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Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

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DOI:

10.3791/59598

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19 de junho de 2019

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1Dept. of Stress Neurobiology and Neurogenetics, Max Planck Institute of Psychiatry, 2Graduate School of Systemic Neurosciences, Ludwig Maximilians University, 3Max Planck Florida Institute for Neuroscience, 4Dept. of Neurobiology, Weizmann Institute of Science

Neste artigo

Resumo

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Resumo

A microscopia de dois fótons é uma ferramenta fundamental para a neurociência, pois permite a investigação do cérebro de animais vivos em escalas espaciais variando de subcelulares a níveis de rede e em escalas temporais de milissegundos a semanas. Além disso, a imagem de dois fótons pode ser combinada com uma variedade de tarefas comportamentais para explorar as relações causais entre a função cerebral e o comportamento. Entretanto, nos mamíferos, a penetração e o espalhamento limitados da luz limitaram a imagem latente intravital do dois-fóton na maior parte às regiões superficiais do cérebro, assim impedindo a investigação longitudinal de áreas do profundo-cérebro tais como o hipocampo. O hipocampo está envolvido na navegação espacial e memória episódica e é um modelo de longa data usado para estudar celulares, bem como processos cognitivos importantes para a aprendizagem e recordação, tanto na saúde e na doença. Aqui, uma preparação que permita o acesso ótico crônico ao hipocampo dorsal em ratos vivos é detalhada. Esta preparação pode ser combinada com a imagem latente ótica do dois-fóton na definição celular e subcellular na cabeça reparada, ratos vivos anestesiados durante diversas semanas. Estas técnicas permitem a imagem latente repetida da estrutura neuronal ou da plasticidade atividade-evocada em dezenas a centenas de neurônios no CA1 hippocampal dorsal. Além disso, esta preparação crônica pode ser usada em combinação com outras técnicas tais como a microendoscopia, a microscopia de campo larga cabeça-montada ou a microscopia do três-fotão, assim expandindo extremamente a caixa de ferramentas para estudar os processos celulares e da rede envolvidos na aprendizagem e na memória.

Introdução

Em mamíferos, o hipocampo é uma região-chave do cérebro para a codificação e recordação de memórias episódicas, bem como para a navegação espacial1,2,3,4. Por esta razão, o hipocampo tem sido-e ainda é-um modelo muito importante para estudar os mecanismos básicos que permitem que o cérebro para codificar e recordar memórias5,6,7 ou para navegar em um ambiente8 ,9 coletando recompensas e evitando perigos. Além disso, a formação do hipocampal é uma das regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados ao longo da vida de roedores10,11 e, possivelmente, de humanos12,13. Finalmente, a degeneração ou o comprometimento da formação do hipocampal estão associados a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo a doença de Alzheimer14.

Em camundongos, o hipocampo está localizado aproximadamente 1 mm abaixo da superfície do cérebro15. Sua posição impediu o acesso ótico no cérebro intacto e conseqüentemente, os estudos longitudinais da dinâmica hippocampal confiaram na maior parte na imagem latente da ressonância magnética (Sr.), na electrofisiologia, e em análises ex vivo da imagem latente. O Sr. métodos da imagem latente permite o seguimento de processos biológicos (por exemplo, mudanças da expressão de gene16) no mesmo animal sobre dias múltiplos, mas falta a definição espacial para discriminar únicos neurônios. As técnicas electrofisiológicas clássicas in vivo oferecem uma resolução temporal muito elevada e uma sensibilidade requintada às alterações do potencial de membrana. No entanto, eles têm uma resolução espacial limitada e eles não têm a capacidade de controlar de forma confiável as mesmas células em períodos de tempo mais longos. A imagem latente ótica permite que os processos mais diversos sejam estudados em virtude de suas resoluções temporais e espaciais elevadas. Entretanto, a imagem latente ex vivo fornece somente instantâneos de processos em curso, e assim não é apropriado para estudos longitudinais durante que os animais aprendem e recordam a informação.

A imagem latente ótica de in vivo combina algumas vantagens do Sr. imagem latente e da electrofisiologia com as aquelas da imagem latente ótica. Conseqüentemente, é muito poço-serido para análises longitudinais e correlativo da dinâmica e do comportamento do cérebro do rato. Isso é relevante em estudos de processos biológicos com escalas de tempo muito rápidas (milissegundos a segundos) ou muito lentas (dias a semanas). Exemplos para tais processos que são relevantes para a neurociência são a dinâmica de tensão de membrana, CA2 + transientes, plasticidade celular e mudanças estruturais, que são todos acreditados para ser muito importante para a formação da memória e recordação. Diferentes métodos ampliaram a imagem latente in vivo para o hipocampo dorsal18,19,20,21,22. As preparações agudas permitiram o rastreamento da atividade do neurônio piramidal (PN), bem como seus dendritos e espinhos dendríticos por várias horas20,22. Este período temporal, entretanto, não permite que as mudanças estruturais a longo prazo, que puderam fundamentam a aprendizagem incremental, sejam estudadas. Preparações crônicas-em combinação com microendoscópios23,24 ou com distância de trabalho longa (WD) os objetivos do microscópio padrão21 -permitiram a imagem latente repetida do hipocampo dorsal sobre diversos Semanas.

Aqui, nós descrevemos uma preparação crônica que forneça o acesso ótico periódico ao secundário-campo CA1 do hipocampo dorsal de ratos vivos usando uma cânula permanentemente introduzida da imagem latente. Esta preparação permite o acesso repetido ao CA1 sem distúrbio funcional e é apropriada para a imagem latente intravital do dois-fotão (2P) ou da epifluorescência do largo-campo. Dois exemplos da imagem latente crônica profunda do cérebro 2P no CA1 dorsal de ratos vivos são detalhados: imagem latente longitudinal da estrutura dendríticas e da dinâmica dendríticas da espinha e da imagem latente longitudinal da plasticidade atividade-evocada. As vantagens e as limitações salientes da técnica são discutidas.

