Summary
Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.
Abstract
Çeşitli fiziksel ve beslenme stresine yanıt olarak bakterilerde küresel bir regülatör olarak (p) ppGpp nükreotid fonksiyonları. Bu, GTP havuzlarının yaklaşması veya aşan düzeylerin birikmesine yol açan, saniyeler içinde hızlı bir başlangıça sahiptir. Stres ters durumlar (p) ppgpp, genellikle bir dakikadan az bir yarı ömrü ile hızlı bir ortadan kalkması. (P) ppGpp varlığı, stres zararlı etkileri karşı hücresel gen ifade ve metabolizma değişiklikler sonuçlanır. Gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin farklı reaksiyon mekanizmaları vardır, ancak her ikisi de (p) ppGpp konsantrasyonuna bağlıdır. Herhangi bir durumda, kritik stres geçiş dönemlerinde 10 saniyeden saate kadar değişebilir zaman aralıklarında birçok radyoaktif bakteriyel kültürler aynı anda izlemek için bir ihtiyaç vardır. Bu protokol bu teknik sorunu giderir. Yöntem, büyüme (emici) ve homojen fosfat-radiolabeled kültürlerin hızlı örnekleme paralel izlenmesi izin sıcaklık ve Shaker kontrollü mikrotiter çanak inküküperlerin yararlanmak ve nükleyici havuzlar tarafından quantitate PEI-selüloz üzerinde ince katmanlı Kromatografi. Analizlerin birden fazla teknik ve biyolojik çoğaltır için küçük miktarlarda örnek gereklidir. Diauxic büyüme ve hızlı (p) ppGpp ciro oranları gibi kompleks büyüme geçişleri bu yöntem ile niceci olarak değerlendirilebilir.
Introduction
(P) ppgpp ikinci haberci ribozomlarda ve amino asitler synthesizer sentezlemek için genler de dahil olmak üzere genler çok sayıda ifade modülasyonlu bir küresel regülatör olduğunu1,2. Başlangıçta Escherichia coli3' te keşfedilen olsa da, (p) ppgpp hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilerin yanı sıra Plant kloroplast4,5' te bulunabilir. E. coli ve diğer gram-negatif bakteriler için, (p) ppgpp iki farklı sitede RNA polimeraz ile doğrudan etkileşime girer6,7,8. Gram pozitiplerinde, (p) ppgpp, CodY tarafından bilindiği GTP bereket inhibe, yönetmeliğine yol gen-spesifik DNA tanıma motifleri ile bir GTP-bağlayıcı protein9,10. (p) ppgpp farklı besin ve stres koşulları için açlık yanıt olarak birikir, yavaş büyüme ve gen ifadesi ayarlamaları sonuçlanan stres adaptasyon sağlamak için11,12.
Net miktar ppgpp birikmiş sentetaz ve hidrolaz etkinlikleri arasında bir denge yansıtır. E. coli rela güçlü bir sentetaz ve SpoT, güçlü bir hidrolaz ve zayıf bir sentetaz ile, her biri farklı bir stres bağımlı şekilde düzenlenmiş olabilir bifetit olduğunu. Güçlü rela sentetaz, Codon tarafından belirlenen şarj edilen tRNA 'nın, protein sentezi13,14,15taleplerini karşılamak için başarısız olduğunda ribozomal bir siteye bağlı olduğu zaman etkinleştirilir. Zayıf nokta (p) ppgpp sentetaz, güçlü (p) ppgpp hidrolaz diğer stres koşullarına ve diğer mekanizmalara yanıt olarak engellenmiş durumdayken etkinleştirilir. Bazı koşullar altında, ACP veya RSD gibi proteinler, aynı zamanda hidroliz ve sentez16,17arasındaki dengeyi değiştirmek SpoT bağlayabilirsiniz. Gram pozitişlerinde sentez ve hidroliz, güçlü sentez ve hidroliz faaliyetlerinin yanı sıra daha küçük Hidrolazlar ve/veya senthetaz12ile tek bir rela SpoT homolog (RSH) proteini arasında daha karmaşık bir denge yansıtır.
