Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

Summary

Nós relatamos o electroporation do RNA do mensageiro (mRNA) como um método que permita a expressão rápida e eficiente de proteínas múltiplas no sistema do modelo do embrião de codorniz. Este método pode ser usado para cDNAs etiquetar pilhas e gravar seus movimentos in vivo pela microscopia do tempo-lapso logo após o electroporation.

Abstract

Nós relatamos que o electroporation de mRNA permite proteínas fluorescentes etiquetar pilhas em embriões de codorniz vivos mais rapidamente e amplamente do que o electroporation do ADN. A eficiência elevada do transfection permite pelo menos 4 mRNAs distintos ser co-transfected com eficiência do ~ 87%. A maioria dos mRNAs em é degradada durante os primeiros 2 h borne-Electroporation, permitindo que os experimentos tempo-sensíveis sejam realizados no embrião tornando-se. Finalmente, nós descrevemos como dinamicamente imagem embriões vivos em com os mRNAs que codificam várias proteínas fluorescentes alvejadas subcellular.

Introduction

O electroporation é um método físico do transfection que use um pulso elétrico para criar pores transientes na membrana de plasma, permitindo que as substâncias como ácidos nucleicos ou produtos químicos passem no cytosol. O electroporation é amplamente utilizado para entregar o ADN nas bactérias, no fermento, nas plantas, e nas pilhas mamíferos^1,2,3. É rotineiramente usado para introduzir cargas genéticas em células-alvo e tecidos dentro do embrião aviário em desenvolvimento para estudar o controle genético do desenvolvimento ou rotular populações migratórias de células

Protocol

Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas do Children ' s Hospital los Angeles e da Universidade do Sul da Califórnia institucional cuidados com animais e comitês de uso.

1. geração de vetores de expressão baseada em pCS2

1. Para clonar pCS2. Lifeact-eGFP, prepare a espinha dorsal do vetor digerindo 2 μg de pCS2. CycB1-GFP (um constructo contendo uma pastilha diferente) com BamHI (10 U) e BsrGI (10 U) em tampão de digestão adequado (ver tabela de materiais) diluído a 1x em uma reação total volume de 50 μL para 1 h a 37 ° c (ver Figura 1 para o esquema ....

Results

o electroporation do mRNA é mais eficiente do que o electroporation do ADN

Nós usamos pCS2 +. H2B-Citrine para preparar in vitro transcrito mRNA. Como a eletroporação de DNA geralmente é realizada em 1-2 μg/μL, utilizou-se uma concentração equimolar de mRNA (calculada para ser em torno de 0,25-0,5 μg/μL para H2B-citrino) para eletroporação de mRNA. Nós testamos primeiramente a eficiência do Electroporation de pC.......

Discussion

Neste protocolo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre como precisamente microinjetar e electroporate mRNA nas células de embriões de codorniz gastrulating. Demonstramos que a eletroporação de mRNA sintetizada in vitro permite expressão rápida e eficiente de proteínas fluorescentes (FPs) em embriões gastrulantes de codorniz (Figura 2 e 3). A fluorescência da proteína H2B-citrina traduzida de mRNAs em podia ser detectada pela microscopia confocal dentro de ~ 20 minuto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico	Thermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcrição in vitro	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol, t-Octylphenoxypolyetoxyethanol, Éter polietilenoglicol terc-octilfenílico
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2- (4-Amidinofenil) -6-dicloridrato de indolequibamidina , 4 ′, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato de DAPI
Whatman No.1 papel de filtro	Sigma Aldrich	WHA1001125
glicerol	Sigma Aldrich	G9012
Uréia	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi foi um presente de Dorus Gadella (plasmídeo Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Métodos 2008;5:605-7. ID do PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		Este artigo
pCS.H2B-citrino	Addgene	53752	pCS-H2B-citrino foi um presente de Sean Megason (plasmídeo Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry foi um presente de Sean Megason (plasmídeo Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Microscópio invertido Zeiss LSM-780	Carl Zeiss Microscopy GmbH		O LSM-780 é um microscópio confocal e multifotônico que oferece a sensibilidade necessária para o trabalho de imagem vital. Equipado com uma platina motorizada, um dispositivo de foco automático e uma incubadora blackout completa, o 780 é um excelente microscópio para imagens de células vivas/embriões de alta qualidade. O detector Quasar de 32 canais de alta sensibilidade permite imagens espectrais, separação linear e aquisição de imagens de alta contagem de cores (>4). A excitação pode ser realizada com lasers de fóton único de 6 linhas (405, 458, 488, 514, 564 e 633 nm), laser de 2 fótons Chameleon (Coerente) (faixa de 690nm a 1000nm) e executado com o software de sistema ZEN 2011 SP7 (Preto).
CUY-21 EDIT in vivo eletroporador	Bex Co., Ltd.
Eletrodo quadrado plano de platina, comprimento lateral 5 mm	Bex Co., Ltd.
Microscópio Estéreo Olympus MVX10 FL	Olympus LifeScience
XM10	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline para HCR (10&vezes;, pH 7,4)			Para preparar 1 L de uma solução estoque de 10&vezes, combine 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anidro; Sigma-Aldrich S3264) e 2,7 g de KH2PO4 (anidro; Sigma-Aldrich P9791). Ajuste o pH para 7,4 com HCl e traga o volume final para 1 L com H2O ultrapuro. Evite usar CaCl2 e MgCl2 em PBS para HCR. É importante que o PBS para HCR seja preparado como uma solução livre de RNase (por exemplo, por meio de tratamento com dietilpirocarbonato [DEPC]).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Adicione 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) e 100 mL de 10× PBS para 890 mL de H2O destilado ultrapuro. Filtrar a solução através de um 0,2 μ m filtro e armazená-lo em 4 ? C até o uso.
1 &vezes; solução salina tamponada com fosfato (PBS) (tratada com DEPC; pH 7,4)
0,1% Triton X-100