Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

O infarto agudo do miocárdio (IM) é a expressão mais severa das cardiopatias isquêmicas (DIC). A IHD é a principal causa de morbidades e mortes em todo o mundo, especialmente nos países ocidentais¹. Consequentemente, tem um enorme impacto econômico nos sistemas de saúde². A im caracteriza-se pela oclusão de uma artéria coronária por placa aterosclerótica e subsequente apreensão do fluxo sanguíneo em grandes partes do miocárdio. A falta de suprimento de oxigênio no miocárdio leva à morte isquêmica dos cardiomiócitos. Esta condição patológica desencadeia respostas no tecido ventricular que, em última análise, leva a deficiências nas funções ventriculares, remodelação e insuficiência cardíaca³. A im é uma condição fisiopatológica complexa que envolve múltiplos e intrincados processos biológicos compreendendo morte celular regulada, resposta ao estresse oxidativo, inflamação, cicatrização de feridas, fibrose e remodelação ventricular. Algumas dessas respostas biológicas são modeladas como processos individuais in vitro como liberação induzida por necrose de padrões moleculares associados a danos e respostas inflamatórias associadas⁴. Esses modelos simplificados são essenciais para a compreensão do IM. No entanto, apenas um modelo in vivo pode fornecer uma imagem realista da complexidade dos processos biológicos engajados em resposta ao im.

Mesmo que os modelos de im em animais maiores como suínos possam se relacionar mais estreitamente com a fisiopatologia humana do IM, o poder dos modelos murinos reside nas possibilidades oferecidas pela engenharia genética que é mais avançada do que em qualquer outra espécie de mamífero. Outros aspectos não-negligenciáveis são o baixo custo relativo e a simplicidade da configuração cirúrgica.

Vale ressaltar que os modelos de isquemia-reperfusão do miocárdio podem apresentar diferentes desfechos do que os modelos de im permanentes. Processos biológicos como o tipo de morte celular engajada, qualidade/amplitude ou cinética de respostas inflamatórias e de cicatrização de feridas no tecido miocárdico podem variar de acordo com o modelo^5,6,7. No entanto, este protocolo de oclusão coronária permanente pode ser facilmente adaptado para obter um modelo de isquemia-reperfusão.

Este método é relevante para estudos relacionados à fisiopatologia do im sem reperfusão e permite o monitoramento de processos patológicos ocorridos desde a oclusão coronária (minutos) até a insuficiência cardíaca tardia (semanas) no tecido cardíaco local e sistêmica Níveis.

Experimentos com animais descritos neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê de ética animal do Cantão de Vaud.

Nota: para estes experimentos, utilizamos camundongos machos C57Bl/6J pesando entre 25 g e 30 g e uma idade de 8-12 semanas. Camundongos foram alimentados com pelotas de ração e água ad libitum e criados condições convencionais. O equipamento cirúrgico foi previamente esterilizado. O experimentador deve usar luvas cirúrgicas estéreis e uma máscara cirúrgica para limitar a contaminação e infecções pós-operatórias.

1. anestesia e canulação traqueal.

