Summary
De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.
Abstract
De (p) ppGpp nucleotide fungeert als een wereldwijde regulator in bacteriën in reactie op een verscheidenheid van fysieke en voedings stress. Het heeft een snel begin, in seconden, wat leidt tot accumulatie van niveaus die benaderen of overtreffen die van GTP Pools. Stress omkering gevallen een snelle verdwijning van (p) ppGpp, vaak met een halveringstijd van minder dan een minuut. De aanwezigheid van (p) ppGpp resulteert in veranderingen van cellulaire genexpressie en metabolisme die de schadelijke effecten van stress tegengaan. Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën hebben verschillende responsmechanismen, maar beide zijn afhankelijk van (p) ppGpp concentratie. In elk geval is het noodzakelijk om tegelijkertijd veel radioolabeled bacteriële culturen te controleren op tijdsintervallen die kunnen variëren van 10 seconden tot uren tijdens kritieke stress overgangsperioden. Dit protocol behandelt deze technische uitdaging. De methode maakt gebruik van de temperatuur-en Shaker-gestuurde micro titer schotel incubatoren die parallelle monitoring van de groei (extinctie) en snelle bemonstering van gelijkmatig fosfaat-radiolabeled culturen op te lossen en kwantificeren nucleotide Pools door Dunnelaagchromatografie op PEI-cellulose. Kleine hoeveelheden monster zijn nodig voor meerdere technische en biologische replicaties van analyses. Complexe groei overgangen, zoals diauxische groei en snelle (p) ppGpp-omzet percentages kunnen met deze methode kwantitatief worden beoordeeld.
Introduction
De (p) ppgpp tweede boodschapper is een wereldwijde regulator die de uitdrukking van een groot aantal genen moduleert, inclusief genen voor het synthetiseren van ribosomomen en aminozuren1,2. Hoewel aanvankelijk ontdekt in Escherichia coli3, (p) ppgpp kan worden gevonden in zowel grampositieve en gram negatieve bacteriën, alsmede in plantaardige chloroplasten4,5. Voor E. coli en andere gram-negatieve bacteriën, (p) ppgpp communiceert rechtstreeks met RNA polymerase op twee verschillende sites6,7,8. In gram positieven, (p) ppgpp remt de overvloed van GTP, die wordt gedetecteerd door CodY, een GTP-bindend eiwit met genen-specifieke DNA-herkennings motieven die leiden tot Regulation9,10. p) ppgpp hoopt zich op als reactie op de honger naar verschillende voedingsstoffen en stress condities, wat resulteert in langzame groei en aanpassingen van de genexpressie, omaanpassing aan stress mogelijk te maken.
Het nettobedrag van ppgpp geaccumuleerd weerspiegelt een evenwicht tussen stikstofoxidesynthetase en hydrolase activiteiten. In E. coli rela is een sterke stikstofoxidesynthetase en SpoT is bifunctioneel, met een sterke hydrolase en een zwakke stikstofoxidesynthetase, die elk kunnen verschillend worden gereguleerd in een stress afhankelijke manier. De sterke rela stikstofoxidesynthetase wordt geactiveerd wanneer de beschikbaarheid van codon-gespecificeerde tRNA gebonden aan het ribosomale een site als het niet voldoet aan de eisen van eiwitsynthese13,14,15. De zwakke plek (p) ppgpp stikstofoxidesynthetase wordt geactiveerd terwijl de sterke (p) ppgpp hydrolase wordt geremd in reactie op andere stress condities en via andere mechanismen. Onder bepaalde omstandigheden kunnen eiwitten zoals ACP of RSD binden aan SpoT, wat ook het evenwicht tussen hydrolyse en synthese16,17verandert. In gram positieven weerspiegelen synthese en hydrolyse een complexere balans tussen een enkele rela SpoT homo (rsh) eiwit met sterke synthese en hydrolyse activiteiten, evenals kleinere hydrolasen en/of synthetases12.
