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Artigo de método

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

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DOI:

10.3791/59641

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11 de maio de 2020

 , 
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.

Resumo

A crescente preocupação global com o bem-estar animal está incentivando os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle (OMCLs) a seguir a estratégia do 3Rs para a substituição, redução e refinamento dos testes em animais de laboratório. O desenvolvimento de abordagens in vitro é recomendado nos níveis da OMS e da Europa como alternativas ao teste do NIH para avaliar a potência da vacina antirrábica. Na superfície da partícula do vírus da raiva (RABV), os aparadores de glicoproteína constituem o maior imunogênio para induzir anticorpos neutralizantes virais (VNAbs). Um teste ELISA, onde os anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb-D1) reconhecem a forma trimérica da glicoproteína, foi desenvolvido para determinar o conteúdo da glicoproteína trimérica dobrada nativa, juntamente com a produção dos lotes da vacina. Este teste de potência in vitro demonstrou uma boa concordância com o teste do NIH e foi encontrado adequado em ensaios colaborativos por fabricantes de vacinas RABV e OMCLs. Evitar o uso de animais é um objetivo alcançável em um futuro próximo.

O método apresentado baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA utilizando o mAb-D1 que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimérico, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. mAb-D1 é usado tanto para revestimento quanto para detecção de aparadores de glicoproteína presentes no lote da vacina. Uma vez que o epítopo é reconhecido por causa de suas propriedades conformacionais, a glicoproteína potencialmente desnaturada (menos imunogênica) não pode ser capturada e detectada pelo mAb-D1. A vacina a ser testada é incubada em uma placa sensibilizada com o mAb-D1. As glicoproteínas rabv triméricas atadas são identificadas adicionando novamente o mAb-D1, rotulado com peroxidase e depois revelado na presença de substrato e cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica.

Introdução

Há mais de 50 anos, o teste NIH1 é usado como método padrão-ouro para avaliar a potência da vacina antirrábica antes da liberação do lote. Este teste consiste em uma imunização intraperitoneal de grupos de camundongos com a vacina a ser testada seguida de um desafio intra-cerebral (IC) 14 dias depois com a cepa Challenge Virus Standard (CVS) do vírus da raiva (RABV). A potência é avaliada a partir da proporção de camundongos que sobreviveram ao desafio do IC. Embora a OMS2 ea Farmacopéia 3 ainda exijam o teste do NIH para avaliar a potência da vacina, este teste sofre vários obstáculos: os resultados são altamente variáveis4; O RABV infeccioso é utilizado durante o desafio e isso requer habilidade técnica e medidas rigorosas de biossegurança; um grande número de animais é utilizado, e a gravidade do desafio levanta sérias preocupações éticas5. Uma variação menos severa deste teste foi desenvolvida: duas semanas após a imunização intra-peritoneal, os camundongos não são desafiados pelo IC, mas sangraram e foram testados para a presença de anticorpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) em seu soro usando um teste de neutralização in vitro. No entanto, este teste ainda requer sacrificar um grande número de ratos de laboratório, embora já esteja em uso para as vacinas veterinárias6,7 e tenha sido considerado para vacinas humanas8.

A partir de agora, tanto as recomendações internacionais9 quanto aseuropeias 10 incentivam os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle de Medicamentos (Laboratórios Oficiais de Controle de Medicamentos - OMCLs) a implementar a Substituição, Redução e Refinamento de testes em animais de laboratório, referida como a estratégia 3Rs. A Diretiva Europeia 2010/63/UE (em vigor desde 2013/01/01) relacionada à proteção e bem-estar dos animais também reforçou as restrições para os fabricantes de vacinas e laboratórios envolvidos no Controle de Qualidade das vacinas antirrábicas, bem como na pesquisa antirrábica11. Como resultado, o desenvolvimento, a validação e o uso de abordagens alternativas in vitro tornaram-se agora uma prioridade. Estes não são apenas eticamente sólidos, mas também podem reduzir os custos de teste em lote e reduzir o tempo para os resultados para horas em vez de semanas3.

