Artigo de método

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

DOI:

10.3791/59676

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13 de setembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Neste artigo

Resumo

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Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estímulos mecânicos são conhecidos por modulam funções biológicas de células e tecidos. Estudos recentes sugerem que o estresse compressivo altera a arquitetura da cartilagem da placa de crescimento e resulta na modulação do crescimento de ossos longos de crianças. Para determinar o papel do stress compressivo no crescimento ósseo, criamos um dispositivo microfluídico acionado por pressão pneumática, para dinamicamente (ou estaticamente) comprimir condrócitos de placa de crescimento embutidos em cilindros de hidrogel de alginato. Neste artigo, descrevemos métodos detalhados para fabricar e caracterizar este dispositivo. As vantagens de nosso protocolo são: 1) cinco magnitudes diferentes do esforço compressivo podem ser gerados em cinco repetições técnicas em uma única plataforma, 2) é fácil visualizar a morfologia da pilha através de um microscópio de luz convencional, 3) as pilhas podem ràpida ser isoladas a partir do dispositivo após a compressão para facilitar os ensaios a jusante, e 4) a plataforma pode ser aplicada para estudar mecanobiologia de qualquer tipo de célula que pode crescer em hidrogéis.

Introdução

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As plataformas micro-projetadas são ferramentas valiosas para estudar a biologia molecular, celular, e do nível de tecido porque permitem o controle dinâmico dos microambientes físicose químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Assim, as hipóteses múltiplas podem simultaneamente ser testadas em uma maneira firmemente controlada. No caso da cartilagem da placa de crescimento, há evidências crescentes de um importante papel do estresse compressivo na modulação do crescimento ósseo através da ação sobre a cartilagem da placa de crescimento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. No entanto, o mecanismo de ação do estresse compressivo – em particular, como o estresse orienta a formação de colunas de condrócitos na placa de crescimento – é pouco compreendido.

O objetivo deste protocolo é criar um dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico de acionamento pneumaticamente26 para elucidar mecanismos de mecanobiologia em condrócitos de placa de crescimento (Figura 1a-c). O dispositivo consiste em duas porções: a unidade pneumática da atuação e a construção do gel do alginato. A unidade de acionamento pneumático microfluídico é fabricada com polidimetilsiloxano (PDMS) com base na foto e na Soft-litografia. Esta unidade contem uma disposição 5 x 5 de balões finos da membrana de PDMS que podem ser inflados diferentemente baseados em seus diâmetros. A construção do gel do alginato consiste nos condrócitos encaixados em uma disposição 5 x 5 de cilindros do gel do alginato, e os constructos inteiros do alginato-chondrocyte são montados com a unidade da atuação. As construções de gel de alginato são compactadas pelos balões PDMS inflacionados pneumaticamente (Figura 1b). O dispositivo microfluídico pode gerar cinco níveis diferentes de estresse compressivo simultaneamente em uma única plataforma baseada em diferenças no diâmetro do balão PDMS. Assim, um teste da elevado-taxa de transferência do mechanobiology do condrócitos circunstâncias múltiplas da compressão é possível.

O dispositivo microfluídico descrito neste protocolo tem muitas vantagens sobre o dispositivo de compressão convencional, tais como fixadores externos14,21,23 e dispositivos de compressão macroscópica16, 19 anos de , 27 anos de , 28 para estudar a mecanobiologia do condrócitos: 1) o dispositivo microfluídicos é cost-effective porque consome o volume menor das amostras do que o dispositivo macroscópico da compressão, 2) o dispositivo microfluídicos é tempo eficaz porque pode testar o múltiplo condições de compressão simultaneamente, 3) o dispositivo microfluídico pode combinar estímulos mecânicos e químicos, formando um gradiente de concentração de produtos químicos com base na mistura limitada em microcanais, e 4) várias técnicas de microscopia (lapso de tempo microscopia e microscopia confocal da fluorescência) podem ser aplicados com o dispositivo microfluídicos feito de PDMS transparente.

