Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Resumo

Este método descreve a cultura das células endotélias derivadas do iPSC como 40 microvasos 3D perfundidos em uma plataforma microfluídica padronizada. Esta plataforma permite o estudo do sprouting angiogenic gradiente-conduzido em 3D, incluindo a anastomose e a estabilização dos sprouts angiogenic em uma maneira escalável e high-throughput.

Resumo

A pesquisa pré-clínica de medicamentos de doenças vasculares requer modelos in vitro de vasculatura que são alternáveis ao rastreamento de alta taxa de taxa de pagamento. No entanto, os atuais modelos de rastreamento in vitro que têm taxa de veidão suficiente têm apenas relevância fisiológica limitada, o que dificulta a tradução de achados in vitro para in vivo. Por outro lado, as plataformas de cultura celular microfluídica têm mostrado relevância fisiológica incomparável in vitro, mas muitas vezes não têm a taxa de transferência, escalabilidade e padronização necessárias. Demonstramos uma plataforma robusta para estudar a angiogênese de células endotélias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC-ECs) em um microambiente celular fisiológico relevante, incluindo perfusão e gradientes. Os iPSC-ECs são cultivados como 40 micronavios 3D perfundidos contra um andaime de colágeno-1 estampado. Após a aplicação de um gradiente de fatores angiogênicos, marcas importantes da angiogênese podem ser estudadas, incluindo a diferenciação em células de ponta e talo e a formação de lumen perfusível. A perfusão com corantes traçadores fluorescentes permite o estudo da permeabilidade durante e após a anastomose dos brotos angiogênicos. Em conclusão, este método mostra a viabilidade dos CE derivados do IPSC num ensaio angiogênico 3D padronizado e escalável que combina condições culturais fisiológicas relevantes numa plataforma que tem a robustez e a escalabilidade necessárias para serem integradas a infra-estrutura de triagem de drogas.

Introdução

Modelos in vitro desempenham um papel fundamental na descoberta e validação de novos alvos de medicamentos de doenças vasculares. No entanto, os atuais modelos de rastreamento in vitro que têm taxa de veidão suficiente têm apenas relevância fisiológica limitada^1,o que dificulta a tradução de achados in vitro para in vivo. Assim, para avançar a pesquisa pré-clínica de medicamentos vasculares, são necessários modelos in vitro de vasculatura melhorados que combinem rastreamento de alta desperalação com um microambiente celular 3D fisiologicamente relevante.

Na última década, foram feitos progressos significativos para aumentar a relevância fisiológica dos modelos in vitro de vasculatura. Em vez de cultivar células endotélias em superfícies planas, como plásticos de cultura de tecidos, as células endotélias podem ser incorporadas em andaimes 3D, como fibrina e géis de colágeno^2. Dentro dessas matrizes, as células endotélias mostram um fenótipo fisiologicamente mais relevante associado à degradação da matriz e à formação de lumen. No entanto, esses modelos só demonstram um subconjunto dos muitos processos que ocorrem durante o broto de angiogênicos como pistas importantes do microambiente celular ainda estão faltando.

As plataformas de cultura celular microfluídica são exclusivamente adequadas para aumentar ainda mais a relevância fisiológica dos modelos in vitro de vasculatura. Por exemplo, as células endotélias podem ser expostas ao estresse de cisalhamento, que é um importante estímulo biomecânico para a vasculatura. Além disso, a possibilidade de controle espacial de fluidos dentro da microfluídica permite a formação de gradientes biomoleculares^3,4,5,6. Tais gradientes desempenham um papel importante in vivo durante a formação e padronização durante a angiogênese. No entanto, enquanto as plataformas de cultura celular microfluídica têm mostrado relevância fisiológica incomparável sobre os métodos tradicionais de cultura de células 2D e 3D, muitas vezes não têm a taxa de produção necessária, escalabilidade e padronização que é necessária para o rastreamento de drogas ⁷. Além disso, muitas dessas plataformas não estão disponíveis comercialmente e exigem que os usuários finais microfabricem seus dispositivos antes de usar⁸. Isso não só requer aparelhos de fabricação e conhecimento técnico, mas também limita o nível de controle de qualidade e afeta negativamente a reprodutibilidade⁹.