Protocolo

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo governo da Alta Baviera (licence 2016_ROB-55.2 vet-2532. Vet_02-16-48) e pelos painéis administrativos de Stanford e Max Planck Florida Institute for Neuroscience em cuidados com animais de laboratório.

1. preparação da cânula de imagem

  1. Segure uma broca de precisão em um suporte de broca fornecido com uma tabela de régua móvel.
  2. Prenda um tubo do aço inoxidável do diâmetro de 3,0 milímetros na tabela móvel da régua.
  3. Cortar o tubo para um anel de metal de 1,6 mm de comprimento. Se as bordas do anel não são contundentes após o corte, arquivo para fora as irregularidades.
  4. Enxágüe o anel metálico e uma lamínula circular de vidro de 4 mm de diâmetro em 100% de acetona e deixe secar por ≈ 5 min.
  5. Coloc o anel do metal e o lamela de vidro em um lugar de trabalho liso, uniforme e limpo, um Stereoscope.
  6. Coloque uma gota de adesivo óptico de cura UV sobre uma superfície lisa, como um prato de Petri. Use uma agulha ou uma espátula para espalhar o adesivo para formar uma camada fina (< 0,5 mm).
  7. Use fórceps para mergulhar um lado do anel de metal no adesivo. Preste atenção especial para não selar o interior do anel. Se isso acontecer, use uma agulha para quebrar o adesivo óptico no anel.
  8. Usando o estereoscópio, posicione o anel metálico no centro da lamínula de vidro com o lado do anel coberto por adesivo tocando a lamínula. Um anel fino de adesivo deve formar-se na interface entre o anel de metal e a lamínula. Evite qualquer adesivo que se espalhe para o centro da lamínula.
  9. Ligue a unidade de LED de cura UV e a luz de brilho (365 nm) durante 1 min.
    Cuidado: a luz UV provoca queimaduras na pele e é um agente mutagênico. Use óculos de proteção UV e cubra as mãos e os braços com luvas e um jaleco para evitar a exposição cutânea.
  10. Para curar o adesivo uniformemente, certifique-se de todos os lados do anel são igualmente iluminados, alterando a direção da fonte de luz.
  11. Deixe o adesivo endurecer por pelo menos 2 h, de preferência, durante a noite.
  12. Segure firmemente a cânula da extremidade aberta do anel de metal por meio de um hemostat. Usando uma broca dental equipada com um arquivo giratório e trabalhando o estereoscópio, o arquivo fora do excesso de lamínula de vidro até nivelar com os lados do anel (Figura 1a).

