Artigo de método

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

DOI:

10.3791/59630

⸱

13 de maio de 2019

 , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Esta aproximação molecular-baseada para determinar a aptidão bacteriana facilita a deteção exata e exata dos micro-organismos usando os códigos de barras genomic originais do ADN que são quantificados através do PCR digital. O protocolo descreve o cálculo do índice competitivo para cepas de Salmonella ; Entretanto, a tecnologia é prontamente adaptável aos protocolos que exigem a quantificação absoluta de todo o organismo genetically-maleável.

Resumo

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Um índice competitivo é um método comum usado para avaliar a aptidão bacteriana e/ou virulência. A utilidade desta aproximação é exemplificada por sua facilidade executar e sua habilidade de padronizar a aptidão de muitas tensões a um selvagem-tipo organismo. A técnica é limitada, no entanto, por marcadores fenotípicos disponíveis e o número de cepas que podem ser avaliados simultaneamente, criando a necessidade de um grande número de experimentos replicantes. Em simultâneo com um grande número de experimentos, os custos laborais e materiais para quantificar as bactérias com base em marcadores fenotípicos não são insignificantes. Para superar esses aspectos negativos, mantendo os aspectos positivos, desenvolvemos uma abordagem molecular para quantificar diretamente os microrganismos após marcadores genéticos de engenharia em cromossomas bacterianos. Únicos, 25 códigos de barras do ADN do par baixo foram introduzidos em um locus inócuo no cromossoma de estirpes do selvagem-tipo e do mutante das salmonelas. Experimentos de competição in vitro foram realizados usando inóculos consistindo de cepas agrupadas. Após a competição, os números absolutos de cada cepa foram quantificados por meio de PCR digital e os índices competitivos para cada cepa foram calculados a partir desses valores. Nossos dados indicam que essa abordagem para quantificar a Salmonella é extremamente sensível, precisa e precisa para detectar microrganismos altamente abundantes (de alta aptidão) e raros (baixa aptidão). Adicionalmente, esta técnica é facilmente adaptável a quase todo o organismo com os cromossomas capazes da modificação, assim como aos vários projetos experimentais que exigem a quantificação absoluta dos micro-organismos.

Introdução

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Avaliar a aptidão e a virulência de organismos patogénicos é um aspecto fundamental da pesquisa em microbiologia. Permite comparações entre cepas ou entre organismos mutantes, o que permite que os pesquisadores determinem a importância de determinados genes em condições específicas. Tradicionalmente, a avaliação de virulência utiliza um modelo animal de infecção usando diferentes cepas bacterianas e observando o resultado do animal infectado (por exemplo, dose infecciosa50, dose letal50, tempo até a morte, gravidade dos sintomas, falta de sintomas, etc.). Este procedimento fornece descrições valiosas da virulência, mas exige que as tensõ....

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Protocolo

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1. incorpore códigos de barras originais do ADN em um Plasmid que contem os componentes necessários para a troca allelic

Nota: Um plasmídeo novo, nomeado pskap, com um número elevado da cópia e uma eficiência aumentada da transformação comparado ao plasmídeo alélicas pKD13 existente da troca foi criado. Isso é descrito nas etapas 1.1-1.12 (Figura 1). Os plasmídeo finalizados contendo códigos de barras de DNA e componentes exclusivos para a troca alélica estão disponíveis através de um repositório de plasmílicos (tabela de materiais).

  1. Usando um kit de protocolo de plas....

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Resultados

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O uso dessa metodologia requer que sejam realizadas reações de controle apropriadas para validar a sensibilidade e a especificidade de cada sonda utilizada para identificar o DNA alvo. Neste experimento representativo, validamos oito códigos de barras de DNA únicos com as oito sondas correspondentes para identificação. Todas as oito sondas apresentaram baixa taxa de falsos positivos em ambas as NTC e reações de controle negativo (tabela 3), destacando sua especificidade m.......

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Discussão

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A capacidade de quantificar com precisão os microrganismos é de suma importância para a pesquisa de microbiologia, e a capacidade de enumerar cepas únicas de uma população mista inicial provou ser uma ferramenta inestimável para avaliar os traços de aptidão e virulência em Bactérias. No entanto, as técnicas para realizar isso não progrediram em ritmo com os desenvolvimentos modernos em biologia molecular. A tecnologia para modificar facilmente os cromossomas de muitas bactérias, incluindo S. Typhimurium, estêve .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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As pesquisas relatadas nesta publicação foram apoiadas pelo fundo de pesquisa do corpo docente do Presidente George F. Haddix e pelo Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde (NIH) o prêmio número GM103427. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
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Tubos de cultura de 16 mLMidSci8599Adquira de qualquer fabricante
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5-50 μ Pipeta multicanal LRAININ17013804Use pipetas multicanais alternativas com cautela
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Adquira de qualquer fabricante
Análise de explosãoNCBI N/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler com módulo de reação de poços de 96 profundidadesBio Rad1851197Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
DH5&alfa quimicamente competente;Invitrogen18258012Adquira de qualquer fabricante ou prepare-se
CloranfenicolThermoFisher ScientificBP904-100Adquira de qualquer fabricante
Cytation5 Leitor de microplacasBioTekCYT5MFAdquira de qualquer fabricante, use qualquer sistema capaz de quantificar com precisão o software de análise de dados de DNA
(QuantaSoft e QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadN/ADeve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
Placas de 96 poços ddPCRBio Rad12001925Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
Óleo de leitor de gotículas ddPCRBio Rad1863004Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
ddPCR Supermix para sondas (sem dUTP)Bio Rad1863024Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
Cartuchos DG8 para gerador de gotículas QX200/QX100Bio Rad1864008Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
Juntas DG8 para gerador de gotículas QX200/QX100Bio Rad1863009Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
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Placas de PetriThermoFisher ScientificFB0875712Adquira de qualquer fabricante
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Design de primer/sondaIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP e pSKAP_BarcodesAddgenePlasmid números 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000Deve adquirir suprimentos de ddPCR da Bio Rad. Alternativas ainda não estão disponíveis.
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Salmonella typhimurium cepa ATCC 14028sATCC ATCC14028swww.atcc.org
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Água, Grau de Biologia MolecularThermoFisher ScientificBP28191Adquira de qualquer fabricante

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F.

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