Artigo de método

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

DOI:

10.3791/59624

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25 de maio de 2019

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1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Resumo

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Muitos estudos têm sido limitados ao uso de ensaios celulares in vitro e tecidos inteiros ou isolando tipos de células específicas de animais para análise in vitro de transcriptoma e expressão gênica por sequenciamento de qPCR e RNA. O transcriptoma detalhado e a análise da expressão de gene de tipos específicos da pilha em tecidos e em órgãos complexos serão críticos compreender os mecanismos celulares e moleculars por que os genes são regulados e sua associação com a homeostase e o órgão do tecido Funções. Neste artigo, nós Demonstramos a metodologia para a isolação do RNA ribosome-ligado diretamente in vivo no endothelia vascular de pulmões animais como um exemplo. Os materiais e os procedimentos específicos para o processamento do tecido e a purificação do RNA serão descritos, incluindo a avaliação da qualidade e do rendimento do RNA assim como qPCR do tempo real para ensaios arteriogênica do gene. Esta aproximação, conhecida como traduzindo a técnica Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha), pode ser utilizada para a caracterização da expressão de gene e da análise do transcriptoma de determinados tipos da pilha diretamente in vivo em todo o tipo específico em tecidos complexos.

Introdução

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Em tecidos complexos, como o cérebro de mamíferos, coração e pulmão, os altos níveis de heterogeneidade celular complicam a análise dos dados de expressão gênica derivados de amostras de tecidos inteiros. Para observar os perfis de expressão gênica em um determinado tipo de célula in vivo, uma nova metodologia foi desenvolvida recentemente, o que permite a interrogação de todo o complemento traduzido de mRNA de qualquer tipo de célula geneticamente definida. Essa metodologia é conhecida como a técnica de conversão de afinidade Ribossome (Trap)1,2. É uma ferramenta útil para estudar a biologia e a angiogênese de células endoteliais quando combinada com a manipulação genética de outros genes associados à angiogênese em animais.

Nós mostramos que a sinalização angiogênica de PKD-1 e a transcrição do gene angiogénico CD36 são críticas para a diferenciação da pilha endothelial (EC) e a angiogênese funcional3,4,5,6. Para determinar os mecanismos moleculares da sinalização angiogênica e metabólica na transcrição genética e na transdiferenciação CE, criamos camundongos TRAP geneticamente modificados com genes angiogênicos especificamente excluídos com base na técnica TRAP1 , 2. Além disso, em nossos animais Trap, não só eles têm deficiência de gene PKD-1 ou CD36 no endothelia vascular ou apagamento global do gene CD36 , mas uma proteína de fluorescência verde reforçada (EGFP) também é geneticamente marcada para A EC está traduzindo ribossomas. A armadilha permite a purificação da afinidade do mRNA ribosome-ligado diretamente do endothelia vascular de tecidos alvejados, permitindo a análise da expressão de gene e da identificação de transcriptoma novos que são associados com a diferenciação e angiogênese diretamente condições in vivo. Nós isolamos com sucesso o RNA ribosome-ligado do endothelia nestes animais genetically projetados. O RNA purificado pode ser utilizado para a caracterização de genes angiogênicos ou arteriogênicos na regulação da diferenciação e funções da CE. Este protocolo fornece um guia passo a passo para implementar a abordagem TRAP para o isolamento de mRNA em ECs diretamente in vivo.

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Protocolo

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Para experimentos com animais, todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina de Wisconsin.

