Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

Summary

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

Abstract

Nós relatamos que o electroporation de mRNA permite proteínas fluorescentes etiquetar pilhas em embriões de codorniz vivos mais rapidamente e amplamente do que o electroporation do ADN. A eficiência elevada do transfection permite pelo menos 4 mRNAs distintos ser co-transfected com eficiência do ~ 87%. A maioria dos mRNAs em é degradada durante os primeiros 2 h borne-Electroporation, permitindo que os experimentos tempo-sensíveis sejam realizados no embrião tornando-se. Finalmente, nós descrevemos como dinamicamente imagem embriões vivos em com os mRNAs que codificam várias proteínas fluorescentes alvejadas subcellular.

Introduction

O electroporation é um método físico do transfection que use um pulso elétrico para criar pores transientes na membrana de plasma, permitindo que as substâncias como ácidos nucleicos ou produtos químicos passem no cytosol. O electroporation é amplamente utilizado para entregar o ADN nas bactérias, no fermento, nas plantas, e nas pilhas mamíferos^1,2,3. É rotineiramente usado para introduzir cargas genéticas em células-alvo e tecidos dentro do embrião aviário em desenvolvimento para estudar o controle genético do desenvolvimento ou rotular populações migratórias de células^4,5,6, o ⁷. Entretanto, várias limitações experimentais também existem com a eletroporação do DNA⁸. Por exemplo, o electroporation do ADN introduz frequentemente números altamente variáveis de vetores da expressão por a pilha e subseqüentemente o mRNAs e as proteínas que codificam. Essa variabilidade pode levar a uma considerável heterogeneidade celular que complica tanto a análise de imagem quanto a interpretação dos dados^9,10. Adicionalmente, as proteínas do Electroporation do ADN começam somente expressar ~ 3 h borne-Electroporation e não alcangam a eficiência máxima no número de pilha e na intensidade da fluorescência até 12 h, provável devido ao tempo exigido para transferir no núcleo e terminar transcrição e tradução in vivo¹¹.

Em contraste, o transfection de mRNA foi usado eficazmente em uma variedade de sistemas modelo, incluindo oócitos de Xenopus laevis pelo microinjection^12,13, reprogramando pilhas de haste humanas pelo transfection 14 do Lipofectamine do mRNA , e electroporating pilhas de haste neural recalcitrantes em ratos adultos¹⁵. Nós testamos a habilidade do Electroporation do mRNA para etiquetar eficientemente pilhas durante o desenvolvimento embrionário aviário adiantado usando in vitro os mRNAs sintetizados que codificam proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nossos estudos, utilizamos o vetor pCS2 +, um vetor de expressão multiuso que é comumente usado para expressar proteínas em embriões de Xenopus e zebrafish. Os promotores da polimerase do RNA SP6 e T7 no pCS2 + permitem a síntese de mRNA e proteína de qualquer gene clonado quando utilizado em um sistema de transcrição/tradução in vitro.

Aqui, Nós demonstramos que o electroporation de mRNA permite a expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulating da codorniz. Nós projetamos e gerou muitos dos vetores de expressão utilizados nesses estudos. Por exemplo, subclonamos o gene LifeAct-eGFP¹⁶ para o pCS2 + vector¹⁷ para expressar do promotor CMV e promotor SP6. O gene introduzido encontra-se a jusante do promotor SP6 e a montante da cauda de SV40 Poly (A)¹⁸. Nos embriões co-electroporated com mRNA e ADN, os FPs codificados de mRNAs transcritos in vitro foram detectados primeiramente dentro de 20 minutos do Electroporation, visto que os FPs dos vetores da expressão do ADN foram detectados somente após 3 h. codificação múltipla de mRNAs para nuclear, Golgi, e as proteínas da membrana podem ser em em um embrião simultaneamente, tendo por resultado a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas em pilhas individuais. Finalmente, usando uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (Frap), nós mostramos que uma maioria da deterioração em dos mRNAs dentro de 2 h. Assim, a produção inicial rápida da proteína combinada com a tradução nova limitada da proteína faz a Electroporation do mRNA uma técnica valiosa quando o controle temporal da expressão é necessário.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas do Children ' s Hospital los Angeles e da Universidade do Sul da Califórnia institucional cuidados com animais e comitês de uso.