1. Pesar o mouse para determinar a dosagem de drogas anestésicas, medicação analgésica pós-operatória e volume corrente do ventilador. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 ° c. A configuração cirúrgica é descrita na Figura 1.
2. Injete o rato intraperitonealmente com uma mistura de cetamina e xilazina numa dose de 80 mg/kg e 10 mg/kg, respetivamente.
3. Raspar rapidamente o pêlo do rato na garganta e no lado esquerdo da caixa torácica usando uma navalha elétrica.
4. Verificar a profundidade da anestesia por beliscar cauda e/ou patas traseiras e liquidar o animal em uma posição supina na almofada de aquecimento. Coloc uma compressa pequena da gaze a cabeça do animal para evitar o superaquecimento dos olhos. Aplique gel ocular para evitar a secura ocular.
5. Fixe os quatro membros com fita adesiva na superfície da almofada de aquecimento. Passe um laço de 5-0 sutura de seda os incisivos superiores e furar a extremidade do laço com fita adesiva na almofada de aquecimento. Isto manterá a boca do animal aberta e facilitará o cannulation.
6. Aplique o creme da remoção do cabelo nas áreas pre-raspadas e massageie delicadamente com um cotonete do algodão por 1 minuto. Limpe o excesso de pêlo e creme com uma gaze. Use gotas de 0,9% solução salina e gaze para limpar as áreas de incisão. Aplique pedaços de gaze estéril na garganta raspada e tórax e mergulhe-os em iodopovidona.
   Nota: Recomendamos a aplicação de um medicamento anestésico local (lidocaína ou bupivacaína) a sítios de incisões.
7. Definir o ventilador em um volume corrente de 7 mL/kg e taxa de ventilação de 140 cursos/min.
   Nota: a partir de agora trabalho um estereomicroscópio de microcirurgia.
8. Segure a pele no centro da garganta e realize uma incisão de 0,5 cm seguindo uma linha caudal/cefólica usando uma tesoura pequena. Separe os lóbulos da glândula salivar e, em seguida, separe suavemente a fáscia do músculo esternohióide com fórceps de dissecação curvada até que a laringe e a traquéia sejam visíveis. Bordas seguras da abertura com os afastadores Unidos às faixas elásticas.
   Nota: faça este passo sem incisão dos músculos. Um operador treinado será capaz de intubar o animal através da cavidade oral sem visualização da traqueia tornando esta etapa opcional.
9. Segure suavemente a língua lateralmente. Com fórceps, insira a agulha interna Blunted de uma cânula de 16 G na traquéia. Visualize a inserção correta na traquéia através da incisão na garganta.
10. Conecte a cânula ao ventilador e assegure a ventilação correta coloc a tubulação de exaustão na água. A presença de bolhas indica intubação correta.
    Nota: a fim de manter os tecidos molhados durante o local de operação gaze estéril embebido com 0,9% solução salina e iodopovidona na incisão da garganta. Controle a umidade durante o procedimento.

2. ligadura da artéria coronária de LAD

1. Solte a pata anterior esquerda da fita adesiva e mova cuidadosamente o mouse para a posição decúbito do lado direito. Fixe o membro anterior esquerdo uma vez que o animal está na posição correta.
2. Identifique a linha entre o peitoral esquerdo menor e os músculos principais e faça uma incisão oblíqua da pele em 1 cm com as tesouras que seguem a linha. Com dissecção Blunt micro tesoura, fáscia separado dos músculos peitorais sem incisão. Manter os músculos peitorais separados com retractores ligados a bandas elásticas.
3. Ajuste o ventilador com uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H₂O.
4. Abra a cavidade torácica usando fórceps sem corte no espaço intercostal 3^RD entre 3^RD e 4^ª costelas. Evite tocar a artéria torácica interna, pois há perigo de sangramento. Não toque no coração ou no pulmão. Aplique dois retractores na caixa torácica, uma em cada costela (Figura 2a).
5. Com uma pinça fina curvada, Retire cuidadosamente o pericárdio e puxe-o para além sem prejudicar o coração e os pulmões.
6. Localize a artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD). A artéria LAD aparece como uma linha vermelha brilhante superficial que corre da borda da aurícula esquerda em direção ao ápice.
7. Use um suporte da agulha para passar uma sutura de seda 7-0 o LAD 2 a 3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos. Puxe a seda lentamente para evitar um rasgo de tecido cardíaco. Amarre a ligadura com três nós. A parte inferior esquerda do ventrículo esquerdo ficará imediatamente pálida ao ligar a ligadura (Figura 2b-E).
   Nota: é importante não ir muito profundamente na cavidade ventricular ou ficar muito superficial. Para animais Sham-operated, puxe a seda da sutura o LAD e remova-a lentamente evitando rasgar do tecido.
8. Solte os retractores costela, segure o 3^RD costela com fórceps e fazer dois passes com uma sutura de seda 6-0 o 3^RD e 4^ª costelas.
   Cuidado: não o coração ou o pulmão perfurados. Não aperte nós ainda.
9. Coloque três gotas de 37 ° c 0,9% solução salina para a abertura e feche o tubo de exaustão de expiração para 2 ou 3 ciclos respiratórios para inflar adequadamente os pulmões. Aperte a sutura e fixe com dois lances.
10. Libere os afastadores que prendem os músculos e ajude-os a recuperar seu lugar correto.
11. Feche a pele torácica com dois pontos de seda de sutura 5-0 e prenda com dois lances. Feche a pele da garganta com um ponto da seda da sutura 5-0 e prenda-a com dois lances.