(P) ppGpp nükleotidler ilk amino asit açlık3tarafından indüklenen sıkı bir yanıt sırasında ince katmanlı kromatogram (TLC) autoradiograms ortaya çıkan olağandışı 32p etiketli noktalar olarak keşfedilen. Daha ayrıntılı etiketleme protokolleri 18değerlendirildi. Burada açıklanan protokol (Şekil 1), mikrotiter plakaları üzerinde birden fazla numunenin gelişimini izlemeyi sağlayan bu protokollerin bir değişikliğini oluşturmaktadır. Bu (p) ppGpp bolluk değişiklikleri birden fazla biyolojik ve teknik tahminler kolaylaştırır ve başlangıçta diauxic vardiya çalışmaları için geliştirilmiştir19. 32p ve TLC tarafından tespit edilen (p) ppgpp etiketlemesi de (p) ppgpp azalma oranlarının ölçülmesine olanak tanır. PpGpp23' ün etkilendiği organizatörler için kütle spektrometresi, HPLC20, floresan chemosensors21,22ve Gfp gen Fusions gibi ppgpp düzeylerini belirlemek üzere alternatif yöntemler geliştirilmiştir. 24. floresan chemosensors Şu anda sınırlı bir kullanım nedeniyle ppgpp ve pppgpp21arasında ayırt sorunları bağlama sonra küçük spektral vardiya vardır. Bu yöntem algılamak için etkilidir (p) ppGpp in vitro, ancak hücresel özler. HPLC içeren yöntemler20 geliştirilmiş ama pahalı ekipman gerektirir ve iyi yüksek aracılığıyla-put adapte değildir. Son olarak, GFP Fusions ppGpp bağımlı aktivasyon veya inhibisyonu bir tahmin verebilir, ancak ppGpp kendisini ölçmek değil. Bu alternatif yöntemlerin her biri değerli iken, onlar pahalı ekipman veya önemli Hands-on zaman gerektirir, ya da aksi takdirde birden fazla kinetik örnekleme ve sonraki işleme için uygun değildir. Burada açıklanan yöntemle, 96 numuneler yaklaşık 20 dakika içinde (plaka başına 18 numune) altı TLC plakasına uygulanabilir, TLC gelişimi tarafından birkaç saatten daha az bir süre içinde çözülebilir, etiketlemeye bağlı olarak birkaç saat veya gece sonra elde edilen nicel verilerle Yoğun -luğu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. medya hazırlığı
-
MOPS için (3-(N-morpholino) propanesulfonik asit) medya25, kullanın 1/10 hacım 10X Mops tuzları, 1/100 hacmi 100x mikroutrients çözeltisi, 3 mm sodyum fosfat gece kültürler için veya 0,2 mm sodyum fosfat için üniforma etiketleme ile 32P, 0,2% glikoz ve 1 μg/mL tiamin (B1 vitamini). Gerekirse 40 μg/mL 'de amino asitler ekleyin.
- MOPS tuzları için, 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO4, 95 mm NH4CL, 2,6 mm K2çok4, 5 ΜM CAcl2, 10,56 mm MgCl2ve 500 mm NaCl kullanın. Yağış önlemek için yazılmış sırayla farklı bileşenleri ekleyin. KOH ile pH 7,4 ayarlayın ve filtrasyon ile sterilize.
- 100x mikroutrients çözeltisi için 3 μM (NH4)6(Mo7)24, 0,4 mm H3Bo4, 30 μM COCL2, 10 μm Cuso4, 80 μm MNCL2ve 10 μm znso4kullanın. Otoklavlama ile sterilize.
- Glikoz için (% 20) ve sodyum fosfat (300 mM) çözümleri, autoclaving ile ayrı 100x stokları olarak sterilize. Filtrasyon ile tiamin ve amino asit karışımlarının 100x stokları sterilize. Her deney için steril stok çözümlerinden taze medya hazırlayın.