1. geração de vetores de expressão baseada em pCS2

1. Para clonar pCS2. Lifeact-eGFP, prepare a espinha dorsal do vetor digerindo 2 μg de pCS2. CycB1-GFP (um constructo contendo uma pastilha diferente) com BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão adequado (ver tabela de materiais) diluído a 1x em uma reação total volume de 50 μL para 1 h a 37 ° c (ver Figura 1 para o esquema do procedimento de clonagem).
   1. Dephosphorylate os 3 ' OH extremidades livres da espinha dorsal do vetor da reação da enzima da limitação adicionando a fosfatase alcalina do camarão (1 U). Incubar por 30 min a 37 ° c.
   2. Executar toda a mistura em um 1% agarose gel/1x Tris Acetato de EDTA (TAE) tampão em 90 V para ~ 50 min e depois manchar o gel em uma 0,5 μg/mL solução de brometo de etídio em 1x TAE tampão para 15 min com suave de balanço. Além disso, certifique-se de carregar marcadores de peso molecular em uma pista livre para ajudar a determinar os tamanhos de DNA.
   3. Usando um transilluminator UV seguro do ADN para evitar entalhar DNAs, corte a espinha dorsal do vetor (tamanho de faixa esperado de 4kb) do gel do agarose rapidamente e isole o fragmento do ADN da parte do gel usando um jogo da purificação do gel usando instruções do fabricante.
2. Simultaneamente com a etapa 1,1, prepare a pastilha digerindo 2 μg de pEGFP-N1-Lifeact com BglII (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão apropriado diluído a 1x em um volume de reação total de 50 μL por 1 h a 37 ° c. Funcione a mistura inteira em um gel do agarose de 1% para isolar a faixa de 800 BP como explicado previamente na etapa 1.1.2-1.1.3.
3. Depois que o vetor e a inserção são purificados e quantificados no espectrofotômetro, combine 50 ng do vetor e 38 ng da inserção (relação do molar 1:3 do vetor à inserção) no amortecedor da ligase do ADN T4 antes de adicionar a ligase do ADN T4 para catalisar a reação da ligadura. Além disso, configure um controle sem DNA, apenas um controle vetorial e um controle de inserção. Incubar todas as reacções à temperatura ambiente durante 30 min.
   1. Transformar 1 μL de mistura (s) de ligadura em E. coli competente DH10. Além disso, transformar a água apenas controle negativo e 20 PG de pUC19 controle positivo. Espalhe bactérias em placas de agar de caldo Luria (LB) contendo 50 μg/mL de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° c.
   2. Na manhã seguinte, conte as colônias em cada prato.
      Nota: Idealmente, não deve haver colônias nas placas de controle negativo, > 100 colônias nas placas de ligadura vector + INSERT, e menos colônias na placa vetorial.
   3. Escolha pelo menos 8 colônias bacterianas da placa de agar transformadas com a mistura de ligadura vector + INSERT e inoculá-las usando palitos estéreis ou pontas de Pipet em 2 mL de caldo LB líquido contendo 50 μg/mL de ampicilina.
   4. Extraia o DNA de cada um dos clones usando kits de protocolo de plasmídeo comercial.
   5. Execute um resumo de restrição diagnóstica usando 500 ng de DNA de cada clone usando NotI (10 U) e BamHI (10 U) no tampão de digestão apropriado diluído para 1x por 1 h a 37 ° c e execute o DNA digerido em um gel de agarose 1% em 1x TAE buffer. Os tamanhos de banda esperados para clones pCS2. Lifeact-eGFP positivos são 3,9 KB e 978 BP.
   6. Transforme 1 pg-100 ng de DNA do clone positivo em e. coli competente DH10, e prepare 3-4 reações protocolo conforme detalhado em etapas anteriores para obter uma quantidade suficiente de DNA para reação de transcrição in vitro (mínimo de 10 μg).

