cirúrgico de modo que somente a cabeça do animal esteja expor. Coloc a cabeça do rato em um instrumento Stereotaxic, introduza as barras da orelha nos canais de orelha com grande cuidado a seguir aperte a braçadeira de nariz. Fixar uma cânula de guia de aço inoxidável de 26 G ao braço do suporte no aparelho estereotódico.
5. Injetar localmente um coquetel anestésico de bupivacaína (1,5 mg/kg) e lidocaína (1,5 mg/kg) subcutaneamente na cabeça, 10 min antes da incisão.
6. Manter a anestesia durante todo o procedimento através da entrega de isoflurano de sódio (2,5%) em 0,5 L/min fluxo de oxigênio com um cone de nariz.
7. Faça uma incisão na linha média (3 cm) ao longo do couro cabeludo com um bisturi. Deixe o crânio claro Instalando 4 grampos em torno da incisão.
8. Raspe firmemente o periósteo do crânio com uma lâmina cirúrgica até que as suturas de Bregma e de lambda estejam visíveis. Mantenha uma pressão firme no crânio com uma almofada de gaze ou um aplicador com ponta de algodão se houver sangramento.
9. Confirme se o crânio está alinhado corretamente no aparelho estereotódico comparando as coordenadas dorsoventrais das suturas de Bregma e lambda. Identificar as coordenadas ântero-posteriores, mediolateral e dorsoventral da sutura de Bregma como pontos de referência para as coordenadas da cânula guia.
10. Tomando as coordenadas da sutura de Bregma como referências, calcule as coordenadas do local da implantação da cânula do guia no hipocampo.
    Nota: As seguintes coordenadas foram determinadas de acordo com o Atlas cerebral de ratos de Paxinos e Watson (anteroposterior:-0,60 cm; mediolateral: ± 0,58 cm; dorsoventral:-0,16 cm, Figura 2a)³².
11. Marque o local de implantação preciso usando um marcador.
12. Perfure um furo de 0,5 milímetros através do crânio no local de alvo da cânula do guia. Perfure 3 outros furos aproximadamente 5 milímetros em torno deste ponto para rosquear 3 parafusos de escora no crânio que solidificar a cânula depois que o cimento dental acrílico é aplicado.
13. Insira a cânula no hipocampo e fixe-a com cimento dentário. Esta cânula será usada para inserir a sonda na região de interesse 7 dias depois durante o procedimento de microdiálise. Tenha cuidado para não derramar excesso de cimento dentário em torno do local onde o peso será Descartado.
14. Deixe o cimento secar durante 2 minutos e, em seguida, retire o braço do suporte da cânula. Insira um obturador removível de aço inoxidável na cânula para evitar o escoamento do líquido cefalorraquidiano e os riscos de infecção.
15. Retire as 4 braçadeiras, puxe para trás a pele retraído e costurá-la com uma rosca de sutura cirúrgica 4-0.
16. Retire o rato do aparelho e injete buprenorfina por via subcutânea para tratar a dor (0, 5 mg/kg, após a cirurgia, em seguida, uma vez por dia durante os 2 dias seguintes). Coloc o roedor para trás em sua gaiola com uma almofada de aquecimento até que se torne consciente, a seguir retorne-a à facilidade do cuidado animal por um período de recuperação de 7 dias a monitoração próxima.

