Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.
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Artigo de método
Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós apresentamos uma aproximação cytometric do do fluxo para analisar ROS mitochondrial na vária medula viva (BM)-populações derivadas da pilha da haste e do progenitor dos ratos saudáveis assim como ratos com AML conduzido por MLL-AF9. Especificamente, nós descrevemos um processo de coloração da pilha de duas etapas, por meio de que as pilhas saudáveis ou da leucemia BM são manchadas primeiramente com um corante cromogênicos fluorogênicos que detecte superóxidos mitochondrial, seguidos manchando com os anticorpos monoclonais fluorochrome-lig que são usados para distinguir várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas do progenitor. Também fornecemos uma estratégia para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo. Todo o protocolo pode ser realizado em um prazo tão curto quanto 3-4 h. Destacamos, também, as principais variáveis a serem consideradas, bem como as vantagens e limitações do monitoramento da produção de Eros no compartimento mitocondrial de subpopulações hematopoiéticas e de leucemia de tronco e progenitoras ao vivo, utilizando corantes fluorogênicos por citometria de fluxo . Além disso, nós apresentamos dados que a abundância mitochondrial dos Ros varia entre subpopulações saudáveis distintas do hspc e progenitores da leucemia e discutimos as aplicações possíveis desta técnica na pesquisa hematológicas.
Introdução
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas derivadas de oxigênio molecular. A localização celular mais bem definida da produção de Eros é a mitocôndria, onde elétrons que passam pela cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são absorvidos por oxigênio molecular, levando à formação de um específico tipo de ROS denominados superóxidos1. Através das ações de uma série de enzimas, chamadas superóxido superóxido ou Sods, os superóxidos são convertidos em peróxidos de hidrogênio, que são posteriormente neutralizados em água por enzimas como catalase ou glutationa peroxidases (GPX). Per....
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Protocolo
Todos os procedimentos animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no Fox Chase Cancer Center.
Nota: O fluxo de trabalho do protocolo é dividido em 4 partes conforme apresentado na Figura 1 e os reagentes necessários estão listados na tabela de materiais.
1. isolação da medula óssea (BM)
Nota: Os ratos da leucemia de MLL-AF9 foram gerados como descrito previamente11.
- Recupere pilhas mono-nucleares da medu....
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Resultados
Apresentado é um método para análise de ROS nas mitocôndrias de múltiplas populações de progenitoras de leucemia, saudáveis e MLL-AF9. A Figura 1 exibe uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo, que consiste em 4 etapas principais: 1) isolamento BM de camundongos; 2) coloração das células BM com corante fluorogênico que reconhece ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) mancha do anticorpo do marcador de superfície para delinear várias populações hematopoiéticas saudáv.......
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Discussão
Corantes fluorogênicos que foram desenvolvidos para a detecção de Eros são freqüentemente avaliados em células fixas por microscopia ou em células ao vivo por citometria de fluxo22. A avaliação citométrica do fluxo de Ros mitochondrial em pilhas de BM usando tinturas cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros tem duas vantagens principais: 1) é uma técnica rápida e simples que seja apropriada para a análise viva da pilha e 2) permite distinguir e analisar raro populações no nível de célula ún.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Fox Chase Cancer Center Conselho de administração (DDM), a sociedade americana de Hematologia Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e do departamento de defesa (Award #: W81XWH-18-1-0472).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FBS VWR Seradigm inativado por calor | LIFE SCIENCE | 97068-085 | Mídia |
| Penicilina Estreptomicina | Corning | 30-002-CI | Mídia |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Tampão |
| 15 mL tubo cônico | BD falcon | 352096 | Suprimentos para cultura de tecidos |
| Tubo cônico de 50 mL | BD falcon | 352098 | Tissue Suprimentos de Cultura |
| 40 μ filtros de células m | Fisher Scientific | 22-363-547 | Suprimentos para cultura de tecidos |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Suprimentos para cultura de tecidos |
| Menadiona bissulfito de sódio | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidante |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidante |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | anticorpo |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Anticorpo |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Anticorpo |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Anticorpo |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Anticorpo |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Anticorpo |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Anticorpo |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Anticorpo |
| CD117 Clone APC-Cy7 2B8 | Biolegend | 105825 | Anticorpo |
| Sca1 peacific Clone azul D7 | Biolegend | 108120 | Anticorpo |
| CD150 Clone APC TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Anticorpo |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Anticorpo |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Anticorpo |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Verde | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| Dye Vivo/Morto Amarelo Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
Referências
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A.
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Reimpressões e permissões