2. 32P ile etiketleme
- 3 mM sodyum fosfat ile MOPS medyasında gece kültürlerini büyütün.
- 24 kuyu plakasında, 0,2 mM sodyum fosfat taşıyıcı ve her bir bakteriyel inokülün 30 μL (seyreltme 1/20) içeren 550 μL MOPS medyası ekleyin. Bu od600nm 0,1 bir başlangıç inokulumunu üretecek. Taze medya ile bir iyi kullanın bir sterilility kontrolü olarak.
- 37 Ila 900 RPM 'de sallayarak 30 dakika boyunca sallama inkübörü üzerine plaka yerleştirin. kültürler aşağıda ısıtılır ve titreyerek havalandırılması sağlar. Eğme veya dökülmeleri önlemek için plakayı bantla sıkıca takın. Büyüme bir plaka okuyucu kullanarak 32P eksikliği medya paralel olarak çoğaltır plaka ile izlenebilir ve aynı koşullar altında kuluzlamak.
- 32P ortopedik her kuyu Için 100 μcı ekleyin (5 MCI/ml stoktaki 20 μl).
Not: Radyoaktivite miktarı da deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için ayarlanabilir. Düşük bazal seviyeleri için 100 0,2 mM taşıyıcı fosfat ile Μcı iyi çalışır, ancak GTP havuzlarına eşdeğer olması beklenen (p) ppGpp düzeylerinin ölçülmesi için, etiket 25 veya 50 Μcı değerine düşebilir. 0,2 mM 'nin altındaki taşıyıcı fosfat azaltılması, fosfat düzeylerinin büyüme sınırlamasından kaçınmak için önerilmez.
Dikkat: 32P β yayan izotoptur, böylece güvenlik için uygun kalkanlama kullanılır. Tüm radyoaktif maddeler düzgün tüm olası önlemleri alarak bertaraf edilmelidir. - 1 ila 2 doublings (1 saat veya daha fazla) dış Etiket büyük ölçüde hücre içi nüklatan havuzları ile stres inducing önce doğrultma izin vermek için kuluçk sallayarak büyümek.
3. stres veya açlık indüksiyon
-
Stres, örneğin, metabolik yol inhibitörleri ekleme, sıcaklık değiştirme, gerekli besinleri yorucu, oksidatif stres inducing, toksinler, vb ekleyerek, araştırılan stresin tür bağlı olarak, seçtiğiniz bir yöntem kullanarak stres
- Örneğin, E. coli K-12 suşlarında ısoleucine açlık teşvik etmek için 100 μg/ml L-valine ekleyin. PpGpp seviyeleri artan indüksiyon 5 dakika sonra gözlemlenir.
4. örnekleme ve ppGpp ekstraksiyon
- Her etiketli hücre örneğinin 20 μL 'yi, 20 μL buz soğuk 6 M formik asit içeren 0,2 mL PCR tüpüne ekleyin.
- Numuneleri hemen kuru buzda yerleştirin.
- Donma ve çözülme 3 döngüsü ile hücresel ekstraksiyon verimliliğini artırın.
- Hemen önce PEı selüloz ince tabaka kromatogram, Santrifüjü örnekleri 1 dakika maksimum hızda Pelet hücre enkaz Kromatogramlar üzerinde tespit önlemek için.
5. ince katmanlı Kromatografi
- Yumuşak bir kalem ile, 20 cm x 20 cm PEI-selüloz TLC plakasının kenarından, makas ile üstten 5 cm çıkarıldı olan bir kaynak çizgisini 1 cm işaretleyin. Her örnek için PEı yüzeyinde 5 μL bir damlacık olarak uygulayın. Bu noktanın kurumasına izin vermeden artan gelişmeye başlayın, bu da streaking 'i minimize ederek çözünürlüğü iyileştirir.