1. Prepare os reagentes

  1. Prepare o tampão de Lise para concentrações de 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mm dtt, 100 mg/ml cicloheximida, inibidores da protease e inibidores de RNase recombinantes para concentrações como descrito abaixo.
    1. Adicione os seguintes reagentes a 500 mL de água desionizada livre de RNase: 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de dtt, 0,5 ml de cicloheximida, e NaOH conforme necessário até pH 7,4, inibidores da protease livre de EDTA (um mini comprimido por 10 ml) e inibidor de RNase (1 0 μL/mL).
    2. Armazene em um refrigerador de 4 ° c por até 1 mês.
  2. Prepare um tampão de lavagem polysome do elevado-sal às concentrações de 10 milímetros HEPES, pH 7,4, 350 milímetro KCl, 5 milímetros MgCl2, 1% Vol/Vol CA-630, 0,5 milímetro DTT, e 100 mg/ml cycloheximide.
    1. Adicionar os seguintes reagentes a 500 mL de água desionizada livre de RNase: 1,19 g de HEPES, 13, 5 g de KCl, 0,24 g de MgCl2,5 ml de detergente não iônico, não desnaturante, 5 de 7,7 mg de tdt e 0,5 ml de cicloheximida, e NaOH conforme necessário até o pH 7,4.
    2. Armazene no refrigerador de 4 ° c por até 1 mês.
  3. Associe o anticorpo anti-GFP às esferas magnéticas da proteína G antes de começar a experimentação.
    1. Adicionar 10 mg de anticorpo anti-GFP diluído em 200 mL de PBS para grânulos de proteína G.
    2. Incubar com extremidade sobre a rotação da extremidade por 10 minutos na temperatura ambiente.
    3. Coloque as contas em um rack magnético e retire o sobrenadante.
    4. Suspenda os grânulos em 200 mL de PBS e armazene no refrigerador de 4 ° c por até 1 semana.
  4. Prepare a PBS gelada com 100 mg/mL de cicloheximida.
    1. Adicione 1 volume de solução de cicloheximida (100 mg/mL) a 99 volumes de PBS gelada.

2. isolar e lise os tecidos desejados

  1. Eutanizar camundongos por injeção de IP de cetamina (500 mg/kg/peso corporal) e xilazina (10 mg/kg/peso corporal) e isolar os tecidos desejados (isto é, coração, pulmão). Prossiga imediatamente para o próximo passo.
  2. Coloque os tecidos desejados em 500 mL de PBS gelada com 100 mg/mL de cicloheximida.
  3. Mince o tecido em uma suspensão da pilha com um homogeneizador motor-conduzido ou um homogeneizador de vidro da pequeno-folga. Se usando um homogeneizador motor-conduzido, limite a homogeneização a menos de 1 minuto na baixa freqüência (< 15000 hertz) para evitar a desnaturação do RNA.
  4. Suspender o pellet de células em 200 mL de tampão de Lise por pipetagem e redesenho de buffer várias vezes. Homogeneizar ainda mais a suspensão celular com 10 cursos em um homogeneizador de vidro de pequena folga ou por 15 segundos em baixa frequência (< 15000 Hz) em um homogeneizador acionado por motor.
  5. O centrifugador homogeneates por 10 minutos em 2.000 x g em 4 ° c aos núcleos da pelota e aos grandes restos da pilha, e mantem o sobrenadante.
  6. Adicione o detergente nonionic, não-desnaturando a 1% Vol/Vol e DHPC a 30 milímetros ao sobrenadante. Incubar no gelo por 5 min.
  7. Centrifugue o lisado por 10 minutos em 16.000 x g ao material insolúvel da pelota. Transfira e mantenha 15% do lisado desobstruído como a entrada para etapas futuras.

3. isolar complexos ribosalguns/mRNA

  1. Adicionar 50 mL de grânulos ligados a anticorpos ao sobrenadante de lisado de células e incubar a mistura a 4 ° c com rotação final por 30 min. Isto é o lugar onde os anticorpos do anti-GFP amarrarão os ribosomes GFP-etiquetados, permitindo que nós isolem mais o RNA destes ribossomas.
  2. Colete grânulos em uma cremalheira magnética e lave 5 vezes com tampão de lavagem polysome do elevado-sal.
    1. Elabore e descarte o líquido uma vez que os grânulos coletaram na parte lateral do tubo. Em seguida, pipete e redesenhe 200 mL de tampão de lavagem de polysome de alto sal várias vezes. Repita esta etapa 5 vezes e descarte todos os buffer após a repetição final. Prossiga imediatamente para o próximo passo.