Adotou-se e modificou o método de Moraes et al.7,29 para criar diferentes níveis de estresse compressivo em um único dispositivo para possibilitar estudos de mecanobiologia de alta produtividade de compressão de condrócitos. Nossa aproximação é apropriada para pilhas (por exemplo, chondrocytes) que precisam o ambiente tridimensional (3D) da cultura e para ensaios biológicos após ter comprimindo pilhas. Embora alguns dispositivos de compressão celular microfluídico possam comprimir células cultivadas em substratos bidimensionais (2D)30,31,32, eles não podem ser usados para condrócitos porque os condrócitos cultivados em 2D desdiferenciam-se. Existem plataformas microfluídico para comprimir células 3D cultivadas em hidrogéis fotopolimerizados7,33, mas eles são limitados em isolar as células após experimentos de compressão porque isolar as células de fotopolimerizadas hidrogel não é fácil. Adicionalmente, os efeitos da exposição ultravioleta (UV) e dos iniciadores de reticulação da foto nas pilhas podem precisar de ser avaliados. Em contraste, nosso método permite o isolamento rápido de células após experimentos de compressão para ensaios pós-biológicos, pois os hidrogéis de alginato podem ser despolimerizados rapidamente por quelantes de cálcio. Os métodos detalhados da fabricação e da caracterização do dispositivo são descritos neste protocolo. Um breve procedimento para fabricar o dispositivo de compressão microfluídico de condrócitos é mostrado na Figura 2.

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Protocolo

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Nota: Use equipamento de proteção individual (EPI) como luvas e jaleco para cada passo neste protocolo.

1. fabricação do molde mestre

Nota: execute a etapa 1,1-1,3 em uma capa das emanações.

  1. Tratamento de vidro
    Nota: Use um escudo facial, luvas e um jaleco para o passo 1,1.
    1. Faça a solução da piranha (60 mL) misturando O ácido sulfúrico (H2assim4) e O peróxido de hidrogênio (h2O2) com uma relação do volume de 3:1.
      Cuidado: não use a solução de piranha e a acetona na mesma capa de fumaça devido ao risco de explosão.
    2. Coloque uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em solução de piranha por 30 min a 40 ° c.
    3. Enxágüe a placa de vidro com água deionizada (diH2o).
    4. Coloque a placa de vidro em acetona à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Enxague a placa de vidro com isopropanol e seque-a com gás nitrogênio (N2).
    6. Asse a placa de vidro a 200 ° c por 20 min em uma placa quente. Todas as etapas subseqüentes do cozimento usam uma placa quente.
  2. Formação da camada de semente SU-8 na placa de vidro
    1. Espalhe SU-8 5 na placa de vidro com uma pipeta descartável para cobrir ao redor 2/3 da área de superfície da placa.
    2. Gire a placa de vidro com os fotororesists SU-8 5 em 500 RPM para 35 s (ciclo de giro inicial) e então 2.500 RPM para 40 s (ciclo de giro final) usando um Coater da rotação. Todas as etapas subsequentes do revestimento da rotação incluem o mesmo ciclo de giro inicial.
    3. Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, a 95 ° c durante 5 min.
    4. Expor a placa de vidro revestida Su-8 5 à luz UV (60 mW/cm2, distância entre a lâmpada UV e o Fotomáscara é 20 cm, quantidade total de energia luminosa UV = 60 MJ/cm2) para 1 s.
      Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada.
    5. Asse a placa de vidro revestida SU-8 5 a 65 ° c durante 2 min e a 95 ° c durante 5 min.
    6. Coloque a placa de vidro cozido no desenvolvedor SU-8 por 2 min.
    7. Asse o vidro revestido SU-8 5 a 180 ° c durante 20 min.
  3. Fabricação de padrão de canal SU-8 usando fotolitografia (Figura 2a etapa 1-3)
    1. Despeje SU-8 100 na placa de vidro semeado SU-8 5 para cobrir cerca de 2/3 da área de superfície da placa.
    2. Gire a placa de vidro com SU-8 100 em 3.000 rpm para 38 s (≈ 90 μm de espessura).
    3. Asse a placa de vidro revestida SU-8 100 a 65 ° c durante 10 min e, em seguida, a 95 ° c durante 30 min. Se SU-8 100 é ainda pegajoso após este procedimento, asse a placa de vidro por um tempo mais longo em 95 ° c até que SU-8 100 se torne não-pegajoso.
    4. Coloque uma Fotomáscara de microcanal de alta resolução (25.400 dpi, ver Figura complementar 1) na placa de vidro revestida SU-8 100 e expor a placa de vidro coberta de Fotomáscara à luz UV por 4 s (quantidade total de energia de luz uv = 240 MJ/cm2).
      Nota: o tempo de exposição UV deve ser ajustado de acordo com o poder de uma luz UV usada.
    5. Retire a máscara fotográfica da placa de vidro e asse a placa de vidro a 65 ° c durante 2 min e, em seguida, 95 ° c durante 20 min.
    6. Mantenha a placa de vidro cozida em um recipiente, que seja envolvida com a folha de alumínio para obstruir toda a luz, para a cura durante a noite.
    7. Desenvolva padrões de canal SU-8 100 na placa de vidro no desenvolvedor SU-8 por 15 min.
    8. Lave a placa de vidro com padrão SU-8 (molde mestre) com álcool isopropílico e seque-a com gás N2 . Se as partículas brancas permanecerem durante este processo, repita o passo 7 por 5 min.