- 1,5 M KH2Po4 (pH 3,4) çözeltisi tabakası ile bir tankta artan gelişimi yapmak yeterli böylece sıvı kökeni örnek spot dokunmaz sığ. Tankını hava geçirmez bir mührü ile Kapla ve kesilmiş sac üst kısmına sıvı tırmanış, 15 cm. Bir 1,5 M KH2Po4 eriyik için pH 3,4 elde etmek için, H3Po4ilavesi ile pH ayarlamak gereklidir.
- Tam gelişmiş kromatogram ve hava oda sıcaklığında kuru çıkarın.
- Serbest 32P 'yi içeren kromatogram bölümünün üst (pH ön) kısmını radyoaktif atıklarla kesip atın. Bu kısım Şekil 2 ' de sarı renkte temsil edılır ve UV ışığı altında kolayca görselleştirilemez. GTP 'den daha yavaş göç eden sadece (p) ppGpp nükleotidler ölçümünde, UV görünür bir GTP standardı çalıştırması ve daha sonra daha büyük bir üst kısmı kesip ( Şekil 2' de gösterildiği gibi GTP üzerindeki bir şey) atmanız tavsiye edilir.
- Fosforlu ekran ile bir gecede autoradiographic filmleri açığa çıkarın.
- Filmi geliştirin. Phosphoımager ile fosforlu ekran sinyalini yakalayın ve quantitate.
6. (p) ppGpp 'nin quantitation
- Görüntü J26,27ile, radyoaktif lekeler quantitate.
Not: (P) ppGpp miktarı, her örnekteki toplam G nükleotidler miktarına normalleştirilebilir (Şekil 2). Arka plan miktarı homojen ise, arka planda düzeltmek için tek bir boş ( Şekil 2' den kutu 4) çıkarılır. Toplam G GTP + ppGpp + pppGpp algılandığı toplamıdır. Bu normalleştirme, GMP ve GSYH düzeylerinin ihmal edilebilir olduğunu varsayar ve bu da E. coliiçin geçerlidir. Verilen nükleotid toplam G 'ye oranı, uygulanan numune hacminin varyasyonları için düzeltmek için önemli bir yol sağlar.
7. ppGpp çürüme oranının ölçümü
Not: Bu protokol bir değişiklik ppGpp çürüme oranları ölçümleri sağlar.
- PpGpp birikimine izin vermek için yeterli bir süre için stres veya açlık provoke sonra (adım 3), hidrolitik oranlarının algılanmasını sağlayan devam ppGpp sentezini engellemek için stres ters. Tersine çevirme prosedürü strese bağlı olacaktır. Örneğin, herhangi bir amino asit açlık tersine çevirmek için 200 μg/ml kloramfenikol ekleyin.
- Çürüme oranları genellikle hızlı ama değişebilir, bu nedenle örnekleri her 20-30 s kadar 2 dk. Adım 4 ' te olduğu gibi Işlemler örnekleri.
- Bir kez TLC (adım 5 olarak) ve ppGpp seviyeleri zaman kursu sırasında elde geliştirilen, bir yarı Logaritmik Arsa vs zaman, düz bir çizgi olarak, ve ppGpp Half-Life tahmini olarak çürüme sıfır sipariş oranlarının görselleştirmeye izin zamanı, arsa kalıntı ppGpp içeriği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E. coli K-12 suşları, valin ilavesi ısoleucine bir endojen açlık provoke, 5 dakika sonra ppgpp seviyeleri bir artış sonuçları3. ILV hariç tüm amino asitleri içeren MOPS 'de yetiştirilen hücreler, Şekil 1' de belirtildiği gibi 32P ile etiketlenmiştir. Bir kez etiketlenmiş, ısoleucine açlık üretmek için 6 μL 10 mg/mL L-valine (100 μg/mL final konsantrasyonu) eklendi. Numuneler valine eklendikten sonra 0 ve 5 dk alınmıştır. 5 dakika sonra (Şekil 3A), ppgpp ve pppgpp düzeylerinde 2 ve 2,5 kat artış oluştu. Negatif kontrol olarak, 32P kaynağında ortopedik olmayan olası bileşikler tespit etmek için hücre içermeyen etiketli bir örnek kullanılmıştır. Ayrıca, bir ppGpp eksikliği gerilme dahil (Δrela δspoT) negatif bir kontrol olarak noktalar daha iyi bir kimlik yardımcı olabilir.