3. procedimento de microdiálise

1. Durante a realização do procedimento de microdiálise, use luvas estéreis, uma capota de cabelo e uma máscara cirúrgica. Sete dias após a cirurgia de implante de cânula, anestesiam o rato com isoflurano de sódio (2,5%) em 0,5 L/min fluxo de oxigênio.
2. Retire o obturador da cânula e insira lentamente uma sonda de microdiálise, perfundidos com fluido espinhal cerebral artificial (ACSF) (26 mmol/l NaHCO₃, 3 mmol/l NaH₂po₄, 1,3 mmol/l MgCl₂, 2,3 mmol/l CAcl₂, 3,0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L ácido L-ascórbico), através da cânula para o hipocampo ou outra região de interesse.
   Nota: Os ratos precisam ser anestesiados apenas ao remover o obturador e inserir a sonda de microdiálise, e durante a indução de concussão ou lesão simulada. As sondas utilizadas aqui são construídas em laboratório, em forma de I, e compostas por linhas de saída de sílica lado a lado fundidos [diâmetro interno (ID): 50 μm] envolto em tubos de polietileno (ID: 0,58-0,38 mm). O fim da cânula é fixado com um comprimento de membrana de celulose oca regenerada [corte de peso molecular: 13 kDa, diâmetro externo (OD): 216 μm; ID: 200 μm] usando adesivo de cianoacrilato e a ponta selada com epóxi. A membrana ativa mede 2,5 mm para a implantação no hipocampo, mas pode ser ajustada de acordo com a profundidade da região de interesse. A conexão da cânula de indwelling do rato à ponta de prova é fixada com um colar cabido, rosqueado do aço inoxidável.
3. Fixe o conjunto da sonda a uma mola de aço inoxidável presa a um braço de alavanca do giro e contador de contrapeso líquido suspenso acima da gaiola com um suporte de anel e grampos para que o animal possa mover-se livremente dentro de sua gaiola. Ratos amarrados passam toda a duração do procedimento de microdiálise com acesso ad libitum à água e alimentos.
4. Use uma bomba da microinfusão para emitir o perfusato às pontas de prova, e colete o dialisato da linha da tomada do silicone fundido (volume inoperante: 0,79 μL).
5. Pelo menos 1 h e 30 min antes do início do procedimento, gire a sonda para a sua vazão de trabalho (1 μL/min). Verifique se a vazão da sonda é consistente medindo o volume ao longo do tempo com uma pipeta.
   Nota: A taxa de fluxo pode ser mais ou menos dependendo dos neurotransmissores amostrados e da região cerebral de interesse. As amostras de diálise são tomadas antes, durante, e após a concussão ou indução de lesão Sham. O intervalo de amostragem depende da região cerebral de interesse, sendo analisados os neurotransmissores, as concentrações de dialisato do analito e a sensibilidade dos equipamentos de química analítica utilizados. As fases de coleta feitas aqui no hipocampo para glutamato e amostragem de GABA são as seguintes:
   1. linha de base: no início do experimento, coletar amostras de diálise em intervalos de 10 min para 60 min.
   2. pós-concussão ou lesão Sham: após concussão ou lesão Sham, colete amostras para um adicional de 90 min (9 amostras).
6. Colete cada amostra de dialisato em um frasco de fração pré-carregado com 1 μL de ácido perclórico 0,25 mol/L para evitar a degradação do analito. Armazene as amostras a 4 ° c para análise subsequente.
7. Após a coleta da última amostra dialisada, re-anestesiar o rato com um cone de nariz entregando isoflurano de sódio (2,5%) em 0,5 L/min fluxo de oxigênio.
8. Retire a sonda de microdiálise da cânula, volte a inserir o obturador e, em seguida, devolva o rato para a instalação de cuidados com animais.

4. instalação do aparelho de concussão

1. Antes do início do procedimento, esculpir um peso a ser usado para infligir a concussão (19 mm de diâmetro) de latão maciço para obter uma massa de 450 g. Insira um laço metálico na parte superior do peso de latão. Furos preliminares a uma distância de 1,0 m dentro de um tubo de guia de cloreto de polivinil (PVC) vertical.
2. Corte uma folha de alumínio com uma lâmina de barbear afiada. A folha de alumínio entalhado deve suportar o peso do rato (295 a 351 g) sem interferir com a aceleração de seu corpo após o impacto principal do peso de bronze.
3. Tape a folha de alumínio entalhado firmemente a um quadro em forma de U Plexiglas (38 cm de comprimento x 27 cm de largura x 30 cm de profundidade, Figura 3a, B) que contém um coxim de espuma (37 cm de comprimento x 26 cm de largura x 12 cm de profundidade).
4. Posicione o quadro de plexiglas um tubo de guia de PVC (20 mm de diâmetro x 1,5 m de comprimento).
5. Segure o tubo de guia de PVC no lugar com um suporte de grampo 3,5 cm acima do alumínio entalhado.
6. Una uma linha de pesca de nylon da mosca (capacidade de 9,1 quilogramas, diâmetro de 0,46 milímetros) através do laço do metal de modo que a parte inferior do peso pendure 2,5 cm sobre o alumínio entalhado como para impedir batidas múltiplas quando o rato está caindo na almofada de espuma depois do impacto.
7. Prenda a linha de pesca da mosca de nylon ao carrinho da braçadeira.
8. Puxe acima o peso através do tubo do PVC com a linha de pesca de nylon da mosca a seguir mantenha-a no lugar introduzindo uma chave do hex através dos furos perfurados preliminares em 1,0 m.