2. unidade de acionamento pneumático

  1. Camada de microcanais (camada 1)
    Nota: execute a etapa 2.1.1-2.1.2 em uma capa das emanações.
    1. Gota 200 μL de (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)- -1-Trichlorosilane em uma lamínula e coloc o em uma câmara de vácuo com o molde mestre.
    2. Aplique vácuo por 2 min na câmara e aguarde 6 h (ou durante a noite) para a silanização do molde.
    3. Misture PDMS com uma relação de peso de 10:1 (pré-polímero: agente de cura) por 5 min.
      Nota: toda a etapa subseqüente da carcaça de PDMS contem a mesma relação do peso do Prepolímero e do agente de cura (10:1).
    4. Despeje PDMS no molde mestre e Degas PDMS em uma câmara de vácuo por 30 min.
    5. Sanduíche PDMS com um pedaço de filme de transparência.
    6. Prenda o conjunto acima imprensado com uma placa de vidro, almofadas de espuma e placas de plexiglass (Figura 2a passo 4).
    7. Cure PDMS em forno a 80 ° c por 6 h.
    8. Isole a camada PDMS (camada 1) com o filme de transparência da estrutura imprensada (Figura 2a etapa 5).
    9. Ative as superfícies da camada 1 e uma placa de vidro limpa (placa de vidro 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) usando um limpador de plasma por 1 min.
      Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado.
    10. Bond Layer 1 na placa de vidro 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante 30 min.
    11. Remova o filme de transparência da camada 1.
  2. Membrana fina de PDMS (camada 2)
    1. Spin Coat não curado PDMS em um filme de transparência em 1.000 rpm por 1 min para obter uma camada PDMS de 60 μm de espessura.
    2. Parcialmente cura spin revestido PDMS (camada 2) no forno a 80 ° c por 20-30 min.
    3. Ative a camada 1 na placa de vidro 1 e na camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min.
      Nota: o tempo de limpeza do plasma pode variar com base na potência de um limpador de plasma usado.
    4. Bond a camada 2 na camada 1 e coloque-as no forno a 80 ° c durante a noite.
  3. Bloco da tubulação
    1. Coloc os tubos do metal verticalmente em um prato de Petri.
    2. Delicadamente despeje PDMS no prato para submergir cerca de 3/4 dos tubos de metal.
    3. Cure PDMS no forno a 60 ° c por 6 h (ou durante a noite).
    4. Corte um pedaço de bloco PDMS contendo um tubo de metal.
    5. Perfure um furo na camada 2 para a entrada.
    6. Ative o bloco PDMS e a camada 2 usando o limpador de plasma por 1 min.
    7. Fixe o bloco PDMS na parte de entrada da camada 2 e coloque toda a unidade de acionamento no forno a 80 ° c durante a noite.