Até à data, as células endotélias humanas primárias continuam a ser a fonte celular mais utilizada para modelar angiogênese in vitro¹⁰. No entanto, as células humanas primárias têm uma série de limitações que dificultam a sua aplicação de rotina em abordagens de triagem. Primeiro, há uma possibilidade limitada de ampliar e expandir as culturas derivadas de células primárias. Assim, para experimentos em larga escala, lotes de diferentes doadores precisam ser usados, o que resulta em diferenças genômicas e variações lote-a-lote. Em segundo lugar, depois de algumas passagens, as células endotélias primárias geralmente perdem propriedades relevantes quando cultivadas in vitro^11,12.

Células endotélias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC) são uma alternativa promissora: elas se assemelham a células primárias, mas com um genótipo mais estável que também é passível de edição precisa do genoma. Além disso, os iPSCs são capazes de se auto-renovar e, portanto, podem ser expandidos em quantidades quase ilimitadas, o que torna as células derivadas do iPSC uma alternativa atraente às células primárias para uso dentro dos modelos de rastreamento in vitro¹³.

Aqui, descrevemos um método para a cultura de células endotélias como microvasos 3D perfusíveis em uma plataforma padronizada de cultura microfluídica de alta taxa de taxa. A perfusão é aplicada colocando o dispositivo em uma plataforma de roqueiro, o que garante uma operação robusta e aumenta a escalabilidade do ensaio. Como os microvasos são continuamente perfundidos e expostos a um gradiente de fatores angiogênicos, o broto de angiogênico é estudado em um microambiente celular mais fisiológico relevante. Embora o protocolo seja compatível com muitas fontes diferentes de células endotélias (primárias)^14,15,nos concentramos em usar CEs derivados do iPSC humano para aumentar a padronização desse ensaio e facilitar sua integração dentro da pesquisa de medicamentos vasculares.

Protocolo

1. Preparação do dispositivo

1. Transfira a placa microfluídica de 384 poços para um capô estéril de fluxo laminar.
2. Retire a tampa e adicione 50 μL de água ou soro de soro para baixo teor de som (PBS) a cada um dos 40 poços de observação (Figura 1b,bem B2) usando um canal multicanal ou seleta repetida.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Deixe a placa com a tampa no armário estéril da cultura na temperatura ambiente (RT).

2. Prepare gel e revestimento

1. Prepare 2,5 mL de 10 μg/mL fibronectina (FN) solução de revestimento. Diluir 25 μL de 1 mg/mL solução de fibronectina em 2,5 mL de PBS Dulbecco (dPBS, cálcio e magnésio livre). Coloque a solução no banho de água a 37 °C até usar.
2. Prepare 100 μL de solução de colágeno-1. Adicione 10 μL de HEPES (1 M) a 10 μL de NaHCO₃ (37 g/L) e misture por pipetting. Coloque o tubo no gelo e adicione 80 μL de colágeno-1 (5 mg/mL) para produzir uma concentração neutralizada de colágeno-1 de 4 mg/mL. Use uma pipeta para misturar com cuidado e evitar a formação de bolhas.
3. Adicione 1,5 μL de solução de colágeno-1 (4 mg/mL) à inseto de gel de cada unidade microfluídica (Figura 1b,bem B1). Certifique-se de que a gota de gel é colocada no meio de cada poço para que o gel entre no canal (veja a Figura 2a).
   Nota: Os Guias de Fase impedem o preenchimento dos canais adjacentes e permitem o padrão de gel. O carregamento correto do gel pode ser confirmado um microscópio do brightfield observando a formação do menisco através da janela de observação (poço B2) ou lanç a placa de cabeça para baixo. Se o gel não preencher completamente o canal, uma gota adicional de 1 μL pode ser adicionado.
4. Coloque a placa microfluídica em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂₎por 10 min para polimerizar o colágeno-1.
   Nota: O momento da polimerização é crucial; Devido aos baixos volumes utilizados na microfluídica, a evaporação já pode ser observada após 15 min de incubação, o que resulta em colapso ou encolhimento de gel.
5. Tire a placa da incubadora e transfira para um capuz estéril de fluxo laminar.
6. Adicione 50 μL de 10 μg/mL Solução de revestimento FN para o poço de saída do canal de perfusão superior de cada unidade microfluídica (Figura 1b, bem A3). Pressione a ponta da pipeta contra o lado do poço para o preenchimento correto do poço sem prender bolhas de ar (ver Figura 2b). O canal deve preencher, eo líquido deve fixar na tomada (bem C1) sem preencher bem a saída.
7. Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% CO₂₎por pelo menos 2 dias.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, como o gel de colágeno-1, juntamente com a mistura de revestimento é estável por pelo menos 5 dias na incubadora. Se a mistura de revestimento for atualizada, períodos mais longos podem ser possíveis, mas isso não foi testado. Crucial é o nível de revestimento de FN, pois isso impede a desidratação do gel de colágeno-1.