5. indução de concussão

1. Após a fase basal da coleta de amostras de diálise, reanestesialize o rato levemente colocando um cone de nariz entregando isoflurano de sódio (2,5% de isoflurano a 0,5 L/min de fluxo de oxigênio) até que não haja resposta a uma pitada de dedo (como mencionado na seção 3,1).
2. Coloc o animal em sua caixa na folha de alumínio entalhada de modo que sua cabeça seja posicionada diretamente no trajeto do peso de bronze (Figura 3C, D). Manter a anestesia com o cone do nariz para se certificar de que o rato não se move ou acordar antes do peso atinge-lo.
3. Retire o cone do nariz e puxe a chave sextavada. O peso cairá verticalmente através do tubo do PVC e impactará a cabeça do rato. O rato passará por uma rápida rotação de 180 ° e aterrará nas costas (Figura 3E).
4. Retire o rato da almofada de espuma e coloque-o em suas costas em sua gaiola.
5. Use um temporizador digital para medir o tempo de reflexo de endireitando como um sinal da severidade da recuperação e de ferimento. O tempo de reflexo de endireitando é o tempo total do impacto até que os roedores acordem e espontaneamente se endiream à posição prona da posição supina, ou começam a andar. Observe quaisquer sinais de morte, fratura ou sangramento.
   Nota: O procedimento pode ser repetido no mesmo assunto em pontos de tempo diferentes para concussões repetidas.

6. indução Sham

1. Após a fase basal da coleta de amostras de diálise, re-anestesialize o rato levemente colocando um cone de nariz entregando isoflurano de sódio (2,5%) em 0,5 L/min fluxo de oxigênio até que ele como nenhuma resposta a uma pitada de dedo do pé (como mencionado na seção 3,1).
2. Coloc o animal em sua caixa na folha de alumínio entalhada de modo que sua cabeça estabeleça diretamente no trajeto do peso de bronze. Mantenha a anestesia com o cone do nariz para garantir que o rato não se mova ou acorde.
3. Retire o cone do nariz e retire o animal da folha de alumínio sem puxar a chave sextavada. O rato não passará por uma rotação rápida de 180 °.
4. Coloque o rato em suas costas em sua gaiola.
5. Use um temporizador digital para medir o tempo de endireitando como um indicador da restauração neurológica.