3. alginato-condrócitos (ou talão) construções

  1. Placa de vidro amino-silanized
    1. Corte uma placa de vidro (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) em duas placas de vidro de tamanho médio (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) usando um scriber diamante.
    2. Coloque as placas de vidro em 0,2 M de cloreto de hidrogênio (HCl) e agitar suavemente (por exemplo, 55 rpm)-los durante a noite.
    3. Enxágüe as placas de vidro com diH2o.
    4. Agitar as placas de vidro em 0,1 M de hidróxido de sódio (NaOH) por 1 h a 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.
    5. Agitar as placas de vidro em 1% (v/v) 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) para 1 h em 55 rpm e enxágüe-os com diH2O.
    6. Seque as placas de vidro amino-silanized em uma capa das emanações durante a noite.
  2. Molde do gel do agarose para construções do gel do alginato
    1. Misture 5% (w/v) agarose e cloreto de cálcio 200 mM (CaCl2) em DIH2O.
    2. Ferva a solução de gel de agarose com um forno de microondas (ou uma placa quente). O tempo de ebulição varia com base no volume da solução de gel de agarose e a potência do forno de microondas (ou a temperatura da chapa quente).
    3. Despeje a solução de gel de agarose cozido em um molde de alumínio (ver Figura complementar S2), e sanduíche-lo com uma placa de vidro.
    4. Aguarde 5 min e desenforme o gel de agarose solidificado do molde de alumínio.
  3. Colheita da condrócitos da placa do crescimento
    1. Isole placas do crescimento dos membros traseiros de ratos neonatais.
    2. Coloque as placas de crescimento em 1 mL de 0,25% de colagenase por 3 h em uma incubadora a 37 ° c e 8% de dióxido de carbono (CO2), para remover a matriz extracelular (ECM).
    3. Centrifugue a amostra digerida por 5 min em 125 x g para fazer uma pelota do condrócitos e remova o sobrenadante da amostra. Aqui, 1 x g é a aceleração da gravidade.
    4. Ressuscitar a pelota do condrócitos em 1 ml de Dulbecco ' s modificou o meio da águia (DMEM).
    5. Conte o número de condrócitos no DMEM usando um contador de células.
    6. Centrifugue os condrócitos em DMEM durante 5 min a 125 x g para fazer uma pastilha de condrócitos novamente e remova o sobrenadante da amostra.
    7. Opcionalmente, ressuscitar a pelota do condrócitos nos meios de cultura do condrócitos (CCM)34 que contêm a calceína am de 2 μm, e incubar a amostra em 37 ° c por 30 minutos. Repita o passo 3.3.6 e mova para a etapa 3.3.8.
    8. Resuspend a pelota do condrócitos em um volume desejado de CCM e mantê-los na incubadora em 37 ° c e em 8% co2 antes de usar.
  4. Construções de alginato-condrócitos (ou talão) (Figura 2C)
    1. Misture 1,5% (w/v) alginato em solução salina tampão fosfato (PBS) com 5 mg/mL de sulfo-NHS, 10 mg/mL de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) cloridrato de carbodiimida (EDC).
    2. Adicione 8 x 106 condrócitos no 1 ml de solução de gel de alginato [ou adicione 3 μL de grânulos fluorescentes de 1 μm de diâmetro (542/612 nm) em 1 ml de solução de gel de alginato (0,3% (v/v))].
    3. Colocar 150 μL da solução de alginato-condrócitos (ou talão) na placa de vidro amino-silanized fabricada no passo 3,1.
    4. Cubra a solução de gel de alginato com o molde de gel de agarose por 3 min.
    5. Remova a solução excessiva do gel do alginato que transborda do molde do gel do agarose com uma lâmina de lâmina e remova o molde do gel do agarose. Então, as construções cilíndricas do alginato-chondrocyte (ou grânulo) são obtidas na placa de vidro amino-silanized.
    6. Coloc os constructos do alginato-chondrocyte na solução cross-linking (50 de milímetro CaCl2 /140 milímetro NaCl em DIH2O) por 1 minuto para uma polimerização mais adicional.

4. montagem do dispositivo (Figura 2D)

Nota: os espaçadores PDMS e os grampos impressos em 3D precisam ser preparados separadamente.

  1. Localize quatro espaçadores PDMS de 1 mm de espessura nos quatro cantos da camada 2 da unidade de acionamento.
  2. Coloque 700 μL de CCM para cobrir as câmaras de ar da camada 2.
  3. Coloque as construções de alginato-condrócitos (ou talão) na camada 2 enquanto alinha cuidadosamente as construções com as câmaras de ar.
  4. Fixe o dispositivo com grampos impressos em 3D (Figura 1C).

5. accionamento do dispositivo

  1. Conecte a tomada de uma bomba de ar (veja a tabela de materiais) com a entrada de uma válvula de solenóide com uma tubulação do silicone.
  2. Conecte a tomada da válvula de solenóide com a entrada do dispositivo montado com uma tubulação do silicone.
  3. Ligue a válvula solenóide com um gerador de função.
  4. Manipule a válvula solenóide com uma onda quadrada (por exemplo, 1 Hz) gerada pelo gerador de função.
  5. Ligue a bomba de ar para accionar o dispositivo pneumaticamente.