3. Cultura da semeadura/microembarcação da pilha

1. Adicione 5 mL de soro de bezerro fetal e 2,5 mL de caneta / estreptococo a 500 mL de meio de cultura de células endoteliis basais e filtre esterilizar usando um filtro de topo de garrafa com 0,22 μm tamanho poros. Este meio é agora referido como meio basal.
2. Prepare o meio de crescimento vascular: Adicione 3 μL de 50 μg/mL fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e 2 μL de 20 μg/mL fatores básicos de crescimento do fibroblasto (bFGF) a 5 mL de meio basal.
3. Descongele os iPSC-ECcongelados congelados rapidamente (<1 min) em um banho de 37 °Cwater e transfira para um tubo de 15 mL e diluir em 10 mL de meio basal.
4. Conte as células.
   Nota: Um único frasco contém 1 milhão de células em 0,5 mL com viabilidade >90%.
5. Centrífuga do tubo a 100 x g por 5 min. Aspirate supernatant sem perturbar a pelota celular e resuspender em meio basal para produzir uma concentração de 2 x 10⁷ células / mL.
6. Transfira a placa microfluídica de 384 poços da incubadora para um capô estéril de fluxo laminar.
7. Solução de revestimento De FN aspirada a partir da inseto de perfusão (bem A1). Adicione 25 μL de médio basal nos poços de inseto (bem A1).
8. Adicione uma gota de 1 μL de suspensão celular a cada poço de perfusão superior(Figura 1b,bem A1). A gota deve achatar em poucos segundos (ver Figura 3a,b para uma ilustração deste método de "bombeamento passivo").
   NOTA: Verifique um microscópio se a semeade é homogênea. Se não, adicione mais 1 μL na tomada e espere até que a gota achate.
9. Incubar a placa microfluídica bem para 1 h a 37 °C, 5% CO₂. Depois disso, as células deveriam ter aderido. Se não, espere mais 30 min.
10. Retire o meio basal dos poços de perfusão superiores (Figura 1b,bem A3). Adicione o meio morno da cultura da embarcação na entrada e na tomada superiors da perfusão(figura 1b,poços A1 e A3). Coloque a placa na plataforma rocker (definida em ângulo de 7°, intervalo de balanço de 8 min) na incubadora (37 °C, 5% CO_2).
11. Imagem da placa usando um microscópio de campo brilhante com estágio automatizado no dia 1 e 2 pós-semeadura para confirmar a viabilidade celular. Após 2 dias, um monolayer do confluent deve ter dado forma de encontro ao andaime do colagen-1.
    Nota: Se os canais não parecem ser igualmente confluentes, os micronavios podem ser cultivados por mais 24 h.

4. Estudo Sprouting angiogênico incluindo formação de células de ponta e talo

1. Prepare 4,5 mL de médio angiogênico de brotos, complementando médio basal com 4,5 μL de estoque VEGF (50 μg/mL), 4,5 μL de phorbol 12-myristate-13-acetato (PMA) (2 μg/mL estoque), e 2,25 μL de esfingosina-1-fosfato (S1P) (1M).
2. Prepare 8,5 mL de médio de crescimento de embarcações (médio basal complementado com 30 ng/mL VEGF e 20 ng/mL bFGF).
3. Aspirate médio dos poços e adicionar 50 μL de meio de cultura de embarcações frescas na entrada de perfusão superior e poços de tomada e entrada de gel e poços de saída (Figura 1b, poços A1, A3, B1 e B3).
4. Adicione 50 μL de mistura de broto santígeno a cada uma das inseções de canal de perfusão inferior e poços de tomada (Figura 1b, poços C1 e C3).
5. Coloque o dispositivo de volta na incubadora (37 °C, 5% CO₂₎na plataforma rocker, a fim de formar um gradiente de fatores de crescimento angiogênico.
6. Imagem 1 dia e 2 dias após a adição dos fatores de crescimento angiogênicos usando um microscópio de campo brilhante com estágio automatizado.
   Nota: Continue a cultivar os microvasos para estudar anastomose (vá para a seção 5) ou corrigir e manchar os microvasos para quantificar o comprimento de brotação e morfologia no dia 2 e dia 6 (vá para a seção 6).