7. cromatografia líquida de capacidade elevada

1. Determine os níveis do neurotransmissor (isto é, glutamato e GABA) pela derivação da pré-coluna usando a cromatografia líquida de capacidade elevada com deteção rápida da fluorescência da separação, e um sistema que consiste em um amostrador automático rápido da separação e em uma bomba acoplada a uma coluna analítica de 3,0 x 50 mm 5 μm.
2. Prepare uma fase móvel com 100 mmol/L fosfato de sódio dibásico (na₂HPO₄), 3,5% acetonitrila e 20% metanol. Ajuste o pH a 6,7 com ácido fosfórico (85%) conforme necessário.
3. Defina a vazão para 0,5 mL/min.
4. Prepare reagentes de derivação diários frescos e padrões de trabalho (100 ng/mL) de soluções de estoque. Coloque-os em um amostrador automático refrigerado (10 ° c) de separação rápida com amostras.
5. Misture cada fração sequencialmente na coluna analítica com 20 μL de ácido 3-mercaptopropiônico (0, 71 mol/L) diluído com H₂o e 20 μL de o-phthaldehyde (0, 143 mol/l) diluído com 0,1 mol/l de tetraborato de sódio. Permitir que 10 min para a mistura de reagir.
6. Para evitar a contaminação das amostras seguintes, lave o laço de injecção com metanol (20%), após cada injeção.
   Nota: O tempo de retenção de glutamato seria de 1 min aproximadamente neste protocolo, para um tempo de execução total de 30 min para cada amostra.
7. Durante a análise de picos cromatográficos, identificar picos desconhecidos usando amostras combinadas de acordo com o tempo de retenção de padrões conhecidos. Níveis expressos de analitos como μg/mL.

8. histologia

1. Um mês após o procedimento de microdiálise e concussão ou indução de lesão Sham, anestesiar os animais injetando um coquetel de cetamina (70 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitonealmente e eutanasiá-los por paraformaldeído (4%) e perfusão intracardíaca salina.
2. Decapitar os roedores, em seguida, dissecar o cérebro.
3. Armazene os cérebros em paraformaldeído (4%) e, subsequentemente, crio-los em solução de sacarose (30%).
4. Corte os cérebros em secções coronais de 50 μm com um criostat.
5. Manchar as fatias cerebrais com violeta cresilo para verificação histológica de ferimento e sonda de colocação (Nissl coloração).

Resultados

Usando nosso modelo de concussão que combina força e rotação com microdiálise cerebral in vivo, o glutamato extracelular agudo e as alterações de GABA ao longo do tempo após uma concussão ou lesão simulada foram investigados em 21 ratos machos, adultos, Sprague-Dawley pelo implantação de uma cânula guia na região CA1 do hipocampo.

Verificação histológica da colocação da sonda e lesão
Nenhuma mudança morfológica tal como hemorragias ou contusões intracerebral maciças foi relatada depois da verificação histológica de dano de tecido do hipocampo em seções manchadas com violeta do cresil. O implante da cânula do guia e a inserção da ponta de prova da microdiálise induziram danos menores e similares entre casos feridos e Sham. Além disso, não remover a sonda direita antes de lesão Sham ou indução de concussão não renderam qualquer dano tecidual distinguível do hipocampo, como visto um microscópio (Figura 2b, C, respectivamente), com a membrana da sonda ainda intacta Depois (Figura 2D, E). Cérebro de concussão e lesão simulada perfundidos com paraformaldeído (4%) 1 mês após os procedimentos de microdiálise são indistinguíveis após a inspeção visual (Figura 2F, G).

Endireitando o tempo reflexo
Os animais do grupo lesionado tiveram um tempo de endireitando significativamente aumentado em média versus casos Sham (teste t de Student, p = 0, 42801) (Figura 4) e apareceram atordoados ao recuperar a consciência. Dos 10 casos do grupo do concussão, um único animal mostrou sinais menores do sangramento o local do impacto que segue o peso-gota. Nenhum outro sinal da fratura do crânio ou do sangramento intracranial foi observado.

Microdiálise cerebral in vivo
Para atuar como resultados representativos do nosso método, 15 10 μL de amostras de dialisato foram extraídos do hipocampo, in vivo, em intervalos de 10 min e uma vazão de 1 μL/min. os níveis extracelulares de glutamato e GABA foram medidos a partir de 6 amostras durante a linha de base ( 60 min) e a partir de 9 amostras após a indução de lesão Sham ou concussão (90 min).

Concentrações extracelulares de glutamato
Aumentos significativos nas concentrações de glutamato extracelular foram observados na região CA1 do hipocampo durante os primeiros 10 minutos após a indução do trauma em relação à lesão Sham (teste U de Mann-Whitney, p = 0, 9175) (Figura 5). Nenhuma outra diferença nas concentrações de glutamato foi observada entre os grupos em qualquer outro momento.

