Artigo de método

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

DOI:

10.3791/59635

⸱

9 de agosto de 2019

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

Neste artigo

Resumo

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A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.

Resumo

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O Regulamento genético desempenha um papel importante em todas as células. Os passos transcricional, pós-transcricional (ou processamento de RNA), translacionais e pós-translacionais são usados para regular genes específicos. As proteínas de ligação de ácidos nucleicos específicos de sequência destinam-se a sequências específicas para controlar a expressão genética espacial ou temporal. Os sítios de ligação em ácidos nucleicos são tipicamente caracterizados pela análise mutacional. Entretanto, as proteínas numerosas do interesse não têm nenhum local obrigatório conhecido para tal caracterização. Aqui nós descrevemos uma aproximação para identificar locais previamente desconhecidos da ligação para proteínas RNA-obrigatórias. Envolve a seleção iterativa e a amplificação das seqüências que começam com uma associação aleatorizada da seqüência. Após várias rodadas destes passos-transcrição, ligação e amplificação-as sequências enriquecidas são sequenciadas para identificar um local de ligação preferencial (s). O sucesso dessa abordagem é monitorado por meio de ensaios de ligação in vitro. Posteriormente, ensaios funcionais in vitro e in vivo podem ser utilizados para avaliar a relevância biológica das sequências selecionadas. Esta aproximação permite a identificação e a caracterização de um local (s) obrigatório previamente desconhecido para toda a proteína RNA-obrigatória para que um ensaio para separar RNAs proteína-ligadas e não acoplado existe.

Introdução

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Na biologia celular, a regulação gênica desempenha um papel central. Em uma ou várias etapas ao longo da via de expressão gênica, os genes têm o potencial para ser regulado. Estas etapas incluem a transcrição (iniciação, alongamento, e terminação) assim como a emenda, a poliadenilação ou a formação final de 3 ', a exportação do RNA, a tradução do mRNA, e a deterioração/localização de transcritos preliminares. Nestas etapas, as proteínas de ligação ácida nucleico modulam a regulação genética. A identificação de sítios de ligação para essas proteínas é um aspecto importante do estudo do controle genético. A análise mutacional e a comparação da sequência filogenética têm....

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Protocolo

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Nota: a Figura 1 fornece um resumo das etapas principais no processo iterativo de seleção-amplificação (Selex).

1. geração de um modelo de biblioteca aleatório

  1. Sintetizar o primer Forward 5 '- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ' e o primer reverso 5 '-GcgacGgatccaagcttCA-3 ' por síntese química em um sintetizador de DNA.
    Nota: os primers e a biblioteca aleatória podem ser sintetizados comercialmente.
  2. Sintetizar um modelo de oligonucleotide de biblioteca aleatória 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' por sín....

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Resultados

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As seguintes observações demonstram a seleção-amplificação bem sucedida (SELEX). Em primeiro lugar, analisamos o pool 0 e as sequências selecionadas para ligação à proteína utilizada para a abordagem iterativa de amplificação de seleção. A Figura 2 mostra que a proteína de ligação de polipirimidina-trato de mamíferos (PTB) mostra ligação mal detectável à seqüência de 0 de pool, mas alta afinidade para o pool de sequências selecionado. Não havia ligação quase .......

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Discussão

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As proteínas de ligação de ácidos nucleicos são importantes reguladores do desenvolvimento animal e vegetal. Um requisito fundamental para o procedimento SELEX é o desenvolvimento de um ensaio que pode ser usado para separar frações de RNA ligadas à proteína e não acopladas. Em princípio, este ensaio pode ser um ensaio de ligação in vitro, como o ensaio de ligação de filtro, o ensaio de deslocamento de mobilidade em gel ou um ensaio de ligação matricial19 para proteínas recombinantes, proteínas pu.......

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Divulgações

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O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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O autor agradece aos institutos nacionais de saúde pelo financiamento passado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento de eletroforese em gelPlacasde vidro padrão
MilliporeHAWP
NitroceluloseSchleicher & Soluções de
Padrão
Proteinase KNEBP8107S
PTB recombinantePreparação laboratorialNão aplicável
Transcriptase reversaNEBM0277S
Coletor de vácuoFisher ScientificXX1002500Millipore 25mm Filtro de vácuo de microanálise de vidro
Coletor de vácuoMilliporeXX27025521225 Amostragem Coletor de vácuo
Filmes de raios-XPadrãopadrão
Padrão Nitrocelulose padrão gel de poliacrilamida Schuell PROTRAN

Referências

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  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P.

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