5. Estudo anastomose e estabilização sprout

1. Imagem usando um microscópio do brightfield com estágio automatizado.
2. Adicione 1 μL de albumina fluorescente rotulada (0,5 mg/mL) à enseada de perfusão superior (Figura 1b,bem A1) e misture com uma pipeta de 50 μL.
3. Transfira a placa para um microscópio fluorescente com estágio automatizado e incubadora situada em 37 °C. Ajuste o microscópio em configurações de exposição 10x objetivas e corretas (por exemplo, tetrametilrhodamina [TRITC]-canal, 20 ms exposição). Adquirir imagens de lapso de tempo a cada minuto por 10 minutos.
4. Retire a placa do microscópio e transfira a placa para um capô estéril de fluxo laminar.
5. Retire todos os meios dos poços e substitua o meio de cultura do vaso e o meio de brotação angiogênica nos poços correspondentes (ver etapas 4.3 e 4.4).
6. Coloque o dispositivo de volta para a incubadora (37 °C, 5% CO₂₎para continuar a brotação angiogênica.
7. Repita os passos 5,1-5,6 para estudar a permeabilidade no dia 6.

6. Fixação, coloração e imagem

1. Aspirate todos os meios da cultura de todos os poços.
   Nota: Os líquidos médios ou líquidos residuais nos canais microfluídicos não influenciam a fixação devido ao seu baixo volume de 1 a 2 μL.
2. Adicione 25 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) na PBS a todas as entradas de perfusão(Figura 1b,A1 e C1) e poços de saída (Figura 1b,A3 e C3). Incubar por 10 min em RT. Coloque o dispositivo um ângulo leve (±5°) para induzir o fluxo (por exemplo, colocando um lado da placa em uma tampa).
3. Aspirate PFA dos poços. Lave todas as inletes e tomadas de perfusão duas vezes com 50 μL da solução de sal equilibrado de Hank (HBSS). Aspirar HBSS de poços.
4. Permeabilize em RT por 10 min adicionando 50 μL de 0.2% surfactant nonionic a todas as enseadas e tomadas da perfusão.
5. Aspeto o surfactante nonionic dos poços. Lave os canais de perfusão duas vezes adicionando 50 μL de HBSS a todos os poços de perfusão e saída. Aspirar HBSS de poços.
6. Manchar os núcleos usando Hoechst (1:2,000) e F-actin usando faloide (1:200) em HBSS. Prepare 2,2 mL para 40 unidades e adicione 25 μL a cada inlet e saída de perfusão bem. Coloque a placa um ângulo leve e incubar em RT por pelo menos 30 min.
7. Lave duas vezes com 50 μL de HBSS em todas as inlets e tomadas da perfusão.
8. Imagem direta usando um microscópio fluorescente com estágio automatizado ou armazenar a placa protegida da luz em 4 °C para uso posterior.

Resultados

A plataforma microfluídica de cultura de células 3D consiste em 40 unidades microfluídicas perfundidas(Figura 1a,b),que é usada para estudar brotos angiogênicos de microvasos perfundidos contra um gel de colágeno-1 estampado (Figura 1c). Estes microvasos são continuamente perfundidos e expostos a um gradiente de fatores de crescimento angiogênico (Figura 3a-d). Os brotos angiogênicos podem ser estudados 2 dias após a exposição de gradiente ou cultivados por mais de 5 dias após a exposição de gradiente para estudar anastomose e estabilização de brotos (ver linha do tempo, Figura 1d).

A semeadura dos iPSC-ECs usando o método de bombeamento passivo deve resultar em densidades homogêneas de semeadura(Figura 4a,b). A cultura perfusão contínua resultou em microvasos de confluentes em 2 dias, com as células alinhando completamente a circunferência do canal microfluídico e a formação de uma monocamada confluente contra o gel de colágeno-1 estampado.

A exposição a um gradiente de fatores angiogênicos resultou na brotosão angiogênica direcional dos microvasos dentro do gel de colágeno-1 estampado (Figura 5a-g). A formação e invasão clara de células de ponta no gel de colágeno-1 foram visíveis 24 h após a adição do gradiente angiogênico, enquanto as células de talo, incluindo a formação de lumen, eram visíveis após 48 h (Figura 5a).