3. procedimentos e acompanhamento pós-operatórios.

1. Remover bandas de fita adesiva de membros. Coloque uma compressa na almofada de aquecimento do lado direito do animal.
   Nota: o procedimento geral da anestesia para este ponto não deve demorar mais de 40-45 min. opcionalmente injetar IP 0,2 mL de atipamezol em uma concentração de 0,1 mg/mL para acelerar o processo de acordar.
2. Injectar intraperitonealmente 0,3 mL de solução de glucose a 5% pré-aquecida a 37 ° c.
3. Gire com cuidado o animal no decúbito ventral na almofada da compressa.
4. Pare o ventilador; Se o rato respirar espontaneamente, retire cautelosamente a cânula.
5. Injetar subcutâneo (SC) 0,1 mg/kg buprenorfina e colocar camundongos em uma gaiola pré-aquecido aquecida a 30 ° c e ventilada com um 100% O₂ para um mínimo de 1 h. monitore camundongos para qualquer condição potencialmente fatal, como dispneia excessiva ou hemorragia.
6. Durante os dois primeiros dias após a cirurgia, monitore o mouse duas vezes ao dia. Injetar SC 0,1 mg/kg buprenorfina duas vezes por dia. Injectar intraperitonealmente 0,3 mL 0 de solução de glucose a 5% duas vezes por dia. Forneça ratos com dieta macia e água ad libitum. Aqueça o animal, se necessário.
   Nota: além de opioides, os animais devem ser fornecidos com anti-inflamatórios não esteroidais misturados na dieta ou diluídos em água potável.
7. A partir do terceiro dia, injetar SC 0,1 mg/kg buprenorfina duas vezes ao dia se o animal exibe quaisquer sinais incomuns sobre a aparência geral, respiração ou comportamento. Intraperitoneally injetar 0,3 mL de solução de glicose a 5% duas vezes por dia, se o animal ainda está perdendo peso. Aqueça o animal, se necessário.
   Nota: aplique estritamente os critérios de interrupção predefinidos quando necessário para evitar o sofrimento excessivo. Geralmente os ratos perdem peso até o dia 3 e 4 e depois ganham peso. Após sete dias, os ratos geralmente recuperam o peso da pré-operação.

Camundongos foram eutanasiados sete dias após a cirurgia. Os animais foram anestesiados com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. anestesia, o sangue foi extraído da veia cava e o coração foi amostrado. Os átrios foram removidos, o miocárdio foi lavado em PBS gelo-frio. Para medições de áreas isquêmicas, os corações foram congelados a-20 ° c por 40 min, depois cortados e corados por 20 min a 37 ° c em PBS contendo 2% de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). As fatias cardíacas foram fixadas durante a noite em solução de paraformaldeído tamponado a 4% à temperatura ambiente. As áreas isquêmicas permaneceram não manchadas visto que o tecido vivo foi manchado no vermelho devido à presença de dehydrogenases. As áreas isquêmicas foram calculadas como percentual de área branca do ventrículo esquerdo (ve) com um software de imagem (Figura 3a, B). Para análises bioquímicas e de biologia molecular, os corações foram congelados em nitrogênio líquido. Após a moagem de corações em nitrogênio líquido, o pó de órgão foi utilizado para a extração de proteínas e mRNA. A extensão da fibrose no tecido miocárdico de corações infartados foi avaliada pela análise de Western blot da actina de músculo liso alfa (αSMA) e da fosforilação SMAD2, que são respectivamente grandes leituras de miofibroblastos e de ativação da sinalização TGFβ ( Figura 3C). a expressão de mRNA de TGFb, e alvos a jusante ctgf, postn e Il11 são todos os indicadores da fibrose miocárdica. Isso foi demonstrado pela análise da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) (Figura 3D).