2. preparação do mRNA por transcrição in vitro

1. Linearize 10 μg de pCS2. LifeAct-eGFP na extremidade 3 ' da pastilha com NotI (10 U) em um tampão apropriado da digestão diluído a 1x em um volume total da reação de 50 μL em 37 ° c durante a noite.
   Nota: Para evitar a contaminação por RNase e reduzir a degradação do mRNA, use luvas durante o manuseio de amostras de mRNA.
2. Purificar o DNA usando uma mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1, v/v).
   1. Adicionar 150 μL de água livre de RNase para fazer o volume total da reacção de digestão igual a 200 μL. Em seguida, adicione 200 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico e vórtice a mistura por 20 s.
   2. Centrifugador em um microcentrífuga na velocidade máxima (18.400 x g) para 2 min. Remova com cuidado a fase aquosa superior que contem o ADN linearizada. Repita este passo para remover impurezas adicionais e tenha cuidado para não interromper o precipitado branco que pode se formar entre as fases líquida inferior e superior.
3. Precipitate o ADN linearizada adicionando 1/10 acetato do sódio do volume 3M (RNase-livre) e 2,5 volumes de 100% etanol. Deixe a mistura a-20 ° c por > 30 min, em seguida, pellet o DNA por centrifugação na velocidade máxima (18.400 x g).
   1. Lave o pellet DNA com 70% etanol, em seguida, secar o pellet por > 5 min.
   2. Dissolva a pelota do ADN em 5 μL de água RNase-livre. Quantificar o DNA por Espectrofotômetro.
      Nota: A concentração esperada de DNA é de ~ 0,5-1 μg/μL com uma relação A260/A280 entre 1,7-2,0.
4. Use 1 μg do DNA linearizado de pCS2. LifeAct-eGFP para transcrição in vitro (IVT). Siga as instruções do fabricante no kit comercial (ver tabela de materiais) para incluir 10 μL de tampão analógico (concentração final 0,8 mM) e NTPs (concentração final de 1 mM para ATP, CTP e TTP; 0,2 mM para GTP), 2 μL de tampão de reacção 10x (concentração final 1x), 2 μL de RNA polymerase de SP6, e água RNase-livre até 20 μL.
   1. Incubar a mistura IVT por cerca de 2 h ou mais, dependendo do tamanho da transcrição.
      Nota: 2 h incubação funciona bem para uma transcrição de 3 KB, mas a incubação durante a noite funciona melhor para transcrições que são maiores do que 5 KB.
   2. Para remover nucleotídeos livres da reação da transcrição, adicione 30 μl da solução da precipitação do RNA de LiCl (cloreto de lítio de 7,5 M, EDTA de 50 milímetros) para precipar o mRNA. Vórtice a mistura brevemente e armazene a-20 ° c por 30 min. Gire o mRNA para baixo por 15 min em um microcentrífuga na velocidade máxima (18.400 x g) e enxague com 70% de etanol (RNase-livre).
5. Dissolver o mRNA sintetizado em 15 μL de água RNase-livre. Dispensar o mRNA sintetizado em 5 μL/tubo (total de 3 tubos) e coloc em-80 ° c para o armazenamento a longo prazo. Quantitate o mRNA com um espectrofotômetro.
   Nota: O rendimento esperado é de 15-20 μg de mRNA (~ 1 μg/μL). 1 μL (1 μg/μL) é suficiente para um experimento com ~ 10 embriões, assumindo que o mRNA é diluído de 1 μg/μL para 500 ng/μL e que cada embrião é injetado com ~ 200 nL. Cada tubo deve, portanto, conter mRNA suficiente para ~ 5 experimentos.
6. Run ~ 300 ng de mRNA em um gel de agarose 1% em 1x TAE buffer após a limpeza de todos os equipamentos de gel com a solução de descontaminação RNase (por exemplo, RNase Away) e garantir que o mRNA aparece como uma banda (várias bandas podem estar presentes se as estruturas secundárias formam) e que não esfregaço um ppears na pista do gel, que indica a degradação do RNA.

3. preparação de mRNA Electroporation Mix

1. Thaw e diluir o mRNA na concentração desejada (250-500 ng/μL na água RNase-livre trabalha bem para todos os mRNAs testados neste trabalho). Adicionar 1/10 volume de corante colorido (ver tabela de materiais, RNAse-livre, 0,1% concentração final) para ajudar a visualizar o local de injeção de mRNA e colocar adequadamente os eletrodos.
   Nota: se o ADN e o RNA são combinados para executar um co-Electroporation, assegure-se de que o ADN esteja livre de contaminar RNases usando a extração do phenol-clorofórmio e a precipitação do álcool etílico antes da mistura do mRNA e do ADN.
   1. Certifique-se de preparar um controle negativo usando uma solução de Electroporation mock (sem RNA adicionado). Se possível, prepare um controle positivo usando mRNA pré-validado (mRNA que foi mostrado para produzir FP com sucesso em experimentos anteriores).
      Nota: O controle negativo é essencial para que todos os experimentos de imagem estabeleçam níveis de fluorescência de fundo para normalização dos dados. O controle positivo é especialmente importante quando se trabalha com mRNA recém-transcrito, ajudando a confirmar que as configurações de eletroporação funcionou.
2. Armazene a solução do Electroporation de mRNA em uma pasta do gelo para impedir a degradação até pronto para prosseguir com Electroporation.