Após fixação e coloração, a rede capilar pode ser visualizada usando faloide para manchar F-actin e usando Hoechst 33342 para manchar o núcleo (Figura 5b,c). Estes brotos podem ser quantificados (por exemplo, forma e comprimento^14). Sem adição de fatores de crescimento, nenhuma invasão no gel de colágeno-1 deve ser observada(Figura 5d). A imagem latente confocal foi usada para determinar o diâmetro do sprout e para confirmar a formação do lumen(figura 5e-g).

Os brotos continuam a crescer em direção ao gradiente e atingem o canal de perfusão oposto dentro de 3 a 4 dias após a adição de fatores de crescimento angiogênico. Isso resulta na remodelação da rede vascular, com clara redução no número de brotos angiogênicos(Figura 6a). A formação de Lumen foi avaliada por perfusão da rede vascular com macromoléculas fluorescentemente rotuladas (por exemplo, albumina ou dextrans). A perfusão dos microvessels com albumina etiquetada 0.5 mg/mL antes e depois da anastomose revelou uma diferença desobstruída na permeabilidade do sprout após 10 min(figura 6b-e),que sugere que os capilares se estabilizem e amadureçam após a anastomose.

Figura 1: Protocolo microfluídico de cultura celular para microvasos derivados do iPSC. (a)A parte inferior do dispositivo microfluídico da cultura da pilha é mostrada que indica as 40 unidades microfluidic que são integradas debaixo da placa de 384 poços. A vista maior exibe uma das 40 unidades microfluídicas. (b)Cada unidade microfluídica está posicionada debaixo de 9 poços com 3 poços de inseto e 3 poços de tomada. Os canais microfluídicos são separados por cumes ('phaseguides'), que permitem o padrão de hidrogéis no canal central ("canal de gel") enquanto ainda há contato com os canais adjacentes ("canais de perfusão"). (c)Método para a cultura de um micronavio perfundido dentro do dispositivo microfluídico, que é usado para estudar gradiente conduzido angiogênico brotando através de uma matriz de colágeno-1 modelado. (d)Cronograma para estudar brotos angiogênicos e/ou anastomose. Este número foi modificado a partir de van Duinen et al.¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Procedimentos de carregamento para gel e médio. (a)Exemplos de deposição de gel correta e incorreta. O arquivamento correto conduz a um gel modelado do colagen-1 na canaleta média, que é polerada subseqüentemente. (b)Exemplos de preenchimento correto e incorreto dos poços. Os poços são preenchidos na ordem de 1 a 4 para evitar a captura de bolhas de ar dentro dos canais microfluídicos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Fluxo contínuo de pressão hidrostática impulsionada e estabilização de gradiente. (a)As diferenças de pressão hidrostática entre poços resultam em nivelamento passivo e fluxo dentro dos canais microfluídicos. (b)Colocar o dispositivo em uma plataforma de roqueiros situada em 7° e 8 min o tempo de ciclo resulta em perfusão contínua e bidirecional dentro dos canais microfluídicos. (c)Gradientes são formados audacientes audantes de duas concentrações diferentes dentro dos poços, que são continuamente atualizadas pelo nivelamento passivo. (d)Visualização gradiente usando fluoresceinisisociana (FITC)-dextran. O fluxo bidirecional estabiliza o gradiente até 3 dias. Barra de escala = 200 μm. Este número foi modificado a partir de van Duinen et al.¹⁴. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Método de bombeamento passivo para a semeadura celular. (a)O bombeamento passivo é impulsionado por diferenças de pressão que são causadas por diferenças na tensão superficial. Isso resulta em um fluxo da gota (alta pressão interna) em direção ao reservatório (baixa pressão interna). (b) Lapso de tempo de uma gota (contorno cinza) que é colocado em cima da inseto (contorno branco) do canal microfluídico (contorno azul). Logo após a adição (Figura 4b, i), a gota em cima da enseada encolhe (Figura 4b, ii: 1 s após adição; iv:2 s após a adição), o que resulta em um fluxo em direção à saída. Isto continua até que o menisco da gota esteja fixado pela entrada(figura 4b, iv). Barra de escala = 400 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Brotos 3D robustos de micronavios iPSC-CE. (a)Sprouting de iPSC-EC ao longo do tempo. Microvessels foram cultivados por 48 h (direita) e, em seguida, estimulado