As vias de sinalização pró-inflamatória e a expressão de genes pró-inflamatórios foram tipicamente ativadas na primeira semana após o infarto do miocárdio. A fosforilação do fator de transcrição NF-κB p65 é uma marca registrada da inflamação e foi observada em extratos de miocárdio inteiros dos camundongos MI (Figura 3E). a expressão de mRNA dos genes pró-inflamatórios Il1b, Il6 e Cxcl10 (Figura 3F) e dos marcadores monócitos/macrófagos Cd14 e Mertk foram analisadas por PCR em tempo real (Figura 3G). Note-se que houve uma variabilidade na extensão da fosforilação NF-κB p65 e SMAD2 (Figura 3C,e, Lanes 4-7). Esta variabilidade depende em grande parte do tamanho do enfarte.

Figura 1 : Descrição da configuração cirúrgica. (A) a instalação cirúrgica compreende uma almofada de aquecimento modificada, um ventilador e uns afastadores Unidos às faixas elásticas. (B) conjunto de tesouras, fórceps e suporte da agulha utilizados durante a cirurgia. (C) close-up dos mini-Retractors. Não mostrado: microscópio estéreo cirúrgico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Imagens representativas da cirurgia e ligadura de Lad. (A) peito aberto com Retractors. O ventrículo esquerdo era aparente. Os afastadores superiores, esquerdos e inferiores seguraram o retractor caixa torácica e direito segurou o músculo dos peitoral. (B) a agulha foi aprovada o Lad. (C) a seda da sutura foi passada o rapaz, no ventrículo esquerdo. (D) ponto único no rapaz. (E) fim do procedimento de ligadura, a sutura foi fixada com três nós. (F) representação de uma visão anterior do coração. A posição da ligadura do LAD era 2-3 milímetros abaixo dos átrios esquerdos e acima da filial diagonal do LAD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Fibrose e inflamação em todo o miocárdio extrai sete dias após a cirurgia. (A) imagens representativas da coloração de TTC de um coração infartado cortado sete dias após A cirurgia. As áreas isquêmicas pálidas permaneceram não manchadas e brancas visto que o tecido vivo era vermelho manchado. A ligadura era visível na terceira fatia da esquerda. (B) o tamanho das áreas isquêmicas de cinco corações infartados foi medido utilizando-se a técnica de coloração TTC. Os resultados foram a porcentagem de área branca do ventrículo esquerdo (ve). (C) análise de Western blot de SMAD2 fosforilação e expressão de alfa-sma em miocárdio inteiro como indicadores de fibrose. (D) expressão de mRNA de TGFb, ctgf, postn e Il11 em extratos de miocárdio inteiros. (E) Western blot de NF-κB p65 fosforilação em extratos de miocárdio inteiros. (F) expressão de mRNA de genes pró-inflamatórios Il1b, Il6 e Cxcl10 em extratos de miocárdio inteiros. (G) expressão de mRNA de Cd14 e mertk como indicadores da presença no miocárdio de monócitos/macrófagos e macrófagos fagocíticos, respectivamente. N = 3 em Sham e N = 4 no grupo MI. Para a análise da expressão de mRNA, a expressão foi relativa ao controle endógeno Rps18 e as comparações de grupo foram os testes T de Student não pareados, * p ≤ 0, 5, * * p ≤ 0, 1, * * * p ≤ 0, 1. Nos painéis as barras de erro B, D, F e G representam desvios padrão.  Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.