4. electroporate mRNAs em embriões de codorniz vivos

1. Colete ovos de codorniz fertilizados recentemente colocados diariamente e armazene a 13 ° c em um refrigerador humidificado por não mais de 1 semana. Incubar os ovos de codorniz a 38 ° c até os estágios de desenvolvimento embrionário desejados^19,20,21.
   Nota: HH3 a HH5 foram usados neste estudo para a imagem latente estática e dinâmica. Para embriões de HH3, deixar os ovos à temperatura ambiente durante 2 h antes da colheita torna o processo de isolamento muito mais fácil, uma vez que os embriões são geralmente mais resistentes às manipulações físicas quando arrefecidos.
2. Isolar e preparar embriões de acordo com o sistema de cultura CE²². Colete pelo menos 5 embriões por condição, incluindo pelo menos um para servir como um controle negativo (não electroporated).
   1. Quebre suavemente e despeje o ovo em um prato de Petri de 10 cm. Remova a maioria da albumina grossa com uma pipeta de transferência e remova a albumina grossa restante em torno do embrião limpando delicadamente a superfície da gema com um apagamento do tecido para assegurar-se de que o embrião fura firmemente ao anel de papel.
   2. Coloque o papel de filtro pré-cortado (ver tabela de materiais) sobre o embrião e use tesouras para cortar suavemente em torno do perímetro do embrião.
   3. Use uma pipeta de Pasteur para fundamentam o embrião com PBS, usando córregos suaves para desocupar toda a gema que adere ao embrião.
      Nota: Este passo é crítico quando se trabalha com embriões mais jovens (< HH3), porque estes embriões tendem a ficar mais para a gema e muitas vezes se desprendem da membrana vitelina durante as etapas de lavagem subsequentes.
   4. Puxe lentamente o anel do embrião/papel em um ângulo oblíquo acima e fora da gema em um prato de Petri enchido com o PBS para uma limpeza mais adicional. Uma vez removida a maior parte da gema, coloque o lado ventral do embrião em uma placa de Petri de 35 mm, coberta com uma mistura semisólida de agar/albume.
3. Prepare seis a 8 10 cm-microcapilares de vidro longos (O.D. = 1,2 milímetros) usando um instrumento de vidro do extrator da micropipeta.
4. Coloc o lado ventral do embrião acima na câmara do Electroporation enchida com o PBS. Usando um microcapilar de vidro, injete um bolus de 200 NL da mistura do Electroporation do mRNA ou do ADN/mRNA na cavidade entre a membrana do epiblasto e do vitelina que cobre a região desejada.
   Nota: Toda a área anterior para pelúcida e alguma área para opaca foi eletroporada na maioria dos experimentos mostrados neste manuscrito.
5. Coloc os elétrodos positivos e negativos (elétrodo quadrado liso da platina; comprimento lateral de 5 milímetros) na parte superior e na parte inferior do embrião respectivamente e electroporate usando a seguinte seqüência do pulso: cinco pulsos elétricos quadrados de 5 V, duração de 50 ms com intervalos de 100 ms usando um electroporator in vivo. Assegure-se de que a distância entre os eléctrodos é de ~ 5 mm.
   Nota: Otimizar os parâmetros de eletroporação é crucial para evitar condições que possam matar as frágeis células embrionárias. Os parâmetros da tensão, do comprimento de pulso, dos intervalos do pulso, e do número de pulsos para o ADN e o mRNA devem ser considerados para vários dispositivos do Electroporation.
6. Incubar os embriões eletroporados a 38 ° c até o estágio de desenvolvimento desejado.
   Nota: Um estereoscópio de dissecação fluorescente (ver tabela de materiais) ajuda a tela transfected versus embriões não transfected.
7. Se os embriões devem ser estaticamente imaged, corrigi-los em 4% paraformaldeído em PBS para 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° c.
   1. Remova os embriões da membrana do vitelina cortando lisamente em torno do perímetro do papel de filtro com tesouras e descascando fora a membrana brilhante na superfície dorsal com o fórceps afiado delicadamente.
   2. Lave os embriões fixos em PBS/Triton (0,1%) 2x por 5 min e continuar com hibridação in situ ou imunocoloração, se desejado.
   3. Finalmente, manchar o embrião em 0,5 μg/μL DAPI em PBS/Triton (0,1%) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Lave os embriões em PBS/Triton 2x durante 5 min e limpe o embrião na solução SCALE-U2²³ durante a noite.
8. Para analisar a eficiência da eletroporação (veja a Figura 2), use a ferramenta de análise de partículas e binários e o canal DAPI no ImageJ para obter contornos nucleares de todas as células da imagem.
   1. Para usar a ferramenta binária no ImageJ, use um único z-Slice no canal DAPI que contém a maioria das células e clique em processar ≫ binário ≫ Make Binary. Para separar células próximas, clique em processar ≫ binário > bacia hidrográfica. Obter contornos de célula clicando em analisar ≫ analisar partículas, tamanho definido como 100-500 (μm²).
   2. Verifique se a maioria das células está descrita no canal DAPI e salve os contornos da célula clicando em mais ≫ salvar na janela pop-up do Gerenciador de ROI.
   3. Use esses contornos para obter valores de intensidade de fluorescência para o canal mRNA e DNA abrindo o arquivo salvo anteriormente em uma única fatia z no canal mRNA ou DNA e clique em medir no Gerenciador de ROI.
   4. Por fim, filtre esses valores de intensidade, contando células com intensidade de fluorescência de < 6000 como não transfectadas e células com intensidade de fluorescência de > 6000 como transfected.

