Este artigo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo induzido por ligadura de periodontite murine envolvendo múltiplos molares maxilars, resultando em áreas maiores do tecido gingival envolvido e osso para análise posterior, bem como redução do uso animal. Uma técnica para avaliar neutrófilos orais de uma forma análoga aos seres humanos também é descrita.
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Artigo de método
Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais
Neste artigo
Resumo
Resumo
As principais vantagens do estudo da fisiopatologia da doença periodontal utilizando modelos de urina são o custo reduzido dos animais, a variedade de cepas geneticamente modificadas, o grande número de análises que podem ser realizadas em tecidos macios e duros colhidos. No entanto, muitos destes sistemas estão sujeitos a críticas processuais. Como alternativa, o modelo induzido pela ligadura da doença periodontal, impulsionado pelo desenvolvimento localizado e retenção de um microbioma oral disbiótico, pode ser empregado, o que é rapidamente induzido e relativamente confiável. Infelizmente, as variantes do protocolo de periodontite murine induzida por ligadura são isoladas para regiões focais do periodontium e sujeitas à avulsão prematura da ligadura instalada. Isso minimiza a quantidade de tecido disponível para análises subsequentes e aumenta o número de animais necessários para estudo. Este protocolo descreve as manipulações precisas necessárias para colocar ligaduras molar estendidas com melhor retenção e uso de uma nova técnica de lavagem para recuperar neutrófilos orais em camundongos com uma abordagem alternativa que atenua o referido desafios técnicos.
Introdução
A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer5,6,
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Protocolo
Todos os estudos de urina cumpriram os regulamentos éticos relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de Toronto e pelo Research Ethics Board (Protocol 20011930).
1. Instalação da ligadura
NOTA: Este é um procedimento cirúrgico não-estéril que pode ser realizado em uma sala de cirurgia padrão. O uso de animais livres de germes (não cobertos aqui) exige o manuseio dentro de um armário de biossegurança, o uso de instrumentos estéreis e a inoculação da cavidade oral com patógenos periodontais para causar as manifestações clínicas de periodontite.
- Administrar anestesia ....
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Resultados
Dados representativos de citometria de fluxo de amostras de lavagem oral de uma ingênua(Figura 3A)e inflamado(Figura 3B) murine cavidade oral secundária à periodontite induzida pela ligadura são fornecidos. A recuperação de PMNs de uma ligadura instalada também é demonstrada(Figura 3C). As tensões do canal do cytometer do fluxo foram calibradas manualmente, e a compensação foi execu.......
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Discussão
O elemento mais crítico associado ao uso do modelo de periodontite induzido pela ligadura murine é centrado em torno da retenção da ligadura até o momento do sacrifício ou remoção intencional. A ligadura biofilme-retentive instalada é capaz de induzir uma perda significativa de altura alveolar do osso em tão poucos quanto 6 dias, platô entre o período de 11-16 dias39. A decisão de sacrificar indivíduos animais antes do período máximo de perda óssea, tornando este um modelo muito mais curto de peri.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
J. W. C. é apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Chunxiang Sun por sua ajuda na realização da coloração azul trypan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-rato F4 / 80 | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anticorpo anti-camundongo Ly6G | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL / 6 Camundongos machos | Charles River | 8 a 12 semanas de idade | |
| Tubo de centrífuga cônico | FroggaBio | TB15-500 | de 15 mL |
| FroggaBio | TB50-500 | 50 mL | |
| FACS Buffer | Múltiplo | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Modelo 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Bomba de Terapia de Calor | Hallowell | HTP-1500 | |
| Esterilizador de esferas de vidro quente | Microscópio Eletrônico Ciências | 66118-10 | Germinador 500 |
| Tesoura de Íris | Almedic | 7602-A8-684 | Cetamina Reta |
| Vetoquinol | 100mg/mL | ||
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Soro de Camundongo | Filtro de | M5905-5ML | |
| Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 & Micro; m | |
| Paraformaldeído | Fisher Scientific | 28908 | 16% (p/v), Livre de Metanol |
| Solução salina tamponada com fosfato | Sigma | D1408-500ML | sem CaCl2 e MgCl2, 10x |
| Seringas descartáveis de plástico | BD | 309659 | 1 mL |
| Soro de rato | Sigma | R9759-5ML | |
| Sutura de seda | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Pinça de Fragmentação | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Pinça de Fragmentação | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Microscópio de Dissecação Estéreo | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| BD | 305111 | 26G X 1/2" | |
| Seringa | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
Referências
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
- Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005). <....
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Reimpressões e permissões