Concentrações extracelulares de GABA
Nenhuma mudança significativa nas concentrações de GABA foi observada na região CA1 do hipocampo durante os primeiros 10 min após a indução do trauma em relação à lesão Sham (Mann-Whitney U Test, p = 0,943861) (Figura 6). Não houve outra diferença significativa nas concentrações de GABA em qualquer outro ponto de tempo entre os casos de concussão e casos de lesão Sham.

Figura 1: esquema esquemático do protocolo de pesquisa. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: verificação histológica da colocação da sonda e lesão. (A) visão coronal da sonda de microdiálise e do local da colocação da cânula do guia no hipocampo usando o Atlas estereotódico de Paxinos e Watson. (B) Fotomicrografia representativa de dano tecidual do hipocampo (violeta cresilo) produzida por sonda de microdiálise e cânula de guia de um caso de lesão simulando. (C) Fotomicrografia representativa de dano tecidual do hipocampo (violeta cresilo) produzida por sonda de microdiálise e cânula de guia de um caso de concussão. (D) Fotomicrografia representativa de uma sonda de microdiálise antes da indução de concussão. (E) Fotomicrografia representativa de uma sonda de microdiálise após indução de concussão. A membrana ainda está intacta. (F-G). Fotomicrografia representativo de um Sham (F) e de um concussão (G) feriu o cérebro que segue a perfusão com o paraformaldeído de 4% em 1 mês após o ferimento do Sham ou o procedimento do concussão. Em cima da inspeção visual, os 2 cérebros são indistinguíveis. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: aparelho de concussão e instrumentos de microdiálise, representações de componentes essenciais. (A) uma fotografia de toda a assembleia composta por um tubo de guia de cloreto de POLIVINIL (PVC) vertical para o peso em queda situado acima da fase de rato, moldura de Plexiglas, almofada de espuma, bomba de microinfusão controlada por computador, seringas estanques, líquido e as linhas de entrada de sílica fundidas lado a lado. (B) representação esquemática do quadro de Plexiglas e almofada de espuma com todas as dimensões pertinentes. (C) uma fotografia da parte entalhada da folha de alumínio que serve como o estágio do rato acima do coxim da espuma. (D) uma fotografia que mostra o posicionamento do rato no palco imediatamente antes do impacto da cabeça pelo peso em queda. (E) uma fotografia que mostra o rato após o impacto principal, ilustrando a rotação horizontal de 180 ° do corpo do rato após o impacto principal e a aceleração e a rotação de seguimento. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: tempo de endireitando. Representações do histograma do tempo tomado por ratos para acordar do anestésico e virar da posição supina para a posição prona ou começar a andar após concussão (diamantes vermelhos, n = 10) ou lesão Sham (quadrados azuis, n = 11). Ratos do grupo concussão demorou significativamente mais tempo para a direita se comparado com o grupo de lesão Sham. Os valores médios são representados como uma linha horizontal em cada gráfico. * p < 0, 5, * * p < 0, 1, * * * p < 0, 1. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: concentrações extracelulares de glutamato. Concentrações extracelulares médias de glutamato (μg/mL) medidas por microdiálise no hipocampo durante a linha de base (60 min) e após concussão (diamantes vermelhos, n = 10) ou lesão Sham (quadrados azuis, n = 11) condições (90 min). As barras de erro representam o erro padrão da média. * P < 0, 5, * * P < 0, 1, * * * P < 0, 1. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: concentrações extracelulares de GABA. Concentrações extracelulares médias de GABA (μg/mL) medidas por microdiálise no hipocampo durante a linha de base (60 min) e após concussão (diamantes vermelhos, n = 10) ou lesão Sham (quadrados azuis, n = 11) condições (90 min). As barras de erro representam o erro padrão da média. * P < 0, 5, * * P < 0, 1, * * * P < 0, 1. Este valor foi modificado de IO masse 2018. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Para a geração de resultados confiáveis, as etapas críticas neste protocolo exigem atenção especial. Durante a cirurgia de implante da cânula, evite usar mais cimento do que o necessário, especialmente quando é muito líquido para evitar derramando sobre o local de impacto. Para evitar o bloqueio do local de implantação, use um obturador que tenha o mesmo comprimento que a cânula. Durante o procedimento de microdiálise, insira a sonda lentamente na cânula e certifique-se de que está completamente inserida para amostragem de dialisato. Antes da indução de concussão, certifique-se de que a folha de alumínio está devidamente entalhado com uma lâmina afiada. Se não, o impacto do peso de bronze não será suficiente rasgar a folha de alumínio e o rato permanecerá a caixa para baixo em vez de submeter-se a uma rotação 180 ° e aterrar em sua parte traseira. Se este for o caso, as lesões induzidas resultará do impacto contundente, não diferentemente do que é visto nos modelos de queda de peso do crânio aberto e ser significativamente mais grave. Durante a indução de concussão, evite impactar a cânula com o peso, pois isso geraria dano crítico ao crânio do rato. É altamente recomendável trabalhar em equipes de 2 para restringir erros de manipulação durante o experimento.