com um coquetel angiogênico contendo 50 ng/mL VEGF, 500 nM S1P, e 2 ng/mL PMA. As primeiras células de ponta que invadem o andaime de colágeno-1 (meio) são visíveis 24 h após a exposição. Os primeiros lúmens são visíveis (setas) 48 h após a exposição (direita), enquanto as células da ponta migraram ainda mais na direção do gradiente. (b) Matriz de 15 micronavios que foram estimulados com VEGF, S1P e PMA por 2 dias e manchados para F-actin (amarelo) e núcleos (azul). Barra de escala = 200 μm. (c)Micronavio estimulado (controle positivo). d)Micronavio não estimulado (controle negativo). (e)A projeção máxima de um único capilar dentro do gel. (f)Mesmo que (g),mas focado no meio. A linha pontilhada indica a posição da vista ortogonal no painel g. Barras de escala (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 6: Visualização da permeabilidade angiogênica de brotos antes e depois da anastomose. (a)Anastomose com canal basal desencadeia poda e maturação de brotos angiogênicos. Closeup da cama capilar em 2, 4, 6 e 7 dias após a estimulação com fatores angiogênicos do crescimento. (b) Brotos angiogênicos após 2 dias após a adição de fatores de crescimento angiogênico. Brotos angiogênicos são formados dentro do gel, mas ainda não estão conectados ao canal de perfusão de fundo. (c)Perfusão do micronavio com 0,5 mg/mL albumina-Alexa 555 solução. Imagens fluorescentes obtidas a 0 e 10 min.(d,e)Mesmo que nos painéis b e c, mas após 7 dias de estimulação. Os brotos estão conectados ao outro lado e formaram um micronavio confluente no canal de perfusão basal. Barras de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Problema	Causa	Solução
Colágeno-1 não entra ou enche o canal completamente	Gotígeno-1 não é colocado em cima da inseto	Coloque cuidadosamente a gota em cima da inseto do canal de gel
	Volume de colágeno-1 é muito baixo	Use 1,5 μL do gel para preencher completamente o canal
	Colágeno-1 é muito viscoso	Use outro lote de colágeno-1
Colágeno-1 flui para canais de perfusão	Colágeno-1 é canalizado diretamente para a entrada do canal de gel	Coloque cuidadosamente a gota em cima da inseto do canal de gel
Colágeno-1 não é clara/ formação de fibras	O colágeno-1 não é armazenado adequadamente	Armazenar colágeno-1 a 4 °C, não congele
	NaHCO3 e HEPES não são misturados bem antes de adicionar colágeno-1	Misture cuidadosamente o NaHCO3 e HEPES por pipetting antes de adicionar o colágeno-1
Gota não encolhe usando método de bombeamento passivo	Gota adere ao lado do poço	Gota aspirada e adicione nova gota em cima da inseto
		Certifique-se de que o poço de saída está cheio de pelo menos 20 μL de médio
Não brotação é observada	Fatores de crescimento não são adicionados ou alíquos não são armazenados corretamente	Prepare o meio de brotação angiogênica fresco
	A bolha de ar bloqueia a formação de perfusão/gradiente	Remover bolhas de ar usando uma pipeta P20 ou P200
	Diferenças de volume entre poços	Volumes em todos os poços precisam ser iguais, a fim de formar um gradiente linear
Células não viáveis	Placa não colocada na plataforma roqueiro / plataforma roqueiro desligado	Certifique-se de que a plataforma rocker está em vigor e tenha o tempo/ângulo do ciclo certo (8 min/7°)
	Nenhuma perfusão possível devido à presença de bolhas de ar	Remover bolhas de ar usando uma pipeta P20 ou P200
Não há lumens são formados, as células migram como células individuais	Mistura de brotos angiogênicos foi adicionada antes de uma monocamada ser formada	Espere mais 24 h antes de adicionar os fatores de crescimento angiogênico
Grande variação na densidade de brotação	Diferenças nas densidades celulares após a semeadura	Verifique se a densidade celular é homogênea e comparável entre as unidades microfluídicas. Adicione outra gota de suspensão celular, se necessário

Tabela 1: Solução de problemas erros comuns.

Discussão

Este método descreve a cultura de 40 microvasos endoteliais perfusíveis dentro de uma plataforma robusta e escalométrica de cultura de células microfluídicas. Em comparação com os métodos tradicionais de cultura de células 2D e 3D, este método mostra como um microambiente celular fisiológico relevante que inclui gradientes e perfusão contínua pode ser combinado com a cultura de células 3D com a produção adequada para triagem Fins.