Na superfície da partícula RABV, a glicoproteína adota uma forma trimérica12,,13,14,,15,16. Na vacina antirrábica, esta forma trimérica nativa constitui o maior imunogênio indutor de VNAbs17, enquanto as glicoproteínas monoméricas, solúveis ou desnaturadas são mal imunogênicas18,19. Assim, a preservação dos aparadores da glicoproteína ao longo do processo de produção da vacina é um bom indicador para a preservação de um potencial imunogênico ideal. Vários métodos imunoquímicos, tais como o anticorpo-binding-test20,21, o teste de imunodifusão radial única (SRD)22 e o teste ELISA23,24,25,26,27 sãorecomendados pelo Relatório Técnico da OMS Série2 e a monografia europeia3 para quantificar o teor de antígeno nas vacinas antigen raes. Estes são utilizados pelos fabricantes para monitorar a consistência da produção de vacinas e pela OMCL para avaliar a formulação consistente de lotes de vacinas humanas28, mesmo que o teste do NIH ainda seja considerado para a potência.

No entanto, todos esses métodos imunoquímicos não são equivalentes. O teste SRD requer um pré-tratamento que pode alterar os aparadores ancorados na membrana e resultar em uma forma solúvel ou desnaturada da glicoproteína22,29. Portanto, o SRD não é muito eficiente em discriminar as glicoproteínas imunogênicas e não imunogênicas, resultando em uma avaliação imperfeita da imunogenicidade de um lote vacinal. Em contraste, o teste ELISA é mais sensível22, preserva a estrutura nativa da glicoproteína, e é mais apropriado para determinar o conteúdo dos aparadores nativamente dobrados de glicoproteína. O teste ELISA pode usar anticorpos antiglicoicos monoclonais de coelho ou de camundongos purificados ou concentrados com sulfato de amônio. Estudos demonstraram boa concordância entre o teste do NIH e o teor de antígeno avaliado pela ELISA nas vacinas e concluíram que os métodos ELISA são adequados para o teste de potência in vitro. Isso defende que os testes ELISA podem pelo menos complementar ou mesmo substituir o teste NIH4,,26,27,30,,31,32,33. Hoje, a Farmacopoeia europeia recomenda o uso de ensaios sorológicos ou imunoquímicos validados como alternativas ao teste DO NIH3. A completa evitação do uso animal para a potência da vacina tornou-se uma perspectiva realista.

O método apresentado abaixo baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA usando um clone de anticorpo monoclonal de rato (mAb-D1) que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimeric15,34. Este método foi desenvolvido inicialmente no laboratório Institut Pasteur26,30 depois otimizado e validado pela Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), ou seja, o Francês OMCL4,33. O mAb-D1 é usado tanto para sensibilizar a placa quanto posteriormente para detectar o antígeno capturado. Isso permite a quantificação específica dos aparadores de glicoproteína, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. O mAb-D1 utilizado para a detecção é rotulado com peroxidase, o que é revelado na presença do substrato e do cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica. Note-se que o mesmo tipo de ensaio pode ser aplicado para diferentes mAbs reconhecendo diferentes locais antigênicos da glicoproteína RABV35. O método para obter e purificar ou concentrar-se com sulfato de amônio antiglicoproteína poliglobulinas de coelho g (IgG) ou globulinas de camundongos monoclonais foram extensivamente descritos anteriormente36 juntamente com o método para conjugar anticorpos com peroxidase37.

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Protocolo

1. Precauções de segurança

NOTA: Este método é aplicável tanto ao RABV vivo quanto à vacina inativada.

  1. Use bons procedimentos de prática e segurança laboratorial.
  2. Use equipamentos de proteção individual adequados (EPI) incluindo casaco descartável, luvas, máscara, óculos, etc.
  3. Quando o vírus vivo for titulado, use um gabinete de segurança biológica classe II.
    1. Considere qualquer material em contato com as amostras (reagentes, soluções de lavagem, etc.) como material infeccioso.
    2. Tratar o material contaminado imerso na solução alvejante (2,5% de hipoclorito de sódio) por 30 min para descontaminação.
  4. Manuseie produtos químicos de acordo com a Boa Prática laboratorial.

2. Preparação

  1. Use reagentes de grau analítico sempre que possível.
  2. Prepare novas soluções do tampão tampão de revestimento/carbonato, tampão de passivação, diluente e tampão de citrato(Tabela 1),filtre através de filtros de 0,45 ou 0,22 μm e armazene a 4 °C por um dia antes do uso para preservar sua pureza analítica.
  3. Permitir que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 °C a +25 °C) 30 min antes do uso e homogeneizem por mistura suave antes do uso.