Isoleucine açlık ters kloramphenicol tarafından elde edilebilir, protein sentezi inhibitörü, hangi şarj edilen Ile-tRNA tüketimini azaltır ve sırayla, şarj edilmemiş tRNA için şarj yüksek oranlar geri. Güçlü rela-mediated ppgpp sentetaz aktivasyonu kaldırıldı, hangi ppgpp bozulma kalıntı sentezi ile soğukkanlı bir ölçü sağlar. Bu nedenle, 200 μg/ml kloramfenikol için açlık kültürlerine eklendi ve örnekleri sonra 20 s aralıklarla alınmıştır. Bu durumda, ppGpp yaklaşık 64 s (Şekil 3B) bir yarı ömrü ile çürüyor.
Resim 1: TLC iş akışı tarafından ppGpp ölçümü. PpGpp formu bakteriyel kültürler ve TLC tarafından posterior algılama ayıklamak için protokol şematik temsili. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: temsilci TLC analizi. TLC ile birlikte otoradyografi tekniklerinde ve fosfor ekranından elde edilen sonuçların şematik gösterimi. Ölçülecek noktalar kırmızı renkte gösterilir. Kesirli miktarını hesaplamak için formül ppGpp de gösterilir. Toplam G, örnekteki toplam GTP + ppGpp + pppGpp miktarını ifade eder. Sarı bant UV ışığı altında görünür pH ön temsil eder. Makas, radyoaktivitenin çoğunu atarak kromatogram kesmeyi önerdiğimiz yeri gösterir. Ok, 1,5 M fosfat tamponu ile artan gelişim sırasında akışın yönünü gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: ppGpp sentezi ve çürümesi ölçümü. (A) algılama ppGpp tarafından TLC numuneler için 0 ve 5 dakika ek sonra valine. GTP, ppGpp ve pppGpp 'ye karşılık gelen lekeler işaretlenir. Hücre içermeyen bir kültür negatif denetim (C-) olarak eklenmiştir. (B) amino asit açlık ters kloramfenikol eklendikten sonra ppgpp çürümesi. PpGpp yarı ömrü, noktalı çizgilerle temsil edilen üstel çürüme oranından belirlenir. Hata çubukları kopyaları SD yansıtır. Y ekseni bir semilogaritmic (günlük2) ölçeğinde temsil edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücrelerin yakın Tekdüzen etiketleme ulaşmak bu protokol için kritik bir adımdır. Bu nedenle, MOPS veya Tris medya gibi tanımlanmış medya kullanımı, taşıyıcı fosfat konsantrasyonları ve belirli aktivite varyasyonu sağlamak için çok önemlidir. M9 veya medya A gibi fosfat arabelleğe alınmış medya kullanılamaz. Çoğu tanımlanamayan medya, £, Tripton ve kasaminoz asitleri gibi değişken miktarlarda fosfat içerir. Fosfat izotopu 33p, 32p için yerine konulabilir daha zayıf bir emiter olduğunu. değiştirme avantajları daha güvenlidir ve 25 gün yerine 14 gün, 32P için yarı ömrü vardır. Ancak, 32P daha enerjik emisyonları önemli ölçüde algılama hassasiyeti artırmak. İzotoplarla çalışmanın tehlikelerini ve uygun koruyucu koruma ve bertaraf etme önemini stres etmek önemlidir. Bir riboswitch son keşfi özellikle ppGpp28 tespit edebilmek için bir gün daha güvenli bir şekilde ppgpp içinde vitro ve in vivo algılamak için yol açabilir. Giriş de belirtildiği gibi, diğer yöntemler var, fosfat etiketleme kullanımı bakteriyel (p) ppGpp yanı sıra diğer fosfat etiketli bileşiklerin yoluyla koymak ölçümleri için hassas, doğrudan ve hızlı bir yaklaşım kalır rağmen, gibi ribo-veya deokribo-NTP havuzları, PRPP, PPI veya şeker fosfat.