De (p) ppGpp nucleotiden werden voor het eerst ontdekt als ongewone 32p gelabelde vlekken die verschenen op autoradiogrammen van dunnelagige chromatogrammen (TLC) tijdens een strenge respons geïnduceerd door aminozuur honger3. Meer gedetailleerde labeling protocollen zijn beoordeeld 18. Het protocol dat hier wordt beschreven (Figuur 1) is een wijziging van deze protocollen waarmee de groei van meerdere monsters op microtiterplaten kan worden gecontroleerd. Dit vergemakkelijkt meerdere biologische en technische schattingen van (p) de overvloed aan ppGpp-veranderingen en werd aanvankelijk ontwikkeld voor studies naar diauxische verschuivingen19. Etikettering van (p) ppGpp met 32p en detectie door TLC maakt ook metingen van (p) ppgpp-afbraak percentages mogelijk. Er zijn alternatieve methoden ontwikkeld om (p) ppGpp-niveaus zoals massaspectrometrie, HPLC20, fluorescerende chemosensoren21,22en GFP-gen-fusies te bepalen voor de door ppgpp23 getroffen initiatiefnemers; 24. fluorescerende chemosensoren hebben momenteel een beperkt gebruik vanwege kleine spectrale verschuivingen na binding van ppgpp evenals problemen die onderscheid maken tussen ppgpp en pppgpp21. Deze methode is efficiënt om te detecteren (p) ppGpp in vitro, maar niet in cellulaire extracten. Methoden met betrekking tot HPLC zijn verbeterd20 maar vereisen dure apparatuur en zijn niet goed aangepast aan hoge door-put. Tot slot, GFP Fusions kan een schatting van ppGpp afhankelijke activering of remming te geven, maar niet meten ppGpp zelf. Hoewel elk van deze alternatieve methoden waardevol is, vereisen ze dure apparatuur of aanzienlijke hands-on tijd, of ze zijn anderszins niet vatbaar voor meerdere kinetische bemonstering en daaropvolgende verwerking. Met de hier beschreven methode kunnen 96 monsters worden toegepast op zes TLC-platen in ongeveer 20 minuten (18 samples per plaat), opgelost door TLC-ontwikkeling in minder dan een paar uur, met kwantitatieve gegevens verkregen na enkele uren of 's nachts, afhankelijk van het labelen Intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media voorbereiding
-
Voor MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur) media25, gebruik 1/10 volume van 10X Mops zouten, 1/100 volume van 100x micronutriënten oplossing, 3 mm natriumfosfaat voor nachtelijke culturen of 0,2 mm natriumfosfaat voor uniforme labeling met 32P, 0,2% glucose en 1 μg/mL thiamine (vitamine B1). Voeg indien nodig aminozuren toe bij 40 μg/mL.
- Voor MOPS zouten, gebruik 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4cl, 2,6 mm K2dus4, 5 ΜM CACL2, 10,56 mm MgCl2, en 500 mm NaCl. Voeg de verschillende componenten in de bestelling geschreven om neerslag te voorkomen. Breng aan op pH 7,4 met KOH en steriliseren door filtratie.
- Voor 100x micronutriënten oplossing, gebruik 3 μM (NH4)6(mo7)24, 0,4 mm H3Bo4, 30 μM COCl2, 10 μm CuSO4, 80 μM mncl2en 10 μM znso4. Steriliseren door autoclaven.
- Voor glucose (20%) en natriumfosfaat (300 mM) oplossingen, steriliseren als afzonderlijke 100x-voorraden door autoclaven. Steriliseren 100x voorraden van thiamine en aminozuur mengsels door filtratie. Bereid nieuwe media voor van steriele voorraadoplossingen voor elk experiment.
2. etikettering met 32P
- Kweek 's nachts culturen in MOPS media met 3 mM natriumfosfaat.
- Voeg in een 24-waterput 550 μL MOPS-media toe met 0,2 mM natriumfosfaat drager en 30 μL van elk bacterieel entmateriaal (verdunning 1/20). Dit zal een initieel entmateriaal van OD600nm 0,1 produceren. Gebruik een goed met verse media als Steriliteits controle.
- Plaats de plaat op een schudden incubator bij 37 °C schudden bij 900 rpm gedurende 30 min. culturen worden van onderen verwarmd en schudden zorgt voor beluchting. Bevestig de plaat stevig met tape om kantelen of morsen te voorkomen. De groei kan worden gemonitord met een duplo plaat parallel in de media zonder 32P met behulp van een plaat lezer en geïnbroed onder dezelfde omstandigheden.
- Voeg 100 μCi toe aan elk goed van 32P ORTHOFOSFAAT (20 μL van een 5 MCI/ml kolf).
Opmerking: De hoeveelheid radioactiviteit kan ook worden aangepast om aan de experimentele behoeften te voldoen. Voor lage basale niveaus 100 μCi met 0,2 mM draagbare fosfaat werkt goed, maar voor het meten van (p) ppGpp-niveaus die naar verwachting gelijkwaardig aan GTP-Pools worden, kan label worden gedropt tot 25 of 50 μCi. Verlaging van het drager fosfaat onder 0,2 mM wordt niet aanbevolen om te voorkomen dat fosfaatconcentraties voor groei worden beperkt.