5. imagem FPs codificado por mRNAs electroporated

1. Escolha o embrião o mais saudável e o melhor em para os experimentos dinâmicos da imagem latente após ter oltado todos os embriões em o estereoscópio de dissecação fluorescente.
   1. Continuar a incubar os outros embriões eletroporados e o embrião não eletroporado (o controle negativo) em uma incubadora separada enquanto a imagem do embrião escolhido no caso deste embrião morre durante o experimento.
2. Para a imagem latente dinâmica, use a cultura do embrião da aviária da inteiro-montagem ex ovo como descrita previamente^24,25,26 com um microscópio confocal invertido.
   Nota: o microscópio é equipado com uma incubadora do estágio (veja a tabela dos materiais) que mantem a temperatura em 36 ° c durante a imagem latente. Observou-se durante o set-up do microscópio que os embriões incubados em 36 ° c sobrevivem mais por muito tempo do que em umas temperaturas mais elevadas, possivelmente porque o laser pode causar o aquecimento local no embrião. Os leitores devem determinar a temperatura de incubação em estágio ideal para sua própria set-up de microscópio.
   1. Para imagem dinamicamente e visualizar a embriogênese, limpe o embrião eletroporado brevemente com PBS para remover quaisquer bolhas que possam se formar no lado dorsal do embrião durante o processo de eletroporação, movendo o embrião em torno usando fórceps em um PBS limpo Solução.
   2. Coloque o embrião limpo diretamente em um prato de imagem contendo uma fina camada de albume-Agar (~ 150 μL) certificando-se de não gerar quaisquer bolhas na superfície dorsal do embrião²².
   3. Para assegurar a sobrevivência para a imagem latente a longo prazo, adicione um pedaço enrolado úmido pequeno do papel de tecido nas bordas do interior do prato da imagem latente e sele o prato usando a película de parafina para minimizar a evaporação durante a imagem latente e a incubação.
   4. Mova este prato rapidamente para o estágio pré-aquecido de um microscópio confocal e localize o corante colorido no embrião usando o canal brightfield (laser PMT 20%), que identifica a região injetada e em.
3. Definir software de imagem para o objetivo desejado (10 ou 20x), espelho dicróico (488 nm para GFP nm, 561 para RFP), espectros de emissão (499-562 nm para GFP, 570-695 nm para RFP), e ligar um laser apropriado (488 nm para GFP, 561 nm para RFP).
   Nota: o mRNA electroporated foi traduzido nas proteínas que foram consideradas dentro de 20 minutos (veja Figura 3). Os metadados de imagem utilizados para a maioria das imagens neste trabalho foram: um microscópio confocal invertido com um objetivo de 20x (ver tabela de materiais); tempo de permanência do pixel, ~ 1,5 μs; média de varreduras de 4 linhas.
   1. Clique em Live no software de imagem e ajuste a potência do laser para uma configuração apropriada para a intensidade de fluorescência, dependendo de cada potência do laser do microscópio. Comece por imagem o embrião usando 1% de potência do laser, 800 ganho, e aumentar a potência do laser lentamente por incrementos de 1% até que os pixels saturados são vistos.
   2. Siga isto diminuindo a potência do laser ligeiramente até que nenhum pixel saturado seja visto anymore.
      Nota: O poder do laser escolhido para o começo de uma sessão da imagem latente de um embrião pode ser bom para uns pontos mais adiantados do tempo mas não ideal em uns pontos mais atrasados do tempo se a fluorescência das pilhas se torna muito mais brilhante ou mais dimmer sobre o tempo. Para abordar isso, a imagem do embrião em configurações de energia ligeiramente inferiores inicialmente, uma vez que as células eletroporadas geralmente obter mais brilhantes durante as primeiras 6 horas após a electroporação (ver Figura 3a-E para a quantificação do aumento do sinal). Se as imagens posteriores estiverem saturadas, continue a imagem com as configurações de imagem originais, mas tome uma imagem adicional imediatamente após com configurações de imagem mais fracas (pinhole menor ou potência laser mais fraca).
   3. Imagem do embrião a cada 3-5 min, a fim de rastrear a migração de células individuais em diferentes pontos temporais. Para este trabalho, as imagens eram z-pilhas (~ 50 μm grossos) da área em inteira, mais algum quarto extra para a parte inferior da z-pilha caso que o embrião afunda na cama do agarose durante todo a sessão da imagem latente.
   4. Observe o quão rápido as células estão se movendo, verificando os primeiros pontos de tempo do primeiro filme. Se as células estão se movendo em uma taxa rápida (o que significa que eles vão sair da área da região imaged dentro de um par mais pontos de tempo), considere expandir o zoom da área imaged (1x à 0.8 x) ou imagem de uma região diferente.
      Nota: As regiões Embryonic na área pelúcida movem-se muito mais ràpida do que aquelas na área opaca. Adicionalmente, os embriões mais novos (HH3, HH5) contêm frequentemente as pilhas que estão submetendo-se a um movimento mais rápido comparado aos embriões mais velhos (> HH7).
   5. Após a imagem da região eletroporada do embrião, uma região não-eletroporada do mesmo embrião para determinar os níveis de autofluorescência (deve ser mínima se a baixa potência do laser < 10% é usada para a imagem do embrião).

6. recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) para a integridade do mRNA do ensaio

Nota: Uma recuperação in vivo da fluorescência após o ensaio do photobranqueamento (FRAP) pode ser usada para determinar quanto tempo transfected o mRNA poderia ser traduzido em FPs. O protocolo a seguir descreve uma experiência de FRAP para detectar a meia-vida de H2B. MRNA citrino em um embrião em.

1. Realize experimentos de FRAP no microscópio confocal invertido usando um objetivo de 20x 0,8 NA e um furo de pino completamente aberto.
   1. Após ter confirmado o electroporation de H2B-Citrine no estereomicroscópio e em ajustar o embrião no estágio Pre-heated no microscópio confocal invertido (veja a etapa 5.2.4), photobleach a maioria da fluorescência celular do H2B-citrino em uma variedade de tempo pontos (45 min, 2 h e 5 h pós-eletroporação) usando o laser de 405 nm com 70% de potência laser, 100 iterações, velocidade de digitalização 4, que deixa apenas 5% de fluorescência restante.
      Nota: Este processo deve demorar alguns minutos.
   2. Continuar a incubar os embriões no estádio a 36 ° c após o fotobranqueamento.
2. Certifique-se de prestar atenção para dividir ativamente as células dentro da região fotobranqueada, que indicam que as células fotobranqueadas não morreram completamente após o tratamento.
3. Adquira imagens pós-lixívia (pilhas z da região eletroporada) por até 30 min em intervalos regulares de tempo (3 ou 5 min) usando o microscópio confocal.
   Nota: Se disponível, use uma linha transgênica do H2B-XFP como um controle positivo para assegurar a sobrevivência da pilha na região photobleached. A taxa de recuperação da fluorescência para o FP codificado pelo mRNA em deve diminuir, mas aquela para o FP codificado através do transgene deve permanecer consistente durante todo o filme inteiro.
4. Para garantir que as condições de imagem não afetam de forma deletária a sobrevida embrionária, incubar simultaneamente embriões eletroporados que não são fotobleached, o que pode servir como um controle para a imagem.
5. Para quantificar os resultados de fotobranqueamento para pós-eletroporação de decaimento de mRNA, acompanhe a fluorescência da célula ao longo do tempo (3 ou 5 min) medindo a intensidade de fluorescência do centro (um círculo de 7,5 μm) de cada célula usando ImageJ. Meça isto para todas as células dentro da região fotobranqueada que não estão submetidas a mitose e foram completamente fotobranqueadas.
   Nota: Considere omitir as células mitóticas da quantificação, uma vez que os núcleos mitóticos têm fluorescência mais forte do que os núcleos interfásicos devido à condensação da cromatina.
6. Plotar a intensidade de fluorescência ao longo do tempo pós-lixívia em uma variedade de pontos temporais (45 min, 2 h e 5 h).