3. Sensibilização de microplacas

NOTA: Use 96 placas de imunoensaio de adsorção que são otimizadas para ligar altas quantidades de imunoglobulinas (por exemplo, ver Tabela de Materiais).

  1. Para cada poço, adicione 200 μL do anticorpo monoclonal (mAb-D1) diluído no tampão de carbonato.
    NOTA: Uma concentração ideal de cerca de 1 μg/mL foi experimentalmente determinada e corresponde a uma diluição aproximada de 1/2000 do mAb-D1 purificado. Esta concentração recomendada é indicada para cada lote mAb-D1 e deve ser verificada periodicamente com o controle positivo.
  2. Cubra a placa com uma filme adesivo e incubar a microplaca por 3 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada.
  3. Aspirar cuidadosamente e transferir o conteúdo do poço para um destinatário contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
  4. Inverta a microplaca e deixe secar em um papel adsorvente à temperatura ambiente por 5 min.

4. Passivação de microplacas

  1. Para cada poço, adicione 300 μL do buffer de passivação.
  2. Cubra a placa com um filme adesivo e incubar por 30 min a 37 °C.
  3. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um destinatário contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
  4. Inverta a microplaca e deixe secar em um papel adsorvente à temperatura ambiente por 1 min.
    NOTA: A microplaca pode ser imediatamente utilizada ou armazenada selada a -20 °C por até 3 meses até o uso.

5. Ensaio elisa

NOTA: Para estabelecer a curva de controle da vacina de referência, a Etapa 5.3 não é necessária; para titrate a vacina testada todas as etapas 5.1 a 5.6 são necessárias.

  1. Lavagem da microplaca sensibilizada
    1. Para cada poço, adicione 300 μL do tampão de lavagem.
    2. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um destinatário contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
    3. Repita as etapas 5.1.1 e 5.1.2 mais cinco vezes para lavar extensivamente a placa sensibilizada.
    4. Inverta a microplaca e deixe secar em um papel adsorvente à temperatura ambiente por 1 min.
  2. Diluições da vacina de referência para a curva de controle
    1. Reconstituir a vacina de referência (lote de antígeno de validação 09) em 1 mL de água destilada correspondente a uma concentração de 10 μg/mL de glicoproteína do vírus da raiva.
    2. Prepare uma diluição dez vezes maior da vacina de referência reconstituída no diluente para atingir 1 μg/mL de glicoproteína do vírus da raiva.
    3. Preparar 6 diluições em duas dobras seriais desta vacina de referência no diluído conforme indicado na Tabela 1.
    4. Distribua 200 μL do diluente em duplicata (poços 1H/2H) para servir como um controle em branco.
    5. Distribua 200 μL por poço de cada diluição da vacina de referência em duplicata (poços G1/G2 a A1/A2).
  3. Diluições da vacina testada para sua titulação
    1. Prepare uma diluição dez vezes maior da vacina testada no diluente.
    2. Preparar 7 diluições seriais duplas da vacina testada em diluente conforme indicado na Tabela 2.
    3. Distribua 200 μL por poço de cada diluição vacinatestada em duplicata (poços H3/H4 a A3/A4).
  4. Incubação/Lavagem da placa ELISA
    1. Cubra a microplaca com um filme adesivo e incubar por 1 h a 37 °C.
    2. Remova a película, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
    3. Para cada poço adicione 300 μL de tampão de lavagem.
    4. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um destinatário contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
    5. Repita as etapas 5.4.3 e 5.4.4 cinco vezes para remover o antígeno não ligado e conservar os aparadores de proteína G ligados ao anticorpo revestido (mAb D1).
    6. Inverta a microplaca e deixe secar em um papel adsorvente à temperatura ambiente por 1 min.
  5. Ligação da peroxidase conjugada mAb-D1
    1. Distribua 200 μL por poço da diluição recomendada (1/2000) de mAb-D1 com rótulo de peroxidase em diluente (concentração aproximada de 1μg/mL). Uma concentração recomendada é indicada para cada lote mAb-D1 e deve ser periodicamente verificada com o controle positivo.
    2. Cubra a microplaca com um filme adesivo e incubar por 1 h a 37 °C.
    3. Remova a película, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
    4. Adicione a cada poço, 300 μL do tampão de lavagem.
    5. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um destinatário contendo 2,5% de solução de hipoclorito de sódio.
    6. Repita as etapas 5.5.4 e 5.5.5 cinco vezes para remover o anticorpo com etiqueta peroxidase não atrelado (mAb D1).
    7. Inverta a microplaca e deixe secar em um papel adsorvente à temperatura ambiente por 1 min.
  6. Revelação usando um substrato-cromógeno
    1. Distribua 200 μL por poço de solução substrato-cromógeno.
    2. Sele a microplaca com um filme e incuba no escuro à temperatura ambiente por 30 min. Uma cor amarelo-laranja desenvolve a intensidade da qual é proporcional à quantidade de anticorpo ligado à peroxidase (mAb D1).
    3. Pare a reação adicionando 50 μL de solução de parada por poço.
    4. Limpe cuidadosamente a parte inferior da microplaca e coloque-a em um espectrofotômetro para determinar a densidade óptica (OD) a 492 nm de todos os poços usados: controle negativo (em branco), vacina de referência e vacina testada.
    5. Coletar dados OD como .xls ou formato de arquivo .xlsx para análise.
  7. Desenhe a curva da vacina de referência, o teor de glicoproteína trimérica, em função da densidade óptica (492 nm)
    1. Calcular a média de OD em 492 nm para cada duplicata nas diferentes diluições da vacina de referência (poços G1/G2 a A1/A2 na Tabela 2)
    2. Subtraia a média de OD do Branco (poços, H1/H2 na Tabela 2) de cada média calculada oD.
    3. Plote os valores resultantes de OD no eixo vertical (escala linear) e a concentração correspondente em aparadores de glicoproteína (ng/mL) no eixo horizontal (escala logarítmica).
    4. Desenhe a curva de referência unindo pontos(Figura 1).