2. implantação da cânula de imagem sobre o hipocampo dorsal

  1. Preparação de equipamentos e configuração
    1. Certifique-se de todos os instrumentos cirúrgicos são limpos e estéreis. Se estiver usando um esterilizador de talão de vidro para esterilização, limpe os instrumentos e coloque-os no esterilizador (definido como 250 ° c) por 10 min, antes de usar. Alternativamente, autoclave os instrumentos antes de usar.
    2. Prepare todos os materiais exigidos para a cirurgia, assim como instrumentos cirúrgicos, de modo que possam ser alcangado prontamente.
    3. Certifique-se que há bastante medicamentos preparados na hora, como analgésicos ou drogas anti-inflamatórias.
    4. Certifique-se de que há isoflurano suficiente para toda a duração da cirurgia (aproximadamente 1 h por cirurgia).
    5. Gire sobre o tapete do aquecimento e ajuste-o a 37 ° c para manter a temperatura animal estável quando a anestesia.
    6. Certifique-se de que o sistema de eliminação de isoflurano está a funcionar.
    7. Abra a válvula de fluxo de oxigênio.
  2. Indução anestésica e fixação animal
    1. Coloque o rato na câmara de indução anestésica a 3% de isoflurano em 1 L/min O2 e aguarde até perder a consciência. Avalie a anestesia usando o teste do reflexo da pitada do dedo.
    2. Pesar o animal.
    3. Aplique anti-inflamatórios (meloxicam, 1mg/kg) e analgésico (Vetalgin, 200mg/kg) medicamentos por via subcutânea.
    4. Posicione o mouse sobre o tapete de aquecimento. Certifique-se de que o animal não está em contacto directo com o tapete de aquecimento para evitar queimaduras térmicas.
    5. Fixe a cabeça ao aparelho estereotáxico e posicione o cone do nariz para cobrir o focinho. Para manter a anestesia, diminua o isoflurano para 1,5-2%. Durante toda a cirurgia, monitore o estado do rato monitorando visualmente a respiração e testando o reflexo da pitada do dedo do pé. Regule a percentagem de isoflurano, se necessário.
    6. Aplique pomada oftálmico aos olhos para evitar a desidratação e a cegueira potencial.
      Nota: para anestesia e medicação animal, métodos alternativos e medicamentos são possíveis. Por favor, consulte a sua licença animal e a literatura relativa.
  3. Implante de cânula óptica
    1. Ligue a fonte de luz de fibra óptica.
    2. Retire o cabelo e desinfete a pele sobre a cabeça do rato.
    3. Usando tesouras e fórceps, retire o couro cabeludo do mouse. Comece fazendo um pequeno corte no couro cabeludo em uma posição próxima ao lambda. Continue abrindo o couro cabeludo nos dois lados. Primeiro mova lateralmente no sentido das orelhas, então rostrally, no sentido de órbitas do olho, para dar forma a um triângulo no eixo sagital, aproximadamente 4 milímetros rostral a Bregma. Preste atenção para não cortar muito perto de orelhas e olhos, mas expor Bregma e lambda, bem como os ossos parietais e a metade posterior dos ossos frontais.
    4. Aplique uma gota (≈ 10 mgs) de lidocaína (28,9% v/v em álcool) para o crânio.
    5. Limpe o periósteo e seque o crânio usando um cotonete.
    6. Posicione as barras de ouvido, para fixar a cabeça do mouse.
    7. Faça uma pequena craniotomia, usando uma microbroca com uma Burr de 0,5 mm de largura. Posicione o furo no osso frontal oposto ao hipocampo imaged, aproximadamente 1,5 milímetros da sutura sagital e 2 milímetros distantes da sutura coronal.
    8. Parafuse um parafuso do osso do aço inoxidável da largura de 0,86 milímetros no furo do crânio.
    9. Se necessário, limpe os detritos e seque o crânio.
    10. Preparação de uma mistura de cimento adesivo rápido
      1. Usando uma colher pequena (≈ 4,5 mm de diâmetro), dispense 1-1.5 colheres de nível de L-pó em um poço de mistura.
      2. Dispense 3-4 gotas de base rápida para o poço.
      3. Dispense 1 gota de catalisador universal no poço.
      4. Mexa a mistura para 5-10 s usando um aplicador de precisão.
        Nota: os cimentos alternativos estão disponíveis. Por favor, consulte as instruções do fabricante.
    11. Use aplicadores de precisão para aplicar cimento adesivo rápido sobre o crânio, parafuso e pele circundante. Deixe secar por 30 s a 1 min.
    12. Use uma broca de trefina de 3,0 mm de diâmetro para fazer uma craniotomia no osso parietal. Posicione o orifício aproximadamente 1,5 mm distante da sutura sagital e 2 mm distante da sutura lambdóide.
    13. Retire cuidadosamente a aba óssea.
    14. Verifique o tamanho da craniotomia usando a cânula para se certificar de que ele se encaixa. Use uma micro-broca da largura de 0,5 milímetros ou de 0,9 milímetros para ampliar a craniotomia se necessário.
    15. Retire as meninges usando fórceps Dumont.
    16. Matéria cortical do ablate, para alcangar a cápsula externa. Use uma agulha sem corte de 0,9 mm de diâmetro (calibre 19) conectada a uma bomba de vácuo. Irrigar com soro fisiológico para evitar a desidratação do tecido exposto e para lavar o sangue residual após o sangramento é resolvido. Sugar o tecido cortical lentamente, ≈ 50-100 μm em um momento, até que o córtice se desprende da cápsula, expondo as fibras do cíngulo ou do corpo caloso do corpus. Mude a agulha freqüentemente, para impedir o entupimento.
    17. As fibras se estendem principalmente em três direções (Figura 1b). Descasque cuidadosamente as fibras dorsais até que as fibras mais profundas (alveus do hipocampo) sejam expostas.
    18. Enxague o tecido com soro fisiológico. Use fórceps fino para mergulhar a cânula inferior em soro fisiológico e posicioná-lo sobre o buraco do crânio. A cânula e o tecido têm de ser selados por soro fisiológico para evitar a captura de bolhas de ar entre a cânula e o tecido.
    19. Empurre a cânula no crânio (Figura 1C) até que a cobertura de vidro esteja em contato com as fibras.
    20. Seque o crânio bem usando triângulos de absorção, cotonetes de algodão e/ou a bomba de vácuo.
    21. Preparação de uma mistura de cimento adesivo rápido (consulte a etapa 2.3.10).
    22. Use aplicadores de precisão para aplicar cimento adesivo rápido sobre o crânio. Aplique o adesivo também na borda da cânula. Tenha cuidado para não deixar o adesivo correr para a cânula. Deixe secar por 30 s a 1 min.
    23. Use um braço estereotódico para posicionar uma placa de suporte de cabeça sobre a cânula, em contato com o crânio.
    24. Preparação de uma mistura de acrílico dental
      1. Usando uma colher (≈ 9 mm de diâmetro), dispense 1 colher de nível (1 parte) de pó em um poço de mistura.
      2. Dispense 2-3 partes de líquido no mesmo poço. Cubra todo o pó com o líquido.
      3. Mexa para ≈ 1 min usando uma espátula.
        Nota: acrílicos alternativos estão disponíveis. Por favor, consulte as instruções do fabricante.
    25. Use uma espátula ou um aplicador de precisão para aplicar acrílico em todo o crânio. Cubra todo o crânio exposto, o parafuso e a pele aberta com acrílico dental. Isso torna a preparação estável. Não deixe o acrílico correr pelo pescoço, orelhas e olhos.
    26. Deixe o acrílico secar e endurecer por cerca de 15 min.
    27. Aplique uma película adesiva removível na placa do suporte principal, para impedir que os restos entrem na cânula. Recomenda-se que o tamanho do filme corresponda ao da placa.
    28. Desligue o fluxo de isoflurano, retire o animal do aparelho estereotáxico e posicione-o sobre uma placa de aquecimento para manter a temperatura corporal fisiológica enquanto ela acorda da anestesia.
    29. Monitore o animal até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência esternal.
    30. Devolver o animal que sofreu uma cirurgia para a empresa de outros animais apenas quando totalmente recuperado.

3. cuidados pós-operatórios

  1. Verifique o estado do rato durante 2 dias após a cirurgia, monitorando o peso e o comportamento geral.
  2. Aplicar anti-inflamatórios (meloxicam, 1mg/kg) e dor Killer (Vetalgin, 200mg/kg) medicamentos por via subcutânea durante 2 dias após a cirurgia
    Nota: procedimentos de monitorização alternativos, medicamentos e dosagens são possíveis para cuidados pós-operatórios. Por favor, consulte a sua licença animal e a literatura relativa.