4. isolar mRNA

  1. Coloque as contas no buffer RLT. As etapas a seguir são tomadas diretamente do protocolo RNeasy mini kit e não foram expandidas em qualquer forma.
    PRECAUÇÃO: o tampão RLT contém sais de guanidina; Não misture com lixívia.
  2. Centrifugue o lisado por 3 minutos na velocidade máxima 13.000 rpm ou 16.000 g em 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante de 350 ml introduzindo pipetagem e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga. Use somente este sobrenadante (lisado) em etapas subsequentes.
  3. Adicione um volume igual de 70% de etanol no tubo de microcentrífuga.
  4. Transfira até 700 mL da amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter formado, a uma coluna de rotação colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo.
  5. Adicione 350 mL de buffer RW1 à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo e reutilize o tubo de coleta na próxima etapa.
    PRECAUÇÃO: o tampão RW1 contém sais de guanidina; Não misture com lixívia.
  6. Adicione 350 mL de buffer RW1 à coluna de rotação. Fechar a tampa suavemente e centrifugar por 15 s a ≥ 8.000 x g. Descarte o fluxo.
  7. Adicione 500 mL do buffer RPE à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Descarte o fluxo.
  8. Adicione 500 mL do buffer RPE à coluna de rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue durante 2 min a ≥ 8.000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação. Em seguida , remova cuidadosamente a coluna de rotação do tubo de coleta, assegurando que a coluna não entre em contato com o fluxo.
  9. Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de coleta de 2 mL e descarte o tubo antigo com o fluxo. Feche a tampa suavemente e centrifugue a velocidade máxima durante 1 min para remover o tampão residual.
  10. Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30-50 mL de água RNase-livre diretamente à membrana da coluna da rotação. Feche a tampa suavemente e centrifugue durante 1 min a ≥ 8.000 x g para Eluir o RNA.
  11. Se o rendimento de RNA esperado for de > 30 mg, repita o passo 4,10 com outro 30-50 ml de água sem RNase, ou usando eluir da etapa 4,10 (se for necessário alto [RNA]). Reutilizar tubo de coleta da etapa 4,10.
  12. Use RNA purificado para análise a jusante, incluindo sequenciamento de RNA ou PCR quantitativo em tempo real ou RNA de loja dissolvido em H2O at-80 ° c RNase livre por até 1 ano.

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Resultados

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Nossos estudos precedentes4,7 sugerem que CD36 possa funcionar como um interruptor para a diferenciação arteriolar e a arterialização capilar através da via de sinalização de LPA/PKD-1. Para estudar se o eixo de sinalização LPA/PKD-1-CD36 é essencial para a arteriogênese in vivo, estabelecemos as novas linhas TRAP que não só têm deficiência global de CD36 ou deficiência endotelial-específica-CD36-ou PKD-1, mas também permitem o isolamento seletivo do RNA ribosome...

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Discussão

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A angiogênese é um processo complexo de múltiplas etapas, no qual a transcrição e expressão do gene angiogênico específico da CE desempenham um papel essencial na diferenciação da CE e na reprogramação angiogênica3,4. Para superar as barreiras da diversidade celular e da complexidade arquitetônica para melhor compreender a função do sistema vascular de mamíferos em nível molecular in vivo, criamos camundongos TRAP específicos da CE, acompanhados por CD36

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

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O trabalho do Dr. Ren é apoiado pela associação americana do coração (13SDG14800019; BR), a Fundação Ann ' s Hope (FP00011709; BR), a sociedade americana do câncer (86-004-26; o MCW Cancer Center para BR), e o Instituto Nacional de saúde (HL136423; BR); Jordan Palmer é apoiado pelo 2018 MCW CTSI 500 Stars programa de estágio; P. Moran é apoiado por uma subvenção de formação de investigação institucional da NHLBI (5T35 HL072483-34).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bioanalisador de eletroforese 2100 com nanochips e picochipsAgilentG2939AA, 5067-1511 e 5067-1513
raspadores de célulasSarstedt83.1832
HomogeneizadoresFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21DDependerá da escala de purificação; amostras em tubos de 1,5 mL podem ser concentradas em a
MinicentrífugaDynaMag-2 Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C espectrofotômetroThermo Scientific ND-2000C
Centrífuga refrigeradaEppendorf5430Rcom rotor para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem RNaseApplied Biosystems 
Tubos cônicos de 50 mL sem RnaseApplied Biosystems 
1000-&mu livre de RNase; l pontas de filtroRaininRT-1000F
sem RNase 200-μ l pontas de filtroRainin RT-200F
livre de RNase 20-μ l pontas de filtroRainin Rotor RT-20F
para homogeneizadoresYamato Rotador do tubo de LT-400D
Thermo Fisher13-687-12QLabquake
AM12450AM12501, tipo de

Referências

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  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
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  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
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