Modificações e solução de problemas
Durante o procedimento de microdiálise, o fluxo deve ser constante e produzir um volume adequado à taxa de perfusão, uma vez que a sonda está ligada à bomba. Os volumes inferiores podem indicar a presença de entupimento na membrana da sonda ou bolhas de ar nas linhas. No caso de entupimento, a sonda deve ser descartada e substituída. Entretanto, as bolhas de ar podem ser ejetadas circulando ACSF nas linhas. Se não houver nenhum entupimento ou bolhas de ar observadas e ainda não houver fluxo, uma pequena parte do tubo de saída mais próxima ao final pode ser cortada.

Limitações do método
Outros estudos que utilizam a queda de peso da Wayne State University avaliaram algumas mudanças estruturais e moleculares fundamentais¹⁸. No entanto, uma investigação mais extensa manterá a legitimidade deste procedimento. Informações sobre as mudanças biológicas e neuroanatômicas que acontecem em níveis epigenéticos e celulares iriam solidificar o valor confiável e translacional do nosso método. Além disso, a avaliação da função cognitiva é uma medida confiável do desfecho relacionado ao mTBI em modelos de roedores³³. Quando o tempo-à-direito foi medido neste protocolo e foi atrasado significativamente em casos feridos comparados aos casos do Sham, os estudos no futuro devem concentrar-se em metodicamente medindo a função cognitiva depois da indução do traumatismo nos roedores.

Significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos.
O principal significado do método é duplo: em primeiro lugar, permite a indução bem-sucedida de uma concussão com o procedimento da Wayne State University, que permite rápida aceleração e desaceleração da cabeça e do tronco. Com esse método, evitaram-se desfechos graves de lesão, como prisões cardiorrespiratórias, fratura craniana, alta mortalidade e sinais de contusões cerebrais visíveis no local de impacto. Em segundo lugar, esta técnica da microdiálise replicou com sucesso o demonstrado previamente a liberação extracelular aguda e short-vivida do glutamato que tem lugar dentro dos primeiros 10 minutos que seguem a indução^14,16do traumatismo. Além disso, manter a sonda inserida ao longo de todo o procedimento reduz significativamente a probabilidade de induzir dano à barreira hemato-encefálica sensível ao mTBI ligada à inserção de sonda de microdiálise repetida³⁴.