4. preparação da sessão de imagem

  1. Ative a configuração de imagem com antecedência e deixe o laser aquecer e estabilizar, se necessário.
  2. Anestesiar o rato (consulte o passo 2.2.1).
  3. Use o fórceps para remover cuidadosamente a película adesiva da placa do suporte principal. Segure o mouse em uma mão e a placa de suporte de cabeça com os dedos. Retire o filme suavemente, para evitar danificar a preparação.
  4. Posicione o rato o microscópio, sobre o tapete de aquecimento e fixe a placa principal ao suporte (Figura 1D).
  5. Posicione o cone do nariz para cobrir o focinho e diminua o isoflurano para 1,5-2%.
  6. Aplique pomada oftálmico aos olhos do rato.
  7. Limpe a cânula da imagem latente enxaguando com água deionizada. Use uma seringa e uma agulha fina para soltar a água na cânula e uma bomba de vácuo para removê-lo.

5. sessão de imagem

  1. Use a baixa ampliação, objetivos de trabalho longos da distância para verific visualmente a cânula para a água residual, a sujeira, a integridade e a presença de fluorescência.
  2. Alinhe a cânula ao eixo ótico ajustando os ângulos dos braços do suporte principal.
  3. Mude para a 25X 1,0 NA, 4 mm WD ou 40X 0,8 NA, 3 mm WD, objetivos de imersão em água. Adicionar água desionizada suficiente para encher a cânula e manter o excesso de água em cima da cânula. Evite a formação de bolhas de ar.
  4. Use a excitação 2P e os sinais fluorescentes da imagem.
    Nota: o protocolo de imagem é altamente dependente do tempo e escalas espaciais para ser imaged. Consulte as seções de resultados representativos e discussão para obter detalhes sobre as configurações de imagem que usamos para produzir as imagens mostradas neste artigo.

Resultados

Uma vez que a cânula é colocada apenas dorsal a CA1, o aspecto dorsal do CA1 é mais proximal ao microscópio se comparado com o ventral. O alveus é a estrutura mais proximal seguida em ordem por estrato Oriens (SO), estrato pyramidale (SP), estrato radiatum (Sr) e estrato lacunosum moleculare (SLM), a camada mais distal (Figuras 1B , C). A imagem latente longitudinal de 2P da estrutura neuronal com definição subcellular e da plasticidade atividade-evocada com definição celular é apresentada como resultados representativos. Para excitar a proteína fluorescente verde dos fluoróforos (GFP), d2Venus e TurboFP635, um femtossegundo pulsada ti: o laser da safira ajustado a 920 nanômetro é usado e o poder médio do laser é ajustado a 5-25 MW na amostra. Os comprimentos de onda diferentes da emissão são separados usando filtros da emissão e os tubos photomultiplicador diferentes.

Imagem longitudinal da estrutura dendrítica e dinâmica das espinhas dendríticas.

Para etiquetar a PNs hipocampal e visualizar sua estrutura, uma linha de mouse transgênica Thy1-GFP (linha M) é usada. Camundongos Thy1-GFP expressam GFP reforçada citoplasmática o controle do promotor Thy1 em uma população esparsa e aleatória de PNS25. Geralmente, o principal eixo de CA1 PNs é aproximadamente perpendicular ao plano de imagem XY (Figuras 1B, figura 2a e filme complementar 1). Os dendritos basais se estendem na SO, desde o soma até a cânula, enquanto os dendritos apicais e apicais se estendem distalmente à cânula, na direção oposta (filme complementar 1). Uma vez que a preparação deixa as fibras mais profundas do alveus intacta, algumas fibras fluorescentes que atravessam o campo de visão, logo abaixo da cânula, devem ser visíveis (Figura 2a e filme 1). A preparação permite a criação de imagens de dendritos PN com resolução da coluna vertebral (Figura 2 A-C). Para dendritos de imagem e espinhos dendríticos, um 25X 1,0 NA, 4 mm WD, lente de objetivo comercial de imersão de água é usado.

Para o rastreamento longitudinal, várias regiões cerebrais dentro do campo de visão da cânula são definidas durante a primeira sessão de imagem. Cada região corresponde a uma área de aproximadamente 240 x 240 μm e contém entre 1 e 7 segmentos dendríticos (Figura 2b). Essas regiões são mapeadas manualmente para uma pilha tridimensional de baixa ampliação mostrando o padrão da expressão GFP no volume abaixo da cânula de imagem (Figura 2a). Em seguida, 1 μm de pilhas de imagem z-Step de dendritos básicos CA1 PN são adquiridos em diferentes intervalos de tempo (de 24 h a 3 dias) por até cerca de 14 dias (Figura 2C). As durações e os intervalos mais longos da imagem latente são possíveis26. Cada sessão de imagem dura aproximadamente 60 a 90 min. Embora a maioria das imagens sejam de espinhos dendríticos no SO, também é possível a imagem de espinhos dendríticos nos dendritos oblíquos de SR (figuras 2D-F). Além da densidade da coluna vertebral, esse método possibilita o estudo da dinâmica da coluna, quantificando suas taxas de sobrevida, ganho e perda26,27,28,29,30, 31 de dezembro , 32. para marcar e rastrear espinhas dendríticas ao longo do tempo (Figura 2C), uma interface MATLAB personalizada é usada. Isto permite o alinhamento das pilhas da imagem adquiridas em pontos diferentes do tempo e suporta a rotulagem manual dos dendritos e das espinhas ao seguir comprimentos dendríticos e posições da espinha sobre o tempo26. Importante, este método pode ser usado para distinguir (por cada ponto de tempo, excluindo o primeiro) entre espinhas dendríticas pré-existentes e recém-nascidos. Isto é importante porque as classes diferentes de espinhos dendríticas são pensados para ter papéis diferentes na aquisição e na retenção da memória33.

Imagem latente longitudinal da plasticidade atividade-evocada.