Uma das principais vantagens sobre os ensaios microfluídicos comparáveis é que este método não depende de bombas para perfusão, mas usa uma plataforma de roqueiro para induzir a perfusão contínua em todas as unidades microfluídicas simultaneamente. Isso garante que o ensaio é robusto e escalável: as placas podem ser empilhadas em uma plataforma de roqueiro. É importante ressaltar que todas as unidades microfluídicas permanecem individualmente endereçais, o que permite que esse método seja implementado no rastreamento de medicamentos, incluindo a geração de uma curva de dose-resposta. Além disso, sem uma bomba, a imagem latente e a recolocação média são distante mais simples com menos risco de (cruz)-contaminação.

Outra vantagem deste método é o uso de uma plataforma padronizada e pré-fabricada, enquanto plataformas de cultura de células microfluídicas comparáveis precisam ser fabricadas pelos usuários finais. Essa disponibilidade facilita a adoção desse ensaio entre outros grupos de pesquisa acadêmica e farmacêutica, levando à padronização. Além disso, ao contrário dos protótipos microfluídicos, a interface de placa de 384 poços garante compatibilidade com o equipamento de laboratório atual (por exemplo, aspiradores, manipuladores de placas e pipetas multicanal), facilitando a integração dentro da atual infraestrutura de triagem .

Há vários passos críticos na realização deste ensaio. O gel de colágeno-1 deve preencher completamente o canal de gel. Durante o carregamento do gel, este enchimento pode ser observado inspecionando as canaletas microfluidic através da janela de observação(figura 2a)ou lanç a placa de cabeça para baixo (como mostrado na figura 1a). Durante o enchimento, o gel de colágeno deve permanecer no canal central, sem fluir para os canais de perfusão adjacentes. Notamos que a qualidade do gel de colágeno-1 é crucial para o desempenho adequado do ensaio. Os lotes de colágeno-1 com viscosidade demasiado elevada conduzirão ao enchimento incompleto da canaleta do gel. Após 10 min de polimerização a 37 °C, o gel deve ser homogêneo e claro. Se o colágeno-1 não for armazenado adequadamente (por exemplo, devido à flutuação das temperaturas na geladeira), o colágeno polimerizará dentro dos canais com formação de fibraclaramente visível. Isso pode resultar na invasão das CEs no gel sem adição de fatores angiogênicos, mas sem o desenvolvimento adequado lumen.

Quando as células são semeadas, a solução de revestimento de fibronectina é removida dos poços, deixando apenas os canais microfluídicos cheios de solução de revestimento. A aspiração da solução de revestimento de canais microfluídicos pode causar perturbação do gel ou aspiração de gel. A suspensão celular precisa substituir/deslocar essa solução de revestimento. Isso funciona melhor quando a suspensão celular é semeada usando o método de bombeamento passivo, como diretamente pipetting a suspensão celular nos canais mostram densidades de semeadura menos reproduzíveis.

Como as microembarcações formam uma monocamada estável contra o gel, essas pequenas diferenças só resultam em tempos diferentes necessários para alcançar a confluência. Assim, o ponto de partida do ensaio é determinado pela confluência um pouco do que o tempo da cultura. Se necessário, o tempo de cultivo pode ser estendido até que um monolayer desobstruído esteja dado forma de encontro ao gel.

Dentro dos poços, bolhas de ar podem ser presas pelo preenchimento incorreto dos poços (ver Figura 2b). Essas bolhas de ar restringirão o fluxo de médio, mesmo quando o dispositivo é colocado em uma plataforma de roqueiro, e resultarão em colapso do micronavio e formação de gradiente inadequado. Pressionar a ponta da pipeta de encontro à parede lateral dos poços aumentará o sucesso completamente de encher o poço. Se uma bolha de ar é prendida dentro dos poços, pode ser removida delicadamente introduzindo uma ponta estéril da pipeta na parte inferior de vidro. Bolhas de ar também podem ocorrer dentro dos canais microfluídicos. Quando o meio foi removido dos poços, a evaporação do meio é perceptível a partir dos canais microfluídicos após 30 min (devido aos volumes de microlitros dentro dos canais). Assim, as mudanças médias são realizadas de preferência o mais rápido possível. Quando o meio é adicionado em um canal com meio evaporado, bolhas de ar serão presas dentro dos canais microfluídicos. Estas bolhas de ar dentro dos canais microfluídicos podem ser removidas manualmente, colocando uma pipeta P20 diretamente na enseada ou na tomada e forçando o meio através da microfluídica do poço oposto. Remoção bem sucedida das bolhas de ar resulta em uma diminuição pequena, mas perceptível no volume no outro bem. A Tabela 1 lista erros comuns e como solucioná-los.