Letop: 32P is een β-uitstralend isotoop dus gebruik de juiste afscherming gespecificeerd voor veiligheid. Alle radioactieve stoffen moeten op de juiste manier worden afgevoerd, waarbij alle mogelijke voorzorgsmaatregelen worden genomen. - Groei in schud incubator voor 1 tot 2 doublings (1 uur of meer) om het externe etiket grotendeels te laten equilibreren met intracellulaire nucleotide-Pools voordat het stress inducerende.
3. inductie van stress of verhongering
-
Induceren stress met behulp van een methode van uw keuze, afhankelijk van het soort stress bestudeerd, bijvoorbeeld het toevoegen van metabole pathway remmers, veranderende temperatuur, uitputtende vereiste voedingsstoffen, verschuiving van osmolariteit verschuivingen, inducerende oxidatieve stress, het toevoegen van toxines, etc.
- Voeg bijvoorbeeld 100 μg/mL L-Valine toe om Isoleucine verhongering te induceren in E. coli K-12 stammen. Verhoogde niveaus van ppGpp zal worden waargenomen na 5 minuten van inductie.
4. bemonstering en ppGpp-extractie
- Voeg 20 μL van elk gelabeld celmonster toe aan een PCR-buisbuis van 0,2 mL met 20 μL ijskoud 6 M mierenzuur.
- Plaats de monsters onmiddellijk in droogijs.
- Verbeter cellulaire extractie-efficiëntie door 3 cycli van invriezen en ontdooien.
- Net voor het spotten van PEI cellulose dunne laag chromatogrammen, centrifugeer monsters gedurende 1 minuut bij maximale snelheid naar pellet celpuin om te voorkomen dat het te spotten op chromatogrammen.
5. Dunnelaagchromatografie
- Markeer met een zacht potlood een oorsprong lijn 1 cm van de rand van de 20 cm x 20 cm PEI-cellulose TLC-plaat die 5 cm van de bovenkant met een schaar heeft verwijderd. Breng 5 μL aan als druppel in het PEI-oppervlak voor elk monster. Begin met stijgende ontwikkeling zonder deze plek te laten drogen, wat de resolutie verbetert doorstrepen te minimaliseren.
- Doe stijgende ontwikkeling in een tank met een laag van 1,5 M KH2po4 (pH 3,4) oplossing ondiep genoeg zodat vloeistof de oorsprong sample Spot niet aanraakt. Bedek de tank met een luchtdichte afdichting en laat vloeibare klim naar de bovenkant van de getrimde plaat, 15 cm. Om pH 3,4 voor een 1,5 M KH2po4 oplossing te bereiken, is het noodzakelijk de pH aan te passen door toevoeging van H3po4.
- Verwijder het volledig ontwikkelde chromatogram en de lucht drogen bij kamertemperatuur.
- Knip en gooi het bovenste (pH-voor) gedeelte van het chromatogram met de vrije 32P in radioactief afval. Dit deel wordt weergegeven in gele kleur in Figuur 2 en gemakkelijk gevisualiseerd onder UV-licht. Bij het meten van alleen (p) ppGpp-nucleotiden die langzamer migreren dan GTP, wordt het aanbevolen om een UV-zichtbare GTP-standaard uit te voeren en vervolgens een groter bovenste gedeelte (boven de GTP, zoals weergegeven in Figuur 2) te knippen en weg te gooien.
- Stel autoradiografische films 's nachts bloot met een fosfor scherm.
- De film te ontwikkelen. Vang en kwantificerings het fosfor scherm signaal met een fosfoimager.
6. kwantifictatie van (p) ppGpp
- Quantitaat radioactieve vlekken met afbeelding J26,27.
Opmerking: De hoeveelheid (p) ppGpp kan genormaliseerd worden tot de totale hoeveelheid G nucleotiden die in elk monster wordt waargenomen (Figuur 2). Als de hoeveelheid achtergrond homogeen is, kan één spatie (vak 4 van Figuur 2) worden afgetrokken om te corrigeren voor achtergrond. Totaal G is de som van GTP + ppGpp + pppGpp gedetecteerd. Deze normalisatie gaat ervan uit dat de GMP-en BBP-niveaus verwaarloosbaar zijn, wat geldt voor E. coli. De verhouding van een gegeven nucleotide tot totaal G biedt een belangrijke manier om te corrigeren voor variaties van toegepast monstervolume.
7. meting van de snelheid van ppGpp-verval
Opmerking: Een wijziging van dit protocol maakt metingen van de ppGpp-verval percentages mogelijk.