Para a atividade de imagem-evocado plasticidade em CA1 PNs, a área do hipocampal dorsal CA1 é injetada com um vetor viral expressando fluorescente verde desestabilizado d2Venus através de uma forma reforçada do elemento responsivo atividade sináptica (E-SARE) dentro do arco potenciador/promotor e TurboFP635 fluorescente vermelho através do promotor Epgk 34. Isto permite níveis da imagem latente da plasticidade atividade-evocada das centenas de CA1 PNs em cada animal35. Dada a rotulagem muito densa de PNs, geralmente não é possível resolver os dendritos de CA1 PNs (filme complementar 2).

Para a imagem do SOMATA de CA1 PNs, um 40X 0,8 NA, 3 mm WD, lente objetiva de imersão de água é usado. Para rastreamento longitudinal, 1 a 9 regiões cerebrais são definidas por mouse durante a primeira sessão de imagem. Cada região corresponde a uma área de aproximadamente 300 x 300 μm e contém entre 50 e 150 células (Figura 3a). Essas regiões são mapeadas manualmente para pontos de referência locais do tecido visíveis em uma ampliação menor. Em seguida, são adquiridas pilhas de imagem de passo z de 3 μm, que abrangem o SP de CA1 PNs (Figura 3a e filme complementar 2) em diferentes intervalos de tempo (de 24 h a 6 dias) por até cerca de 30 dias. Cada sessão de imagem dura aproximadamente 60 a 90 min. picos de ativação de E-sare 6 a 8 h após uma exposição a um ambiente novo ou enriquecido (EE, Figura 3B) e decai ao longo de alguns dias. Assim, nós geralmente imagem 6 a 8 h após a experiência e permitimos 5 dias entre sessões de imagem35.

Para quantificar os valores de fluorescência d2Venus e TurboFP635, uma região de interesse circular 4,64 μm de diâmetro é desenhada, que é menor do que um corpo de células neurais, centrada no soma das células. Em seguida, progredimos para o próximo ponto de tempo, marcar o soma da mesma célula da mesma maneira e iterar esse procedimento para todos os pontos de tempo e todas as células visíveis no conjunto de dados longitudinal. O valor médio da emissão de d2Venus de cada Neuron (dependente da atividade) é normalizado por sua emissão TurboFP635 média (independente da atividade). Este método possibilita a investigação da dinâmica de longo prazo da plasticidade de Ensemble de CA1 PNs35 (Figura 3C).

figure-results-1
Figura 1: preparação para imagens ópticas cerebrais profundas in vivo. (A). superior (esquerda) e lado (direito) vistas do exemplo cannuals da imagem latente. As cânulas da imagem latente têm uma parte inferior de vidro transparente para permitir o acesso ótico ao hipocampo. (B). descrição esquemática da preparação destacando a posição relativa da cânula de imagem, um CA1 PN e as três camadas de fibras de dorsal a ventral. (C, D). Descrição esquemática da configuração de imagem (C) e da fixação animal (D) durante uma sessão de imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagem longitudinal da estrutura dendrítica e da dinâmica das espinhas dendríticas. (A). pilha de imagens 2P (projeção de intensidade máxima (MIP) de 59 planos de imagem, espaçamento z de 2 μm) de neurônios e dendritos rotulados por GFP em um mouse THY1-GFP ao vivo. (B). maior ampliação (MIP de 53 planos de imagem, 1 μm z-espaçamento) detalhando dendritos basais localizados em so. (C). Time-Lapse seqüência de imagem de um segmento dendrítico imaged mais de 14 dias. As pontas de seta indicam espinhos dendríticos rastreados ao longo de 14 dias. (D, E). pilha de imagens 2P de neurônios e dendritos rotulados por GFP em um mouse Thy1-GFP ao vivo; (D) projeção ZY (31 planos de imagem, 3 μm de espaçamento z) e (e) projeções XY (17 planos de imagem, 3 μm de espaçamento z). (F). maior ampliação (plano de imagem única) detalhando dendritos apicais e espinhos dendríticos localizados em Sr. ARROWHEADS indicam espinhas dendríticas. Excitação: 920 nm; pico de emissão: 510 nm. Barras de escala: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D e e, 15 μm; F, 4 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagem latente longitudinal da plasticidade atividade-evocada. (A). imagens 2P (planos de imagem única) de um rato ao vivo, mostrando as mesmas células no dia da linha de base 0 e depois de EE no dia 1. (B). pilhas de imagens 2P (MIPs de 4-6 planos de imagem, 3 μm de espaçamento z) mostrando padrões de ativação e-sare específicos para o ambiente A (dias 1, 19 e 25) e ambiente B (dias 7 e 13). Verde: d2Venus fluorescência. Vermelho: fluorescência TurboFP635. Excitação: 920 nm; d2Venus pico de emissão: 530 nm; TurboFP635 pico de emissão: 635nm. Barras de escala: A, 20 μm; B, 10 μm. Este número foi modificado de Attardo et al., 201835. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imagem latente da estrutura neuronal na DG hippocampal usando a microscopia do três-fotão (3P). (A-H). imagens 3P (planos de imagem única) de neurônios e dendritos rotulados por GFP em um mouse Thy1-GFP ao vivo detalhando (A-E) PNs nas células do grânulo CA1 e (F-H) na DG. Excitação: 1400 nm; pico de emissão: 510 nm. Barra de escala: 40 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme complementar 1: campo de visão de imagem em um mouse Thy1-GFP ao vivo. pilha de imagens 2P (83 planos de imagem, 7 μm de espaçamento z) de neurônios e dendritos rotulados por GFP (branco) em um mouse Thy1-GFP ao vivo, estendendo-se da parte inferior da cânula para SLM. Para dar conta da deterioração do sinal de fluorescência com maior profundidade, utilizou-se um gradiente não linear de ganho de tubos fotomultiplicadores. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Filme complementar 2: imagem latente da plasticidade atividade-evocada. pilha de imagens 2P (28 planos de imagem, 3 μm de espaçamento z) de neurônios expressando E-SARE repórter da expressão IEG em um rato vivo abrangendo SP. verde: d2Venus fluorescência. Vermelho: fluorescência TurboFP635. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, um procedimento para a imagem latente repetida de 2P do CA1 dorsal em ratos vivos é descrito. Após a cirurgia, o mouse geralmente se recupera dentro de 2 dias. O procedimento induz a Astrogliose mínima26,43. A hemorragia e o edema que puderam seguir a cirurgia são geralmente re-adsorbed dentro de 10 a 14 dias. Geralmente, a partir de 14 dias após a implantação, a preparação é suficientemente clara para realizar imagens intravitais. O sucesso da cirurgia não depende de trabalhar em um ambiente estéril. No entanto, é crucial manter um alto nível de higiene, para evitar complicações devido a infecções associadas à cirurgia. Isso é obtido por meio da limpeza meticulosa dos instrumentos cirúrgicos antes e após a cirurgia e pelo calor-esterilizando-os imediatamente antes de cada uso (passo 2.1.1). A cânula ótica é mantida em um recipiente limpo, esterilizado e enxaguada com soro fisiológico estéril pouco antes da implantação. A realização de práticas cirúrgicas comuns de desinfecção de mãos e limpeza da estação cirúrgica também é muito importante. A preparação permanece estável e permite imagens de resolução celular e subcelular por várias semanas26,35.