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Resultados

No exemplo a seguir, é utilizada a vacina de referência Lote 09, composta por partículas purificadas do vírus da raiva inativada (cepa de vacina FOTO), é utilizada. O teor de aparadores de glicoproteína (10 μg/mL) foi estabelecido após a determinação da quantidade total de proteínas virais (teste BCA) e avaliação da porcentagem da glicoproteína por eletroforese em gel de poliacrilamida. Alternativamente, pode-se utilizar uma vacina de referência calibrada, por exemplo, a6ª Norm...

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Discussão

O epítopo reconhecido pelo mAb-D1 está localizado no sítio antigênico III da glicoproteína RABV que não só é imuno-dominante para a indução de VNAbs, mas também envolvido em neurovibramento, patogenicidade40,,41 e reconhecimento de receptorescaneamento 42. Há outro importante local antigênico ao longo da glicoproteína, o local II43, contra o qual vários MAbs foram isolados, como o mAb-WI-111235

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Dr. Sylvie Morgeaux e Dr. Jean-Michel Chapsal devem ser reconhecidos por sua participação fundamental para estabelecer o ensaio ELISA em lotes de vacinas e organizar workshops internacionais e estudos colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali pela leitura crítica do manuscrito. O Dr. Pierre Perrin foi responsável pelo isolamento e caracterização do mAb-D1. Este trabalho tem sido apoiado principalmente pelo financiamento do Institut Pasteur.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gabinete de Segurança Biológica Classe IIThermoFisher Scientific10445753if titulando vírus vivo
Placas Imunológicas Não Estéreis de Fundo Plano Transparente de 96 Poços, 400 µ L, MAXISORPThermoFisher Scientific439454bom para ligação ao anticorpo carregado
Equipar Labo Polipropileno Laboratório HotteThermoFisher Scientific12576606para a preparação de ácido sulfúrico
Placa de Imunologia Strong
Adsorção MAXISORP Fundo Plano
Poço F96		Dutscher55303bom para ligação ao anticorpo carregado
Vedação de Microplacas Fita(100 folhas)ThermoFisher Scientific15036
Microplate  leitor de modo único SunriseTECAN
Microplate shaker-incubatorDutscher441504
Lavadora de microplacas WellwashThermoFisher Scientific5165000
Pipeta multicanal (30-300 µ L) Pipetas de canalThermoFisher Scientific4661180N
(Kit 2: Finnpipettes F2 0.2-2 μ L micro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L)4700880Científica ThermoFisher
Hood único de 12 canais

Referências

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