Başka bir kritik adım, paralel kültürlerin büyümesi (kuluçka ve plaka okuyucu sallayarak) benzer olduğundan emin olmaktır. Diauxic vardiya19gibi besin tükenmesi okurken, kültürler arasında SYNCHRONY çok önemlidir. Etiketli ve etiketlenmemiş plakalar üzerinde büyüme karşılaştırılması başka radyoaktif plaka üzerinde bir etiketsiz iyi OD600 ölçümleri ile değerlendirilebilir. Test edilen numunelerin sayısını artırmak için, 96 iyi plaka yerine 19kullanılabilir, ancak buharlaşma en aza indirmek için gerekli medya miktarı kültür havalandırmasını azaltacaktır. (P) ppGpp bazal seviyeleri düşük havalandırma nedeniyle 24 iyi plaka ile karşılaştırıldığında bir 96 iyi plaka büyüme sırasında biraz daha yüksek olacaktır. Bu nedenle, bazal seviyeleri ölçmek için, 24 iyi plaka büyüme önerilir. Daha güçlü indüklenen (p) ppGpp düzeylerinin varyasyonlarını ölçmek için 96 iyi bir plaka tercih edilir. 24 ve 96 arasında seçim iyi mikrotiter plakaları deneysel hedefe bağlıdır.
Bu protokolün varyasyonları, farklı stres koşulları için birçok potansiyel uygulamaya sahiptir. Son zamanlarda biz glukoz laktoz ve diğer alternatif şekerler klasik diauxic vardiya sırasında ppGpp birikimi ve çürümesi ölçmek için uyguladıysanız. Bu çalışmalar hem glikoz açlık ve amino asit açlık katılımı ortaya19. Burada daha basit ve iyi okudu stres durumu3olarak E. coli K12 suşlarında valin tarafından indüklenen amino asit açlık tarif. Bu örnek, daha karmaşık açlık durumları gerçekleştirmeden önce bir denetim olarak kullanılabilir. Amino asit açlık büyüme sırasında tükenmiş gerekli bir amino asit sınırlı miktarda ekleyerek provoke edilebilir; tRNA aminoacilasyon veya sentezi inhibitörü ekleme (serine hydroxamate, mupirocin, veya 3-aminotriazol) veya E. coli K12 ısoleucine yokluğunda valin ekleyerek). Serine hydroxamate genellikle tRNAser aminoacylation inhibe etmek için kullanılır ama yüksek konsantrasyonlar gerektirir, diğer bileşikler ile hydroxamate reaktivite nedeniyle sorunlara neden olabilir. Serin hydroxamate efektlerinin tersine çevrilmesi, büyük miktarlarda yini ekleyerek istenilen olmayan etkilere sahip olabilir1. SHX 'in ppGpp üretiminin tanısı olarak etkili olduğu kanıtlanmış olmasına rağmen, amino asit açlık üretmek için fizyolojik çalışmalar için kullanımını tavsiye etmiyoruz, çünkü normal (p) ppGpp geri besleme mekanizmaları kaldırıldığından, fizyolojik sonuçlar gibi Ancak stres hayatta kalma düzenleyici devrelerinin aktivasyonuna izin verir.
Burada açıklanan TLC prosedürlerinin modifikasyonları, (p) ppapp29gibi nankanonikal düzenleyici nükleotidler (p) ppgpp ile karışık örneklerden düzgün bir şekilde ayırmak için gereklidir. Bu pppapp ppgpp in vitro30,31için bir antagonistik rolü olduğunu gösterilmiştir; Bu nedenle, gelecekteki çalışmalar için her iki bileşiğin daha iyi ayrılması gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Intramural araştırma programı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve ınsan gelişimi, NıH destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D.
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V.
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -W., Park, Y. -H., Seok, Y. -J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