Etapas críticas, modificações e solução de problemas.

É importante descascar a cápsula externa até que as fibras mais profundas sejam expostas. A não exposição do alveus pode resultar na incapacidade de se concentrar no soma de PNS, ou em espinhas dendríticas de imagem de resolução reduzida, ao usar objetivos comerciais com WD de 3 ou 4 mm. Para este objetivo, é útil para ablação o neocórtex muito lentamente usando uma agulha de 0,9 mm de diâmetro e, em seguida, mudar para uma agulha de 0,3-0,5 mm de diâmetro (24-29 gauge) para um controle mais fino de sucção ao remover as fibras mais dorsal. Alternativamente, o fórceps fino pode ser usado para remover o córtice restante após a exposição da fibra36.

Sangramento durante a cirurgia pode ser problemático, como o sangue obstrui a visão. À espera do coágulo para formar e, em seguida, enxaguar com soro fisiológico para lavar afastado sangue residual é recomendado. Repita o que for necessário.

Um ajuste confortável entre a cânula e a craniotomia ajuda a aumentar a estabilidade da preparação, mantendo a cânula no lugar antes da aplicação do cimento, especialmente se a borda externa da cânula é nivelada com o crânio. Desde que os tamanhos da broca do trephine e da cânula são combinados, um ajuste frouxo pode levantar-se por causa das irregularidades no lado da cânula-que exigem craniotomias ligeiramente maiores caber (veja a etapa 2.3.14)-ou de uma craniotomia irregular. Todas as irregularidades da cânula devem ser arquivadas fora (etapas 1,3 e 1,12) e o trephine deve ser prendido perpendicular ao crânio até que a craniotomia esteja terminada (etapa 2.3.12). Removendo o trephine do crânio antes que a craniotomia esteja terminada pode conduzir às craniotomias irregulares.

Limitações- Invasividade e estabilidade da preparação.

É difícil avaliar o efeito da ablação cortical, pois é árdua definir com precisão as áreas afetadas direta e indiretamente. Em geral, a cirurgia remove parte do córtex parietal e parte do córtex sensorial do Visual e do retromembro21. O córtex ablado não projectou diretamente para o hipocampo e o tecido hipocampal não é tocado nem ferido. Importante, mostrou-se que a implantação de uma cânula da imagem latente não altera grosseiramente a função hippocampal e especificamente a aprendizagem hippocampal-dependente21,36,37,38, 39. Ainda assim, seria importante quantificar até que ponto a cânula e a parte externa do implante (placa de suporte principal e tampão acrílico dental) são estressores crônicos avaliando os níveis sanguíneos de corticosterona e o peso da glândula adrenal em comparação com ratos não implantados.

A preparação geralmente permanece estável de semanas a meses26. A longo prazo, o crescimento da pele e do osso tendem a deslocar a tampa acrílica e a aumentar a instabilidade da preparação da imagem latente.

Limitações ópticas.

A microscopia convencional de 2P permite a imagem latente até aproximadamente 1 milímetro profundamente no tecido neokortikalny40,41. Consistente com isso, é possível a imagem dendritos e espinhos dendríticos localizados no SR (Figura 2D-F) ou SLM36. Entretanto, a imagem latente através de uma cânula levanta limitações ao NA eficaz. Para atingir a resolução máxima, o diâmetro e a profundidade das cânulas de imagem devem ser combinados com a imagem NA, pois diâmetros menores e profundidades mais longas irão grampear a luz dos objetivos de alta NA. Por exemplo, quando a imagem latente com um objetivo da imersão da água de 1,0 NA através de uma cânula longa de 1,6 milímetros, um diâmetro interno de 3,65 milímetros é necessário para manter o NA completo. Entretanto, usar uma cânula deste diâmetro aumentará a compressão no hipocampo e pôde afetar a saúde do tecido, por esta razão, nós usamos uma cânula com um diâmetro menor. Quando a imagem latente com um objetivo da imersão da água de 0,8 NA através de uma cânula longa de 1,6 milímetros, um diâmetro interno de 2,5 milímetros seria suficiente para manter o NA completo. No entanto, os objetivos de imersão NA água 0,8 NA têm uma WD mais curta (3 mm no nosso caso), o que pode impedir a focagem no SP.