A falta de uma bomba é uma limitação quando a imagem contínua é necessária, como a plataforma roqueiro limita o usuário à imagem em intervalos de tempo sequencial. Além disso, a perfusão de médio nesta plataforma consiste no fluxo bidirecional com baixos níveis de estresse cisalhamento, enquanto vasculatura in vivo é exposta ao fluxo unidirecional com níveis mais elevados de estresse cisalhamento. Embora não observemos efeitos negativos do fluxo bidirecional no que diz respeito ao brotogâmico angiogênico, o fluxo é um importante estímulo biomecânico e controlado preferencialmente. No entanto, embora existam configurações de bomba comercialmente disponíveis, interfigurar com a placa de 384 poços permanece desafiador e configurações de bomba dificultam severamente a escalabilidade deste ensaio.

A possibilidade de usar iPSC-ECs para estudar brotos angiogênicos abre novas oportunidades na modelagem de doenças e pesquisa de medicamentos. Em contraste com os ECs primários, essas células podem ser geradas em quantidades quase ilimitadas com um genótipo estável e usando técnicas de edição do genoma, as células podem ser geradas que, incluindo nocautes genéticos e knock-ins. No entanto, como os protocolos para diferenciar as ECs do iPSC são relativamente novos, ainda não está claro o que leva aos iPSC-ECs que melhor refletem os ECs primários e quais subtipos de CE são ou podem ser gerados. Além disso, ainda há questões sobre sua relevância. Por exemplo, os iPSC-ECs ainda exibem a plasticidade que é típica para as células endotélias? E até que ponto as células derivadas do iPSC respondem e interagem com seu microambiente celular? A plataforma padronizada aqui apresentada poderia ser usada para responder a algumas dessas perguntas, a fim de validar ainda mais o uso de CEs derivados do iPSC in vitro.

A direção futura mais direta para este ensaio será a integração de outros tipos de células que desempenham um papel importante durante a angiogênese, como pericitos e macrófagos. Isso facilitará a capacidade de estudar o papel dos macrófagos durante a anastomose entre brotos ou a adesão de pericitos após a formação capilar. Além disso, é possível cultura de vários outros tipos de células dentro ou contra uma matriz extracelular (por exemplo, temos mostrado a cultura dos neurônios e várias estruturas epiteliais, como tubulos proximais e intestinos delgados), que podem ser combinados com o vascular leitos gerados usando este método. Finalmente, será interessante estudar o broto de angiogênicos em hidrogéis sintéticos, pois sua composição definida aumenta ainda mais a padronização do ensaio e permite o ajuste de rigidez e motivos vinculativos que afetam as interações entre células e matrizes.

Em conclusão, este método mostra a viabilidade dos CE derivados do IPSC num ensaio angiogênico 3D padronizado e escalável que combina condições culturais fisiológicas relevantes numa plataforma que tem a robustez e a escalabilidade necessárias para serem integradas a infra-estrutura de triagem de drogas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,2-10 μ L Pipeta repetidora eletrônica	Sigma	Z654566-1EA
1 M HEPES	Gibco	15630-056
3 vias OrganoPlate	Mimetas	4003-400B
4% PFA em PBS	Alfa Aesar	J61899
Meio de cultura basal	NCardia
Collagen-1	Cultrex	3447-020-01
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL	VWR	613-2071
dPBS	Gibco	14190-094
Eppendorf Repeater M4 pieptte	VWR	613-2890
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F4759-1MG	1 mg/mL em água milliQ
HBSS	Gibco	14025-050
Hoechst	Molecular Probes	H3569	10 mg/mL solução em células
endoteliais derivadas de iPSC	em água NCardia
NaHCO3	Sigma	S5761	37 g/L em água miliQ
Balancim de Perfusão de Placas OrganoQ Mini	Mimetas		Plataforma de balancim usada para fornecer fluxo
Pen/Strep	Sigma	P4333
Faloidina	Sigma	P1951	1 mg/mL em DMSO
PMA	Foco-Biomoléculas	10-2165	2 μ g/mL em PBS contendo 0,1% de DMSO
S1P	Ecehelon Biosciences	S-2000	1 mM em metanol contendo 1% de ácido acético
TRITC-albumina	Invitrogen	A34786
VEGF	Peprotech	450-32-10	50 μ g/mL em água contendo 0,1% de BSA