- Na het provoceren van stress of honger voor een tijd voldoende om ppGpp accumulatie (stap 3), omkeren van de stress om te blokkeren van aanhoudende ppGpp synthese, die detectie van hydrolytische tarieven mogelijk maakt. De procedure voor omkering zal afhangen van de stress. Voeg bijvoorbeeld 200 μg/mL chlooramfenicol toe om de honger in het aminozuur te keren.
- Verval percentages zijn meestal snel, maar kunnen variëren, dus neem monsters elke 20-30 s tot 2 min. proces samples zoals in stap 4.
- Zodra de TLC is ontwikkeld (zoals in stap 5) en de niveaus van ppGpp verkregen tijdens de tijd cursus, plot resterende ppGpp inhoud op een semi-logaritmisch plot VS tijd om visualisatie van nul order percentages van verval, als een rechte lijn, en schatting van de ppGpp Half-Life.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In E. coli K-12 stammen, de toevoeging van valine provoceert een endogene honger van isoleucine, wat resulteert in een toename van ppGpp niveaus na 5 min3. Cellen die zijn geteeld in MOPS met alle aminozuren, met uitzondering van ILV, werden gelabeld met 32P zoals aangegeven in Figuur 1. Eenmaal geëtiketteerd, werd 6 μL van 10 mg/mL L-Valine (100 μg/mL eindconcentratie) toegevoegd voor de productie van Isoleucine-verhongering. Monsters werden genomen 0 en 5 min na de toevoeging van valine. Na 5 min (Figuur 3a), een 2 en 2,5-voudige stijging van de niveaus van ppgpp en pppgpp opgetreden. Als een negatieve controle werd een cel vrij gelabeld monster gebruikt om mogelijke verbindingen op te sporen die niet ORTHOFOSFAAT waren in de 32P-bron. Ook, met inbegrip van de ppGpp deficiënte stam (Δrela ΔspoT) als een negatieve controle kan helpen een betere identificatie van de vlekken.
Omkering van Isoleucine honger kan worden bereikt door chlooramfenicol, een remmer van de eiwitsynthese, waardoor het verbruik van de opgeladen Ile-tRNA en op zijn beurt, herstelt hoge ratio's van opgeladen naar niet-geladen tRNA. Activering van de sterke rela-gemedieerde ppgpp-stikstofoxidesynthetase wordt afgeschaft, waardoor een meting van de afbraak van ppgpp door de rest synthese wordt verstoord. Daarom werd 200 μg/mL chlooramfenicol toegevoegd aan de uitgehongerd culturen en daarna werden monsters genomen met 20 s intervallen. In dit geval vervalt ppGpp met een halveringstijd van ongeveer 64 s (Figuur 3b).
Figuur 1: meting van ppGpp door TLC-workflow. Schematische weergave van het protocol om ppgpp vormen bacteriële culturen en de posterieure detectie door TLC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve TLC-analyse. Schematische weergave van de resultaten verkregen na autoradiografie en fosfor scherm 's nachts met de TLC. De te meten vlekken worden rood weergegeven. De formule voor het berekenen van de fractionele hoeveelheid ppGpp wordt ook weergegeven. Totaal G verwijst naar het totale aantal GTP + ppGpp + pppGpp dat in het monster is aangetroffen. De gele band representeren de pH-voorzijde zichtbaar onder UV-licht. Schaar geeft aan waar het raadzaam is om het chromatogram te snijden om de meeste radioactiviteit te verwijderen. De pijl geeft de richting van de stroom aan tijdens stijgende ontwikkeling met 1,5 M fosfaatbuffer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: meting van de synthese en het verval van ppGpp. A) detectie van ppGpp door TLC voor monsters van 0 en 5 minuten na toevoeging van valine. Plaatsen die overeenkomen met GTP, ppGpp en pppGpp zijn gemarkeerd. Een cel-vrije cultuur werd opgenomen als negatieve controle (C-). B) bederf van ppGpp na toevoeging van chlooramfenicol om de verhongering van het aminozuur te keren. De ppGpp halfwaardetijd wordt bepaald door de exponentiële verval ratio vertegenwoordigd door stippellijnen. Foutbalken reflecteren SD van duplicaten. Y-as wordt weergegeven in een semilogaritmic (Log2) schaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bereiken van de meest uniforme labeling van de cellen is een kritieke stap voor dit protocol. Daarom is het gebruik van gedefinieerde media, zoals MOPS of tris media, van cruciaal belang om variatie van de drager fosfaatconcentraties en specifieke activiteit mogelijk te maken. Fosfaat gebufferde media, zoals M9 of media A, kunnen niet worden gebruikt. De meeste ongedefinieerde media bevatten variabele hoeveelheden fosfaat, zoals lb, vorming en casamino zuren. De fosfaat-isotoop 33p is een zwakkere emitter die kan worden vervangen door 32p. voordelen van de vervanging zijn dat het veiliger en heeft een halfwaardetijd van 25 dagen in plaats van 14 dagen voor 32P. De meer energetische emissies van 32P verbeteren echter de detectiegevoeligheid aanzienlijk. Het is belangrijk om te benadrukken de gevaren van het werken met isotopen en het belang van het gebruik van de juiste afscherming bescherming en verwijdering. De recente ontdekking van een riboswitch in staat om specifiek ppGpp28 te detecteren kan op een dag leiden tot een veiligere manier om ppgpp in vitro en in vivo te detecteren. Zoals vermeld in de inleiding, bestaan er andere methoden, hoewel het gebruik van fosfaat etikettering een gevoelige, directe en snelle benadering blijft voor door metingen van bacteriële (p) ppGpp en andere fosfaat gelabelde verbindingen, zoals ribo-of deoxyribo-NTP zwembaden, PRPP, PPi of suiker fosfaten.