Estes cálculos aplicam-se ao centro do campo de visão na parte inferior da cânula. No entanto, movendo o campo de imagem de visão lateralmente-mais perto das bordas da cânula-ou concentrando-se mais profundamente no tecido-mais longe da superfície de vidro da cânula-diminui ainda mais o eficaz na no plano focal e, assim, reduz a resolução. Isto conduzirá à definição não-homogênea através dos volumes diferentes de tecido imaged e pode ser uma preocupação para a imagem latente quantitativa na definição subcellular, especial ao usar técnicas da super-definição tais como a microscopia 2P-STED42. Estas edições são menos importantes quando imagem latente na definição celular.

Movimento tecidual.

O movimento dentro do tecido-originando da respiração e do batimento cardíaco em animais anestesiados-tende a tornar-se mais severo com distância aumentada da cânula da imagem latente. Isto é possivelmente porque a cânula da imagem latente aplica a pressão mecânica ao cérebro que contraindo assim algum do movimento na vizinhança da cânula (similarmente às preparações neokortikalny). Assim, embora a imagem latente de espinhas dendríticas seja possível em Sr e em SLM, em nossas mãos, é dorsal o mais robusto ao so até ≈ 200 μm da superfície da cânula. Para compensar o movimento, usamos scanners ressonantes e média offline. Várias imagens (4 a 6 repetições) são adquiridas por plano de imagem de uma pilha z na velocidade máxima disponível (30 frames/s). Todas as repetições para cada plano z são então desvolvido (usando o software comercial, AutoQuant), registrado (usando ImageJ) e em média em uma única imagem26. Para a imagem latente dos SOMATA, o movimento é frequentemente insignificante em cima da anestesia35 e duas médias são frequentemente suficientes compensar artefatos do movimento.

Futuras aplicações ou direções do método .

A preparação pode ser combinada com microendoscópios26,43. Os micro-endoscópios são pontas de prova ópticas rígidas que usam microlentes do índice refração do inclinação (grin) para guiar a luz a e do tecido profundo18. O uso de microendoscópios permite cânulas de diâmetros menores ou mesmo sem cânulas. No entanto, microendoscópios comerciais são menos bem corrigidos para aberrações ópticas e têm menor NA do que os objetivos comerciais. As sondas atuais atingem resoluções laterais e axiais de ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respectivamente17,18,44. O uso de microendoscópios também possibilita a combinação desta preparação com os microscópios integrados de campo Widefield45,46,47.

O método presta-se igualmente para usar-se em ratos não-anestesiados, e tem sido usado para investigar a atividade celular usando sensores de CA2 + em ratos cabeça-fixos acordados21,37,48,49. Nesses casos, devido às escalas de tempo rápido das mudanças de fluorescência, é aconselhável implementar o registro de linha50. Também é possível adaptar a preparação para imagens de outras sub-regiões hipocampais, como o giro dentado (DG)39,51,52. Combinando esta preparação com 3P excitação53,54 com 1 MHz freqüência pulsada laser sintonizado para 1400 nm, fomos capazes de imagem mais profunda na formação do hipocampal atingindo a camada molecular, camada de células de grânulo e os da DG (Figura 4) sem retirar o CA1 sobrepondo.

Em conclusão, apresentamos um método que fornece acesso óptico ao hipocampo dorsal e permite estudos longitudinais e correlativos da dinâmica da estrutura e atividade do hipocampal. Essa técnica amplia as possibilidades de análise da função hipocampal condições fisiológicas e patológicas.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