Results

o electroporation do mRNA é mais eficiente do que o electroporation do ADN

Nós usamos pCS2 +. H2B-Citrine para preparar in vitro transcrito mRNA. Como a eletroporação de DNA geralmente é realizada em 1-2 μg/μL, utilizou-se uma concentração equimolar de mRNA (calculada para ser em torno de 0,25-0,5 μg/μL para H2B-citrino) para eletroporação de mRNA. Nós testamos primeiramente a eficiência do Electroporation de pC...

Discussion

Neste protocolo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre como precisamente microinjetar e electroporate mRNA nas células de embriões de codorniz gastrulating. Demonstramos que a eletroporação de mRNA sintetizada in vitro permite expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulantes de codorniz (Figura 2 e 3). A fluorescência da proteína H2B-citrina traduzida de mRNAs em podia ser detectada pela microscopia confocal dentro de ~ 20 minuto...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico	Thermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcrição in vitro	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol, t-Octylphenoxypolyetoxyethanol, Éter polietilenoglicol terc-octilfenílico
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2- (4-Amidinofenil) -6-dicloridrato de indolequibamidina , 4 ′, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato de DAPI
Whatman No.1 papel de filtro	Sigma Aldrich	WHA1001125
glicerol	Sigma Aldrich	G9012
Uréia	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi foi um presente de Dorus Gadella (plasmídeo Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Métodos 2008;5:605-7. ID do PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		Este artigo
pCS.H2B-citrino	Addgene	53752	pCS-H2B-citrino foi um presente de Sean Megason (plasmídeo Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry foi um presente de Sean Megason (plasmídeo Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Microscópio invertido Zeiss LSM-780	Carl Zeiss Microscopy GmbH		O LSM-780 é um microscópio confocal e multifotônico que oferece a sensibilidade necessária para o trabalho de imagem vital. Equipado com uma platina motorizada, um dispositivo de foco automático e uma incubadora blackout completa, o 780 é um excelente microscópio para imagens de células vivas/embriões de alta qualidade. O detector Quasar de 32 canais de alta sensibilidade permite imagens espectrais, separação linear e aquisição de imagens de alta contagem de cores (>4). A excitação pode ser realizada com lasers de fóton único de 6 linhas (405, 458, 488, 514, 564 e 633 nm), laser de 2 fótons Chameleon (Coerente) (faixa de 690nm a 1000nm) e executado com o software de sistema ZEN 2011 SP7 (Preto).
CUY-21 EDIT in vivo eletroporador	Bex Co., Ltd.
Eletrodo quadrado plano de platina, comprimento lateral 5 mm	Bex Co., Ltd.
Microscópio Estéreo Olympus MVX10 FL	Olympus LifeScience
XM10	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline para HCR (10&vezes;, pH 7,4)			Para preparar 1 L de uma solução estoque de 10&vezes, combine 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anidro; Sigma-Aldrich S3264) e 2,7 g de KH2PO4 (anidro; Sigma-Aldrich P9791). Ajuste o pH para 7,4 com HCl e traga o volume final para 1 L com H2O ultrapuro. Evite usar CaCl2 e MgCl2 em PBS para HCR. É importante que o PBS para HCR seja preparado como uma solução livre de RNase (por exemplo, por meio de tratamento com dietilpirocarbonato [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Adicione 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) e 100 mL de 10× PBS para 890 mL de H2O destilado ultrapuro. Filtrar a solução através de um 0,2 μ m filtro e armazená-lo em 4 ? C até o uso.
1 &vezes; solução salina tamponada com fosfato (PBS) (tratada com DEPC; pH 7,4)
0,1% Triton X-100