Een andere belangrijke stap is om ervoor te zorgen dat de groei van de parallelle culturen (beven incubator en plaat lezer) vergelijkbaar is. Bij het bestuderen van nutriënten uitputting, zoals diauxic SHIFT19, is de Synchrony tussen culturen cruciaal. De vergelijkbaarheid van de groei op gelabelde en niet-gelabelde platen kan worden beoordeeld door OD600 -metingen van een niet-gelabelde put op de anderszins radioactieve plaat. Om het aantal geteste monsters te verhogen, kan een 96 goed plaat worden gebruikt in plaats van 19, maar de hoeveelheid media die nodig is om de verdamping te minimaliseren, zal de beluchting van de cultuur verminderen. Basale niveaus van (p) ppGpp zal iets hoger tijdens de groei in een 96 goed plaat in vergelijking met een 24 put plaat als gevolg van de verminderde beluchting. Daarom wordt voor het meten van de basale niveaus een 24-goed-plaat groei aanbevolen. Voor het meten van variaties van meer sterk geïnduceerde (p) ppGpp niveaus, een 96 goed plaat heeft de voorkeur. De keuze tussen 24 en 96 goed microtiterplaten is afhankelijk van het experimentele doel.
Variaties van dit protocol hebben veel potentiële toepassingen voor verschillende omstandigheden van stress. Onlangs hebben we het toegepast om accumulatie en verval van ppGpp te meten tijdens klassieke diauxische verschuivingen van glucose naar lactose en naar andere alternatieve suikers. Deze studies onthulde de betrokkenheid van zowel glucose verhongering en aminozuur hongersnood19. Hier beschrijven we aminozuur honger geïnduceerd door Valine in E. coli K12 stammen als een eenvoudigere en goed bestudeerde stress conditie3. Dit voorbeeld kan worden gebruikt als een besturingselement voor het uitvoeren van ingewikkelder honger situaties. Aminozuur verhongering kan worden uitgelokt door het toevoegen van beperkte hoeveelheden van een vereist aminozuur dat is uitgeput tijdens de groei; het toevoegen van een remmer van tRNA aminoacylatie of synthese (serine hydroxamaat, Mupirocin, of 3-aminotriazol) of voor E. coli K12 toe te voegen Valine in de afwezigheid van Isoleucine). Serine hydroxamaat wordt vaak gebruikt voor de remming van de tRNA-serumaminoacylatie, maar vereist hoge concentraties, wat problemen kan veroorzaken als gevolg van de reactiviteit van hydroxamaat met andere verbindingen. Omkering van serine hydroxamaateffecten door toevoeging van een grote hoeveelheid serine kan niet-gewenste effecten hebben1. Hoewel SHX is bewezen effectief als een diagnose van ppGpp productie, we raden het gebruik ervan voor fysiologische studies te produceren aminozuur honger, omdat normale (p) ppGpp feedbackmechanismen worden afgeschaft, zoals fysiologische gevolgen het verlagen van overbodige activiteiten, maar het activeren van regelgevende circuits voor stress-overleving mogelijk maken.
Wijzigingen van de TLC-procedures die hier worden beschreven, zijn noodzakelijk om niet-canonieke regelgevende nucleotiden naar behoren te scheiden, zoals (p) ppApp29, van gemengde monsters met (p) ppGpp. Er is aangetoond dat pppapp een antagonistische rol heeft aan ppgpp in vitro30,31; Daarom is een betere scheiding van beide verbindingen vereist voor toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en Human Development, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D.
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V.
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