6. imagem latente dos condrócitos no dispositivo

Nota: para obter uma boa qualidade de imagem, condrócitos de imagem (ou grânulos fluorescentes) em gel de alginato através de placa de vidro 2 porque expandido balões PDMS e câmaras de ar pode distorcer imagens ópticas. Se um microscópio invertido é usado para a imagem latente, o dispositivo precisa de ser instalação de modo que a placa de vidro 2 enfrenta para baixo.

  1. Prepare o dispositivo com condrócitos (ou grânulos fluorescentes) como mostrado nas secções anteriores.
  2. Tome imagens z-Stack de condrócitos (ou grânulos fluorescentes) com um microscópio confocal antes e compressão, respectivamente. Escolha um tamanho z-Step com base na profundidade de campo de um sistema de imagem confocal usado.
  3. A altura dos condrócitos (ou uma construção de alginato-talão) pode ser medida com o método de processamento automático de imagem mostrado em literaturas anteriores26,35.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo mostra etapas detalhadas da fabricação do dispositivo de compressão de condrócitos microfluídico (Figura 2). O dispositivo contém uma matriz de 5 x 5 de construções cilíndricas de alginato-condrócito, e essas construções podem ser compactadas com cinco magnitudes diferentes de compressão (Figura 1, figura 3 e Figura 4). A altura do Microchannel pneumático é ao redor 90 μm, e os diâmetros do ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para testar os efeitos do estresse compressivo nos condrócitos da placa de crescimento, desenvolvemos o dispositivo de compressão microfluídico do condrócito (Figura 1) para aplicar vários níveis de estresse compressivo aos condrócitos no andaime de hidrogel de alginato para 3D cultura em formas de alta taxa de transferência. Para ajudar outros pesquisadores a adotar nosso dispositivo ou desenvolver dispositivos semelhantes, fornecemos detalhes das etapas de fabricação do dispositivo neste a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos aos Drs. Christopher Moraes e Stephen A. Morin por seu suporte para design e fabricação de dispositivos. Este estudo foi apoiado pela bioengenharia para subsídio de saúde humana da Universidade de Nebraska-Lincoln (UNL) e da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC), e Grant AR070242 da NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor e James R. talaska, da central de microscopia avançada do centro médico da Universidade de Nebraska, por fornecer assistência com microscopia confocal.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(3-aminopropil) trietoxissilano (ATPES)Sigma-Aldrich741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahidrooctil) -1-triclorosilanoUnited Chemical TechnologiesT2492-KG
Folha de arMcMaster-Carr8560K354
Bomba de arSchwarzer PrecisionSP 500 EC-LC4.5V DCUtilizamos o modelo adquirido em 2015. O design interno e o desempenho da bomba de ar (SP 500 EC-LC) mudaram no início de 2016. Além disso, o desempenho da bomba de ar mudou com o passar do tempo. Assim, a pressão do ar gerada por uma bomba de ar SP 500 EC-LC deve ser calibrada antes do uso.
Pó de alginatoFMC CorporationPronova UP MVG
Barb Conectores retos (tubo de metal)PneumadyneEB40-250
Calcein AMInvitrogenC3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Partículas fluorescentes aquosas tingidas de vermelhoThermo Fisher ScientificR0100
EDC (cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)Thermo Fisher Scientific22980
Almofada de espumaGRAINGERItem # 5GCE8
Função / Gerador de Forma de Onda ArbitráriaKeysight Technologies33210A
Ácido clorídricoFisher ChemicalA144-500
Peróxido de hidrogênioFisher BioReagentesBP2633500
Álcool isopropílicoBDH1174-4LPVWR
Lâminas de microscópioThermo Fisher Scientific22-267-013
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-001
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5KG
Fonte de alimentaçãoKeysight TechnologiesE3630A
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Hidróxido de sódioFisher ChemicalS318-1
Coletor solenóidePneumadyneMSV10-1
Válvula solenóidePneumadyneS10MM-30-12-3
Revestidor giratórioLaurell TechnologiesWS-650Mz-23NPPB
SU8 DesenvolvedorMicroChem Corp.Y020100 4000L1PE
SU8-100MicroChem Corp.Y131273 0500L1GL
SU8-5MicroChem Corp.Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)Thermo Fisher Scientific24510
Ácido sulfúricoEMD MilliporeMSX12445

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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