A U. A. F. é apoiada pela Fundação Schram; C.-W. T. P. e W. G. são apoiados pela sociedade Max Planck; L.Y. e R.Y. são apoiados pela sociedade Max Planck e Instituto Nacional de saúde (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. é apoiada por uma subvenção do 7º PQ do Conselho Europeu de investigação, dos programas ERANET e I-CORE, do gabinete cientista-chefe do Ministério da saúde de Israel, do Ministério Federal da educação e da investigação, Roberto e Renata Ruhman, Bruno e Simone Lich, o Nella e Leon Benoziyo centro de doenças neurológicas, o Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, a Fundação de ciência de Israel a família Perlman, adelis, Marc Besen, Pratt e Irving I. fundações Moskowitz; A. a. é apoiada pela sociedade Max Planck, pela Fundação Schram e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). As imagens 3P foram adquiridas durante o curso avançado de técnicas de neuroimagem no Max Planck Florida Institute for Neuroscience. O curso avançado de técnicas de neuroimagem é apoiado pela sociedade Max Planck, o programa de bolsa científica da Florida State Max Planck e pelo programa de parceria da Max Planck Florida Institute Corporation. Gostaríamos de agradecer a Thorlabs, coerente e SpectraPhysics para fornecer suporte e equipamentos para o sistema de imagem 2P/3P durante o curso. Estamos também gratos a Henry Haeberle e Melissa Eberle para obter assistência com o sistema durante o curso.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Furadeira/esmerilhadeira profissional IBS/EProxxon GmbH28481Furadeira Pecision
MICROMOT suporte de broca MB 200Proxxon GmbH28600Mesa de régua móvel
MICRO mesa composta KT 70Proxxon GmbH27100Mesa de régua móvel
Torno de máquina MS 4Proxxon GmbH28132Mesa
de régua móvelTubo de aço inoxidável e Oslash; 3,0 x 0,25 mm (Interno Ø 2,5 mm) L = 500 mmSawadeR00303Tubo de aço inoxidável para a cânula anel metálico
Microscópio Vidro de cobertura (4 mm redondo)Engelbrecht Medizin e LabortechnikLamínulas de vidro para o vidro da cânula
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im BlechetuiHoffmann Group713750 160Arquivos manuais
Prä zisions-Nadelfeile Gesamtlä nge 140 mm 4Hoffmann Group527230 4Arquivos manuais
Adesivos ópticos de cura UVThorlabsNOA81Adesivo de cura
UV Sistema LED de cura UV, 365 nmThorlabsCS2010Unidade de driver LED de cura UV
Stemi 305ZeissStereoscope
Presto IINSK-Nakanishi AlemanhaZ307015Broca
odontológicaDiamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 feinMF DentalF837.014.FGLimas para a broca dentária
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grobMF DentalG837.014.FGLimas para a broca dentária
Graefe Fórceps - Reta / SerrilhadaFerramentas de Fine Science11050-10Fórpenas para a cirurgia
Fresas para Micro BrocaFine Science Tools19008-05Fresa de 0,5 mm de largura para a micro-broca
Fresas para Micro BrocaFine Science Tools19008-09Fresa de 0,9 mm de largura para a micro-broca
MicroMotor mit Handstü ckDentaTecMM11Micro-broca para craniotomia
Dumont #3 FórcepsFine Science Tools11231-30Fórceps Dumont para a cirurgia
Tesoura Fina - ToughCutFine Science Tools14058-09Tesoura para a cirurgia
TrephineMW Dental229-020Broca de trefina - 3,0 mm de diâmetro; para a micro-broca
Osso Auto-Roscante de Aço Inoxidável ParafusosFine Science Tools19010-10 Parafusos ósseos0,86 mm de largura
Aparelho estereotáxicoKopfAparelho estereotáxico
3-D-GelenkarmHoffmann Group442114Suporte de braço e placa estereotáxico
Aufnahme 2SMHoffmann Group442100 2SMSuporte de braço e placa estereotáxica
Hot Bead SterilizersFine Science Tools18000-45Esterilizador de esferas de vidro
Isofluran CP, Flasche 250 mlHenry Schein VET GmbH798932Isoflurano líquido para anestesia
Harvard Apparatus Vaporizador de enchimento de funil de isofluranoHarvard Apparatus GmbH34-1040Vaporizador de isoflurano
Lab Active ScavengerGropper MedizintechnikUV17014Sistema
de limpeza de isofluranoMetacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 mlHenry Schein VET GmbH798566Meloxicam, anti-inflamatório
Vetalgin 500 mg/mlMSD TiergesundheitVetalgin, analgésico
CMA 450 Controlador de temperaturaHugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH8003770Manta de aquecimento
Bepanthen Augen- und NasensalbeBayer AGPomada oftálmica
KL 1500 LCDSchottFonte de luz de fibra óptica
Xylocain PumpsprayAstraZeneca GmbHLidocaína, anestésico local
Triângulos de absorção - UnmountedFine Science Tools18105-03Triângulos de absorção para a cirurgia
Parkell C& B Metabond pó transparente LHofmeester dental013622Cimento adesivo rápido
Parkell C& B Metabond Quick Base BHofmeester dental013621Cimento adesivo rápido
Parkell C& B Metabond Universal Catalyst CHofmeester dental013620Cimento adesivo rápido
Escovas aplicadoras de precisão ajustáveisParkellS379Aplicadores de precisão para a cirurgia
Agulhas rombas 0,9x23 mmDentina0441324Agulhas rombas
Agulhas rombas 0,5x42 mmAgulhas Dentina0452155Agulhas rombas
Agulhas rombas 0,3x23 mmDentina0553532Agulhas rombas
Kallocryl A/CSpeiko1615Componente líquido acrílico
KallocrylSpeiko1609Pó acrílico
Rolo transparente de hidrofilmeHartmannFilme adesivo
Placas de cabeçaFeito sob medida30 mm x 10 mm tamanho; orifício de 8 mm de diâmetro, titânio
Braçadeira de placa de cabeçaPersonalizado feito suportede placa de cabeça
Suportes de poste de pedestalThorlabsPH20E / MSuporte de placa de cabeça
Poste de aço inoxidávelThorlabsTR30 / MSuporte de placa de cabeça
Poste de aço inoxidávelThorlabsTR75 / MSuporte de placa de cabeça
Poste de aço inoxidávelThorlabsTR150 / MSuporte de placa de cabeça
Braçadeiras de conector de posteplaca de cabeçafeito sob medida
Placa de ensaio de alumínio, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, M6 TorneirasThorlabsMB3045 / MEstágio de microscópio
7 "x 4" Lab JackThorlabsL490 / MEstágio de microscópio
Máscara facial de baixo perfil pequenos ratosEmka TechnologiesVetFlo-0801Suporte de máscara facial de anestesia
RS4000 Sintonizado Mesa óptica de alto desempenho amortecidoMesa flutuanteNewport
S-2000A Isoladores de vibração pneumáticos de alto desempenho com renivelamento automático Medidor dede mesa flutuanteNewport
Modelo 1918-RNewportMedidor
de potência X-Cite 120QExcelitas TechnologiesLâmpada de fluorescência
Microscópio de dois fótonsBrukerUltima IVDois fótons microscópios
Microscópio de dois fótonsThorlabsBergamoMicroscópios de dois fótons
Plan N 4x/0,10 ∞/-/FN22OlympusObjectives
Plan N 10x/0,25 ∞/-/FN22OlympusObjectives
LMPlan FLN 20x/0,40 ∞/-/FN26.5OlympusObjectives
XLPlan N 25x/1,00 SVMP ∞/ 0-0,23/FN18Objetivas OlympusLaser
sintonizável Ultafast para excitação2P EspectrofísicaMai Tai Deep SeeLasers Excitaiton
Laser sintonizável Ultafast para excitação 2PEspectrofísicaInSight DS+ LasersExcitaiton
Laser sintonizável Ultafast para excitação 3PLasers CoherentMonacoExcitaiton
de Suporte de energia de feixe duplo

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