Futuras aplicações ou direções do método.
Considerando os aspectos fáceis de usar do procedimento de queda de peso da Wayne State University e as alterações agudas do nível do neurotransmissor extracelular medidos por microdiálise, nosso modelo de ratos combinando microdiálise e concussão fornece aos pesquisadores uma ferramenta para reproduz fielmente a biomecânica do trauma craniocerebral humano e caracterizar longitudinalmente os efeitos moleculares das concussões. Nosso modelo de ratos também pode ser usado em uma ampla variedade de estudos terapêuticos, pois oferece uma oportunidade valiosa para estudar o mecanismo e a eficácia de agentes farmacológicos in vivo, continuamente e sem ter que sacrificar o animal. Além disso, a disponibilidade de um modelo do rato tal como esse apresentado aqui poderia extremamente facilitar a compreensão melhor da relação entre os desequilíbrios do neurotransmissor e as conseqüências comportáveis das concussões.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Preparação animal
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microdiálise Guia Implantação de cânula Cirurgia
Cloridrato de cetamina (100 mg/ml)	Bioniche	1989529
Cloridrato de xilazina (100 mg/ml)	Solução Bimeda	8XYL004C
de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2%	Carefusion	260100C
Cloridrato de lidocaína	Alveda Pharma	0122AG01
Cloridrato de Bupivacaína	Hospira	1559
Pomada Oftálmica	Baussh and Lomb inc.
Estrutura Estereotáxica	Stoelting	51600
Suporte de Cânula Estereotáxica Braço	Harvard Aparelho	72-4837
Broca	Dremel	8050-N/18
Sutura Revestida com Fio Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrílico Cimento	Harvard Aparelho	72-6906
Parafusos	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cânula Calibre 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G / SPC
Cânula Fictícia 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC / 1 / SPC
Nome< / strong>	Empresa< / strong>	Número de catálogo	Comentários
>Procedimento de microdiálise
CMA 402 Bomba de seringa	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsseringa 2.5ml Vidro	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Clipe de seringa Médio para 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Giro Giratório Revestido de Quartzo de Canal Duplo de Baixo Torque	Instech Laboratories Inc.	375 / D / 22QM
GSC Suporte de anel de suporte de ferro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Grampos de ângulo ajustável	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	para líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
MgCl2 Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
NaCl Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Ácido L-Ascórbico	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Cloreto de Potássio KCl	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato de Sódio Monobásico	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
CaCl2 Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Pneu		mais leve	para sondas construídas em laboratório / Disponível na maioria das lojas
de ferragens Cola Epóxi Pneu			canadensePara Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Super Cola Gel	Pneu		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Tubo Termo Retrátil 0.063" Diâmetro Interno Gardner Bender	Pneu		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Rodas de Corte Dremel #409	Pneu Canadense		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
BD Needle 26 Gauge 0,5 Inch PrecisionGlide Estéril 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Para Sondas Construídas
em Laboratório BD Needle 21 Gauge 1,5 Inch PrecisionGlide Estéril 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Aço Inoxidável 26G Um Pé	HRS Scientific	SST-26/FT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Para sondas construídas em laboratório
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Científico	008BSH/30S	HRS	para pontas de prova construídas laboratório
Polymicro Technologies Diâmetro interno flexível 50µ da tubulação capilar do silicone fundido; m, Diâmetro Externo 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	para sondas construídas em laboratório
Spectra Por 132294 membranas de fibra oca de microdiálise 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	para sondas construídas em laboratório
Colar de aço inoxidável	Sirnay In.c	304	para sondas construídas em laboratório / Custome made
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Aparelho de concussão
Brass Peso	Rapido Mé tal Inc.		Prenda o laço de metal à base
Metal Loop	Rona Inc.		Disponível na maioria das lojas de ferragens
Tubo guia de PVC	Rona Inc.		Disponível na maioria das lojas de ferragens
Alluminum Foil	Alcan		Disponível na maioria dos supermercados
Fita			Disponível comercialmente
Suporte de Anel de Suporte de Ferro Fundido GSC	Fisher Scientifique	S13748
Estrutura de Plexiglas em Forma de U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.
