Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.
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Artigo de método
Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica
Neste artigo
Resumo
Resumo
A crescente preocupação global com o bem-estar animal está incentivando os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle (OMCLs) a seguir a estratégia do 3Rs para a substituição, redução e refinamento dos testes em animais de laboratório. O desenvolvimento de abordagens in vitro é recomendado nos níveis da OMS e da Europa como alternativas ao teste do NIH para avaliar a potência da vacina antirrábica. Na superfície da partícula do vírus da raiva (RABV), os aparadores de glicoproteína constituem o maior imunogênio para induzir anticorpos neutralizantes virais (VNAbs). Um teste ELISA, onde os anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb-D1) reconhecem a forma trimérica da glicoproteína, foi desenvolvido para determinar o conteúdo da glicoproteína trimérica dobrada nativa, juntamente com a produção dos lotes da vacina. Este teste de potência in vitro demonstrou uma boa concordância com o teste do NIH e foi encontrado adequado em ensaios colaborativos por fabricantes de vacinas RABV e OMCLs. Evitar o uso de animais é um objetivo alcançável em um futuro próximo.
O método apresentado baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA utilizando o mAb-D1 que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimérico, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. mAb-D1 é usado tanto para revestimento quanto para detecção de aparadores de glicoproteína presentes no lote da vacina. Uma vez que o epítopo é reconhecido por causa de suas propriedades conformacionais, a glicoproteína potencialmente desnaturada (menos imunogênica) não pode ser capturada e detectada pelo mAb-D1. A vacina a ser testada é incubada em uma placa sensibilizada com o mAb-D1. As glicoproteínas rabv triméricas atadas são identificadas adicionando novamente o mAb-D1, rotulado com peroxidase e depois revelado na presença de substrato e cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica.
Introdução
Há mais de 50 anos, o teste NIH1 é usado como método padrão-ouro para avaliar a potência da vacina antirrábica antes da liberação do lote. Este teste consiste em uma imunização intraperitoneal de grupos de camundongos com a vacina a ser testada seguida de um desafio intra-cerebral (IC) 14 dias depois com a cepa Challenge Virus Standard (CVS) do vírus da raiva (RABV). A potência é avaliada a partir da proporção de camundongos que sobreviveram ao desafio do IC. Embora a OMS2 ea Farmacopéia 3 ainda exijam o teste do NIH para avaliar a potência da vacina, este teste sofre vários obstáculos: os resulta....
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Protocolo
1. Precauções de segurança
NOTA: Este método é aplicável tanto ao RABV vivo quanto à vacina inativada.
- Use bons procedimentos de prática e segurança laboratorial.
- Use equipamentos de proteção individual adequados (EPI) incluindo casaco descartável, luvas, máscara, óculos, etc.
- Quando o vírus vivo for titulado, use um gabinete de segurança biológica classe II.
- Considere qualquer material em contato com as amostras (reagentes, soluções de lavagem, etc.) como material infeccioso.
- Tratar o material contaminado imerso na solução alvejante (2,5% de hipoclorito de sódio) por 30 min para descontamina....
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Resultados
No exemplo a seguir, é utilizada a vacina de referência Lote 09, composta por partículas purificadas do vírus da raiva inativada (cepa de vacina FOTO), é utilizada. O teor de aparadores de glicoproteína (10 μg/mL) foi estabelecido após a determinação da quantidade total de proteínas virais (teste BCA) e avaliação da porcentagem da glicoproteína por eletroforese em gel de poliacrilamida. Alternativamente, pode-se utilizar uma vacina de referência calibrada, por exemplo, a6ª Norm.......
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Discussão
O epítopo reconhecido pelo mAb-D1 está localizado no sítio antigênico III da glicoproteína RABV que não só é imuno-dominante para a indução de VNAbs, mas também envolvido em neurovibramento, patogenicidade40,,41 e reconhecimento de receptorescaneamento 42. Há outro importante local antigênico ao longo da glicoproteína, o local II43, contra o qual vários MAbs foram isolados, como o mAb-WI-111235
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Dr. Sylvie Morgeaux e Dr. Jean-Michel Chapsal devem ser reconhecidos por sua participação fundamental para estabelecer o ensaio ELISA em lotes de vacinas e organizar workshops internacionais e estudos colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali pela leitura crítica do manuscrito. O Dr. Pierre Perrin foi responsável pelo isolamento e caracterização do mAb-D1. Este trabalho tem sido apoiado principalmente pelo financiamento do Institut Pasteur.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Gabinete de Segurança Biológica Classe II | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titulando vírus vivo |
| Placas Imunológicas Não Estéreis de Fundo Plano Transparente de 96 Poços, 400 µ L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | bom para ligação ao anticorpo carregado |
| Equipar Labo Polipropileno Laboratório Hotte | ThermoFisher Scientific | 12576606 | para a preparação de ácido sulfúrico |
| Placa de Imunologia Strong Adsorção MAXISORP Fundo Plano Poço F96 | Dutscher | 55303 | bom para ligação ao anticorpo carregado |
| Vedação de Microplacas Fita(100 folhas) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate leitor de modo único Sunrise | TECAN | ||
| Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
| Lavadora de microplacas Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Pipeta multicanal (30-300 µ L) Pipetas de canal | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Kit 2: Finnpipettes F2 0.2-2 μ L micro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L) | 4700880 | Científica ThermoFisher |
Referências
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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Reimpressões e permissões