almofada de espuma	D & R Espuma Inc.
Lâminas de barbear	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Pneu			Disponível na maioria das lojas de ferragens
Cronômetro
			Disponível na maioria dos varejistas
de artigos esportivosPreparação animal
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Guia de microdiálise Cirurgia de implantação de cânula
Cloridrato de cetamina (100 mg / ml)		de 1989529
(100 mg / ml)	Solução Bimeda	8XYL004C
de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2%	Cloridrato	260100C
	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaína Cloridrato	Hospira	1559
Pomada Oftálmica	Baussh and Lomb inc.
Estrutura Estereotáxica	Stoelting	51600
Suporte de Cânula Estereotáxica Braço	Harvard Aparelho	72-4837
Broca	Dremel	8050-N/18
Sutura Revestida com Fio Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Dental Acrílico Cimento	Harvard Aparelho	72-6906
Parafusos	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cânula Calibre 20 10,55 mm	HRS Scientific	C311G / SPC
Cânula Fictícia 10,55 mm	HRS Scientific	C311DC / 1 / SPC
Nome< / strong>	Empresa< / strong>	Número de catálogo	Comentários
>Procedimento de microdiálise
CMA 402 Bomba de seringa	Harvard Apparatus Canada	CMA-8003110
Microsseringa 2.5ml Vidro	Harvard Apparatus Canada	CMA-8309021
Clipe de seringa Médio para 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Giro Giratório Revestido de Quartzo de Canal Duplo de Baixo Torque	Instech Laboratories Inc.	375 / D / 22QM
GSC Suporte de anel de suporte de ferro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Grampos de ângulo ajustável	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich Canada	S5761-500G	para líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)
MgCl2 Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich Canada	M8266-100G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
NaCl Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich Canada	S7653-1KG	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Ácido L-Ascórbico	Sigma-Aldrich Canada	A5960-25G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Cloreto de Potássio KCl	Sigma-Aldrich Canada	P9333-500G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato de Sódio Monobásico	Sigma-Aldrich Canada	S0751-1KG	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
CaCl2 Cloreto de Cálcio	Sigma-Aldrich Canada	383147-100G	Para Líquido Cefalorraquidiano Artificial (aCSF)
Pneu		mais leve	para sondas construídas em laboratório / Disponível na maioria das lojas
de ferragens Cola Epóxi Pneu			canadensePara Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Super Cola Gel	Pneu		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Tubo Termo Retrátil 0.063" Diâmetro Interno Gardner Bender	Pneu		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
Rodas de Corte Dremel #409	Pneu Canadense		Para Sondas Construídas em Laboratório / Disponível na maioria das lojas de ferragens
BD Needle 26 Gauge 0,5 Inch PrecisionGlide Estéril 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Para Sondas Construídas
em Laboratório BD Needle 21 Gauge 1,5 Inch PrecisionGlide Estéril 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Aço Inoxidável 26G Um Pé	HRS Scientific	SST-26/FT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/20 .024" OD X .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/10 .024" OD X .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Para Sondas Construídas em Laboratório
Tubulação de Polietileno PE/50 .038" OD X .023" ID	HRS Scientific	C313CT	Para sondas construídas em laboratório
30S WIRE ST. ST 0,008X 1' Científico	008BSH/30S	HRS	para pontas de prova construídas laboratório
Polymicro Technologies Diâmetro interno flexível 50µ da tubulação capilar do silicone fundido; m, Diâmetro Externo 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	para sondas construídas em laboratório
Spectra Por 132294 membranas de fibra oca de microdiálise 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	para sondas construídas em laboratório
Colar de aço inoxidável	Sirnay In.c	304	para sondas construídas em laboratório / Custome made
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Aparelho de concussão
Brass Peso	Rapido Mé tal Inc.		Prenda o laço de metal à base
Metal Loop	Rona Inc.		Disponível na maioria das lojas de ferragens
Tubo guia de PVC	Rona Inc.		Disponível na maioria das lojas de ferragens
Alluminum Foil	Alcan		Disponível na maioria dos supermercados
Fita			Disponível comercialmente
Suporte de Anel de Suporte de Ferro Fundido GSC	Fisher Scientifique	S13748
Estrutura de Plexiglas em Forma de U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.
almofada de espuma	D & R Espuma Inc.
Lâminas de barbear	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb.	Pneu		Disponível na maioria das lojas de ferragens
Cronômetro
			Baxter Disponível na maioria dos varejistas de artigos esportivos